脫落細(xì)胞DNA的提取和檢驗(yàn)2例

張輝，高林林，王波

（1.舟山市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江舟山 316021；2.杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江杭州 310004）

脫落細(xì)胞DNA的提取和檢驗(yàn)2例

張輝1，高林林2，王波1

（1.舟山市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江舟山 316021；2.杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江杭州 310004）

法醫(yī)遺傳學(xué)；基因分型技術(shù)；QIAcube純化法；脫落細(xì)胞

1 案例

1.1 簡(jiǎn)要案情

案例1：某市發(fā)生一起入室盜竊案件，現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)確定為1人作案，案犯攀爬跳窗進(jìn)入室內(nèi)，其跳落的地面存在明顯腳印，腳印附近散落了少量白色粉塵狀顆粒，提取該檢材進(jìn)行DNA檢驗(yàn)。

案例2：某機(jī)關(guān)辦公室發(fā)生一起保險(xiǎn)箱被撬案件，結(jié)合視頻確定為1人作案。提取保險(xiǎn)箱所在地附近的粉塵狀檢材進(jìn)行DNA檢驗(yàn)。

1.2 提取和檢驗(yàn)過(guò)程

上述兩案例均使用脫落細(xì)胞提取儀（公安部物證鑒定中心）收集生物檢材，吸頭在選定的范圍內(nèi)滑動(dòng)吸取脫落細(xì)胞約20s。案例1中吸取的范圍是鞋印周?chē)? cm的地面面積，案例2中吸取的范圍是以撬鎖位置為中心、半徑為20 cm的地面面積。吸取后把濾膜的第二、三層分別放入2.0mL套管（德國(guó)QIAGEN公司）中，用QIAamp?DNA Investigator試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）提取，每管加入裂解緩沖液ATL 300 μL，蛋白酶K 20 μL，保證檢材完全浸沒(méi)，充分振蕩混勻，56℃保溫1 h，期間振蕩1次，以離心半徑6 cm，13 000 r/min，離心5 min，取出套管得到備檢液體。將液體放入QIAcube全自動(dòng)核酸提取儀（德國(guó)QIAGEN公司），洗脫體積設(shè)置為20 μL，操作步驟參考儀器說(shuō)明書(shū)。模板DNA使用Identifiler?Plus試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），在9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL，模板DNA 8μL，29個(gè)循環(huán)，操作按試劑盒和儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在3500xl基因分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.3 檢驗(yàn)結(jié)果

兩起案例的第二層濾膜均得到了15個(gè)STR基因座的分型結(jié)果，其中10個(gè)基因座檢見(jiàn)3個(gè)等位基因峰，主次峰的面積比值大于4∶1，第三層濾膜獲得的圖譜中單個(gè)基因座檢見(jiàn)1或2個(gè)等位基因峰，峰高差小于20%，部分基因座缺失。聯(lián)合兩層濾膜的圖譜結(jié)果進(jìn)行分析，推斷出嫌疑人可能的STR基因型（表1），輸入全國(guó)公安機(jī)關(guān)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，均比中了犯罪前科人員，經(jīng)偵查符合案情。

表1 兩起案例的STR分型結(jié)果

2 討論

在作案過(guò)程中，嫌疑人可能在現(xiàn)場(chǎng)留下痕跡，如何從中獲取有效的信息是勘驗(yàn)工作的重點(diǎn)。檢驗(yàn)微量DNA的關(guān)鍵在于能否收集到足夠的DNA和消除影響PCR的抑制劑[1]，科學(xué)的提取方法與合適的檢驗(yàn)策略尤為重要。

負(fù)壓吸附法通常用于質(zhì)軟、粗糙、易滲透載體上DNA的提取，本文兩案例的客體較光滑，但需要提取的面積很大，考慮其表面較潔凈，嘗試用負(fù)壓吸附法能集中靶細(xì)胞并減少載體體積，有利于后續(xù)檢驗(yàn)。

QIAcube全自動(dòng)核酸提取儀配合QIAamp?DNA Investigator試劑盒使用，特制的硅膠膜既能與DNA特異性結(jié)合，又能濾去大顆粒雜質(zhì)與可溶性PCR抑制物，用小體積ATE緩沖液洗脫，可以得到不含蛋白質(zhì)、核酸酶和抑制劑的DNA濃縮液，有利于下游的PCR擴(kuò)增[2]。

根據(jù)濾膜的結(jié)構(gòu)，第一層能夠去除大部分雜質(zhì)，第三層相對(duì)干凈，但細(xì)胞數(shù)經(jīng)過(guò)層層過(guò)濾已大大減少，第二層提取到的DNA最接近需求。為了客觀統(tǒng)計(jì)，我們核查第二、三層的圖譜，第三層譜圖出現(xiàn)雙峰時(shí)峰面積相近，可視作單人圖譜或者2個(gè)均為單STR峰的人混合，結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)已知人員分型和單人作案的條件，能夠排除混合。第二層圖譜的部分基因座為混合型，其主次峰面積比值大于4∶1，根據(jù)苑美青等[3]總結(jié)的方法拆分混合樣本，可以推斷出最具價(jià)值的STR分型。

本文兩起案例能夠成功檢驗(yàn)，筆者總結(jié)出幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)，供同行參考：（1）針對(duì)原始現(xiàn)場(chǎng)尚未遭到破壞，客體表面潔凈的載體適用于此法。（2）要準(zhǔn)確判斷提取范圍，盲目擴(kuò)大吸取的范圍不但不能增加靶細(xì)胞的數(shù)量反而容易增加外源性污染和抑制物。（3）使用離心套管過(guò)濾雜質(zhì)，減少換管對(duì)DNA的損耗。（4）采用硅膠膜法提取純化，適當(dāng)增加ATL裂解液，有利于充分裂解細(xì)胞；縮小洗脫體積，有利于濃縮模板DNA。（5）選用抗抑制能力強(qiáng)的擴(kuò)增試劑盒，采用大體系平行擴(kuò)增，可保證圖譜的均衡性；適當(dāng)增加擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和模板濃度，可提高檢測(cè)靈敏度。（6）聯(lián)合分析兩層濾膜的分型，結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際情況，根據(jù)平行擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分型，盡量避免等位基因的誤判。

[1]Gill P，Whitaker J，F(xiàn)laxman C，et al.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA[J].Forensic Sci Int，2000，112（1）：17-40.

[2]廖長(zhǎng)青，成靜，劉維.Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗(yàn)中的比較[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（2）：148-149.

[3]苑美青，李萬(wàn)水，康艷榮，等.混合樣本拆分查詢(xún)犯罪嫌疑人的應(yīng)用研究[J].刑事技術(shù)，2012，（6）：5-7，12.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.033

1004-5619（2017）01-0106-02

2015-10-19）

（本文編輯：李莉）

張輝（1978—），女，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證DNA檢驗(yàn)及研究應(yīng)用；E-mail：zscoco2002@163.com