大鼠死后肌肉電導(dǎo)率與腐敗程度的關(guān)系

夏志遠(yuǎn)，翟仙敦，劉蓓蓓，鄭哲，趙琳琳，莫耀南

（河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003）

大鼠死后肌肉電導(dǎo)率與腐敗程度的關(guān)系

夏志遠(yuǎn)，翟仙敦，劉蓓蓓，鄭哲，趙琳琳，莫耀南

（河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003）

目的分析大鼠死后肌肉電導(dǎo)率（electrical conductivity，EC）、肉類食品腐敗程度指標(biāo)揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）與死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）的關(guān)系，探討EC作為尸體肌肉腐敗程度評(píng)價(jià)指標(biāo)的可行性，為該法用于PMI推斷奠定理論基礎(chǔ)。方法健康SD大鼠頸椎脫臼處死后，保存在28℃環(huán)境中，于死后不同時(shí)間點(diǎn)提取大鼠后肢肌肉組織，用去離子水制成質(zhì)量濃度為0.1g/mL的肌肉浸漬液，并測(cè)量所得浸漬液的EC值和TVB-N含量。分析EC（x1）與TVB-N（x2）的相關(guān)性，建立二者關(guān)系的回歸方程；分析兩指標(biāo)與PMI的相關(guān)性，并分別建立兩指標(biāo)與PMI（y）關(guān)系的回歸方程。結(jié)果肌肉浸漬液EC、TVB-N隨PMI的變化曲線走勢(shì)基本相同；EC與TVB-N呈顯著直線正相關(guān)，回歸方程為x2=0.14x1-164.91（R2=0.982）；EC、TVB-N與PMI顯著相關(guān)，回歸方程分別為結(jié)論大鼠死后肌肉EC與TVB-N變化趨勢(shì)一致，可以作為反映尸體肌肉腐敗程度的指標(biāo)，為腐敗尸體PMI推斷的相關(guān)研究提供方法。

法醫(yī)病理學(xué)；腐敗程度；肌，骨骼；電導(dǎo)率；揮發(fā)性鹽基氮；死亡時(shí)間；大鼠

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷是法醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)問題，尋找客觀、精準(zhǔn)且便于在實(shí)踐中推廣的方法一直是法醫(yī)學(xué)者的重要任務(wù)。目前，通過蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的變化規(guī)律，光譜技術(shù)以及昆蟲在尸體上的生長規(guī)律等來推斷PMI是當(dāng)前的熱點(diǎn)研究方法[1]。然而，尸體死后變化復(fù)雜，各種方法均有其局限性，且大多數(shù)方法都處于理論研究階段，尋求新的PMI推斷方法具有重要意義。

隨著“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的滲透，引進(jìn)其他學(xué)科成熟的技術(shù)手段來解決法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的問題是一種思路。食品科學(xué)對(duì)于肉類品質(zhì)的研究已經(jīng)有近百年歷史，目前已有可用于評(píng)價(jià)肉類新鮮程度和貨架期的指標(biāo)。其中，揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）是肉制品中各種蛋白質(zhì)在細(xì)菌和酶的作用下產(chǎn)生的一組堿性含氮物質(zhì)，因而與肉制品腐敗程度有著明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系[2，3]。TVB-N的經(jīng)典測(cè)定方法為凱氏定氮法，該方法具有較高的精準(zhǔn)度，因而早已應(yīng)用于食品科學(xué)不同肉類腐敗程度的評(píng)定[4-7]；此外，TVB-N也是我國國家標(biāo)準(zhǔn)中唯一用于評(píng)價(jià)肉類食品新鮮程度的理化指標(biāo)[8]。然而，TVB-N的測(cè)定耗時(shí)且技術(shù)要求較高，不利于在實(shí)踐中推廣。食品科學(xué)領(lǐng)域?qū)W者在尋找快速準(zhǔn)確測(cè)定肉類腐敗程度和貨架期指標(biāo)的過程中，發(fā)現(xiàn)不同種肉類浸漬液電導(dǎo)率（electrical conductivity，EC）與TVB-N具有良好的線性關(guān)系，浸漬液EC測(cè)定方法簡單、快速，有利于在實(shí)踐中進(jìn)行[9-11]。

但是，食品科學(xué)研究的對(duì)象僅限于肉眼無法辨別是否變質(zhì)的肉類樣本，而法醫(yī)學(xué)的研究對(duì)象既可能是輕度腐敗尸體，也可能是高度腐敗尸體，因此食品科學(xué)EC和TVB-N的測(cè)定方法無法直接應(yīng)用于尸體肌肉腐敗程度的測(cè)定。在前期研究[12，13]中，本課題組分別建立了適用于不同腐敗程度尸體肌肉的EC和TVBN測(cè)定方法。本研究擬將大鼠尸體放置恒溫環(huán)境，于死后不同時(shí)間段取樣并測(cè)定樣本的EC值和TVB-N含量。在此基礎(chǔ)上，分析EC、TVB-N和PMI兩兩之間的關(guān)系，最終探討EC作為尸體肌肉腐敗程度評(píng)價(jià)指標(biāo)的可行性及其在PMI推斷研究中的意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

DDS-11A微機(jī)型精密電導(dǎo)率儀（杭州奇威儀器有限公司），DV215CD電子天平（美國OHAUS公司），Milli-Q Biocel A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），半微量凱氏定氮裝置（上海滿賢經(jīng)貿(mào)有限公司），0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液（深圳市拓成科技有限公司），氧化鎂、硼酸（國產(chǎn)分析純）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

SD雌性大鼠66只（洛陽市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供），體質(zhì)量（290±20）g，隨機(jī)分成11組，每組6只，麻醉后頸椎脫臼處死，以仰臥位放入泡沫箱內(nèi)，用透氣良好的絲綢封住箱口以防止昆蟲干擾。將封好的泡沫箱放置于室內(nèi)28℃空調(diào)環(huán)境中保存。在死后即刻（0 d）和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d共11個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取一組大鼠用于制備肌肉浸漬液。

1.2.2 肌肉浸漬液的制備

提取每只大鼠后肢肌肉5g移入研缽中剪碎，加入50mL超純水，用剪刀邊攪拌邊將組織剪成勻漿，30min后將液體過濾，所得濾液即為質(zhì)量濃度為0.1g/mL的肌肉浸漬液。

1.2.3 EC值的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)室溫度計(jì)（煤油型）測(cè)定肌肉浸漬液實(shí)際溫度，調(diào)整電導(dǎo)率儀顯示溫度，使之與浸漬液溫度相同。將電導(dǎo)率儀探頭浸沒在浸漬液中，儀器按照2%/℃進(jìn)行溫度補(bǔ)償，所測(cè)得值（25℃）即為肌肉浸漬液的EC值[12]。

1.2.4 TVB-N含量的測(cè)定

TVB-N測(cè)定依次包括蒸餾、吸收、滴定和計(jì)算4個(gè)過程。其中蒸餾、吸收和計(jì)算過程主要參照國家標(biāo)準(zhǔn)[8]，滴定過程參考Xia等[13]的TVB-N電導(dǎo)滴定法，以下為TVB-N主要操作過程。蒸餾與吸收：5mL浸漬液和20mL氧化鎂（40mg/L）移入蒸餾管中蒸餾，蒸汽經(jīng)過冷凝后，被50mL硼酸（20mg/L）吸收。滴定：將電導(dǎo)率儀探頭浸沒在上述硼酸吸收液中，使用量程為100μL的移液槍，以每次50μL體積向吸收液中移加0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)酸，并記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)酸體積和對(duì)應(yīng)的EC值，當(dāng)EC值發(fā)生突變時(shí)（突然明顯增大），繼續(xù)移加5次，并記錄EC值，EC突變時(shí)即反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)。計(jì)算：參照國家標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以mg/100g表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8軟件（美國OriginLab公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以EC（x1）為自變量，TVB-N（x2）為因變量，建立兩指標(biāo)關(guān)系的回歸方程。以EC（x1）、TVB-N（x2）為自變量，PMI（y）為因變量，分別建立PMI與EC、TVB-N兩因素關(guān)系的回歸方程。

2 結(jié)果

EC、TVB-N隨PMI的變化結(jié)果見表1，兩指標(biāo)整體變化趨勢(shì)基本一致。EC和TVB-N隨PMI變化規(guī)律顯示，在28℃左右，尸體的腐敗大致可以分為三個(gè)階段：腐敗早期（1 d內(nèi)），兩指標(biāo)有所增加，但變化不明顯，肌肉EC日平均增長速度約為200 μs/cm，而TVB-N日平均增長速度約為10 mg/100 g；快速腐敗期（2～4 d），兩指標(biāo)迅速上漲，肌肉EC由（1 459.33± 195.01）μs/cm增加到（4 618.33±1 069.12）μs/cm，日平均增長速度約為1 000μs/cm，TVB-N則由（29.87± 29.35）mg/100 g增加到（469.00±169.57）mg/100 g，日平均增長速度約為150mg/100g；緩慢腐敗期（5～10d），兩指標(biāo)增長速度變慢，肌肉EC日平均增加量約為350μs/cm，TVB-N日平均增加量約為50mg/100g。

表1 EC、TVB-N隨PMI的變化（n=6，±s）

表1 EC、TVB-N隨PMI的變化（n=6，±s）

PMI/dEC/（μs/cm）TVB-N/（mg/100g）01278.33±21.0118.67±2.89 11459.33±195.0129.87±29.35 22685.67±982.71212.80±139.04 34203.33±518.64382.67±88.40 44618.33±1069.12469.00±169.57 54605.00±928.37464.33±135.28 65656.67±1017.62581.00±144.61 75465.00±538.84567.00±66.11 85605.00±497.54597.33±68.39 96271.67±653.53697.67±113.19 106773.17±763.68767.67±107.51

大鼠肌肉浸漬液EC（x1）與TVB-N（x2）呈線性相關(guān)，線性回歸方程為x2=0.14x1-164.91（R2=0.982）。

EC（x1）值隨著PMI（y）的延長逐漸增加，曲線回歸方程為

TVB-N（x2）含量隨著PMI（y）的延長逐漸增加，曲線回歸方程為

3 討論

尸體死后變化復(fù)雜，尋找新的PMI推斷方法是實(shí)現(xiàn)多途徑PMI推斷的重要過程。目前，食品科學(xué)對(duì)肉類新鮮程度和貨架期的研究已經(jīng)非常成熟，利用該領(lǐng)域的成熟指標(biāo)來研究解決法醫(yī)學(xué)PMI問題，是一種新思路。EC和TVB-N均為食品科學(xué)領(lǐng)域分析肉制品中各種大分子總體降解規(guī)律的指標(biāo)。首先，TVB-N是肉類新鮮程度的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其測(cè)定結(jié)果所代表的是各類蛋白質(zhì)大分子時(shí)序性降解所產(chǎn)生的含氮產(chǎn)物的總量。因此，與研究某一種蛋白分子變化規(guī)律相比，TVB-N更能體現(xiàn)蛋白質(zhì)降解的整體變化規(guī)律。與TVB-N相似，EC的時(shí)序性增長所體現(xiàn)的是肉類組織內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等各種大分子總體降解程度的變化，具體來說，在細(xì)胞自身酶的作用下，細(xì)胞膜開始破裂，電解質(zhì)不斷流向細(xì)胞外，同時(shí)，由于細(xì)菌和酶的作用，蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等大分子逐級(jí)降解，產(chǎn)生了大量的導(dǎo)電小分子物質(zhì)，從而增加了肌肉組織的導(dǎo)電性，EC測(cè)定方法簡便、快速[14]，有利于在實(shí)踐中推廣。

然而，食品科學(xué)對(duì)于TVB-N和EC的研究僅限于早期肉眼無法明確是否變質(zhì)的肉類樣本，而本實(shí)驗(yàn)研究了TVB-N和EC是否也可用于高度腐敗尸體肌肉腐敗程度的測(cè)定。研究[15]表明，尸體腐敗進(jìn)程受環(huán)境溫度影響最大。本研究將大鼠處死后保存于28℃環(huán)境中以消除溫度的影響，同時(shí)盡可能控制大鼠的體質(zhì)量、性別，并采取相同的處死方式及保存條件，降低其他變量可能造成的影響。與人尸體相比，大鼠尸體體積較小，蠅蛆可在數(shù)天內(nèi)將其軟組織食盡，為了避免蠅蛆可能對(duì)后期取材的影響，將大鼠尸體保存于泡沫箱內(nèi)，并用透氣良好的絲綢封住箱口，從而延緩了腐敗進(jìn)程，保證了后續(xù)工作有效進(jìn)行。食品科學(xué)TVB-N測(cè)定方法復(fù)雜，如酸堿指示劑需現(xiàn)配現(xiàn)用、滴定終點(diǎn)顏色變化細(xì)微、樣本腐敗程度越大滴定所需時(shí)間越長等，致使該法不能直接用于大鼠尸體腐敗肌肉的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)肌肉浸漬液TVB-N測(cè)定過程中，采用了電導(dǎo)滴定法，即用電導(dǎo)率儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)酸堿滴定過程中離子變化過程，當(dāng)待測(cè)液體EC值突然增大時(shí)，提示反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)，從而消除了不同實(shí)驗(yàn)者由于顏色敏感度不同所造成的誤差。在肌肉浸漬液EC的測(cè)定過程中，為了保證測(cè)量的精準(zhǔn)性，將肌肉組織剪碎制成勻漿并均質(zhì)了30min，從而保證了離子充分浸漬到水中，此時(shí)肌肉浸漬液EC已達(dá)到最大值，繼續(xù)剪切攪拌，EC值不再變化。為了消除液體在不同溫度下測(cè)量EC結(jié)果的差異，本研究測(cè)定了浸漬液的實(shí)際溫度，并設(shè)置了儀器參數(shù)，使之按照補(bǔ)償系數(shù)2%/℃進(jìn)行自動(dòng)溫度補(bǔ)償，從而使測(cè)量值轉(zhuǎn)化為25℃標(biāo)準(zhǔn)溫度下測(cè)定值。

本實(shí)驗(yàn)不同PMI大鼠肌肉EC和TVB-N的研究結(jié)果表明，兩指標(biāo)均隨PMI延長而上漲，且兩曲線整體變化趨勢(shì)相同；EC與TVB-N呈高度線性相關(guān)，進(jìn)一步說明兩指標(biāo)在腐敗程度量化上的一致性。此外，兩指標(biāo)隨PMI的階段性變化與目前法醫(yī)學(xué)對(duì)尸體腐敗的大致分期以及微生物學(xué)對(duì)細(xì)菌增長曲線的分期（調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期）基本一致。而對(duì)豬肉品質(zhì)變化規(guī)律的研究[9，16]表明，豬肉EC在1 d內(nèi)有顯著變化，本實(shí)驗(yàn)大鼠肌肉EC變化結(jié)果與其有一定的差異。其可能原因?yàn)榇笫蠹∪獗砻嬗衅つw保護(hù)，不利于大鼠肌肉與環(huán)境細(xì)菌的接觸。而與Byrne等[17]對(duì)牛尸體肌肉電特性研究相比，本研究中EC的變化趨勢(shì)與其研究結(jié)果基本一致。與周睿卿等[18]家兔玻璃體液EC推斷PMI的研究相比，兩種樣本EC隨PMI變化走勢(shì)相似，但該研究認(rèn)為眼球到后期會(huì)腐敗破裂，存在玻璃體液采集困難的問題。就這一方面而言，利用肌肉EC推斷PMI更有優(yōu)勢(shì)。由上述分析可知，肌肉EC對(duì)于腐敗尸體的PMI推斷更有意義。本實(shí)驗(yàn)分析了大鼠肌肉EC和TVB-N與PMI的相關(guān)性，結(jié)果表明，大鼠死后肌肉EC與TVB-N變化規(guī)律一致，EC可以客觀、準(zhǔn)確地反映尸體肌肉腐敗程度。肌肉EC測(cè)定方法簡便、實(shí)用，可以為后續(xù)尸體腐敗與腐敗影響因素之間的具體量化研究提供方法基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]馬劍龍，陳龍.死亡時(shí)間推斷的方法學(xué)研究進(jìn)展[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（5）：478-481.

[2]Huang L，Zhao J，Chen Q，et al.Nondestructive measurement of total volatile basic nitrogen（TVB-N）in pork meat by integrating near infrared spectroscopy，computer vision and electronic nose techniques[J]. Food Chem，2014，145：228-236.

[3]劉雪云.揮發(fā)性鹽基氮檢測(cè)方法的現(xiàn)狀及研究方向[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2014，（1）：51-53.

[4]黃星奕，蔣飛燕，穆麗君，等.基于嗅覺可視化的鯧魚TVB-N預(yù)測(cè)模型[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，34（1）：38-43.

[5]賈培紅，張坤生，任云霞.TVB-N與肉品儲(chǔ)藏溫度的關(guān)系研究[J].肉類研究，2010，（8）：63-66.

[6]馬世榜，彭彥昆，徐楊，等.可見/近紅外光譜結(jié)合變量選擇方法檢測(cè)牛肉揮發(fā)性鹽基氮[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，34（1）：44-48.

[7]史智佳，田寒友，鄒昊，等.MWPLS法在羊肉中TVB-N近紅外定量分析中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2015，36（20）：218-221.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法：GB/T 5009.44—2003[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[9]楊秀娟，張曦，趙金燕，等.應(yīng)用電導(dǎo)率評(píng)價(jià)豬肉的新鮮度[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（5）：1178-1180，1191.

[10]張麗娜，羅永康，李雪，等.草魚魚肉電導(dǎo)率與鮮度指標(biāo)的相關(guān)性研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16（4）：153-157.

[11]周冬香，陳椒，徐朝霞，等.電導(dǎo)法快速檢測(cè)淡水魚新鮮度的方法研究[J].食品科學(xué)，1998，19（6）：39-42.

[12]Xia Z，Zhai X，Liu B，et al.Determination of electrical conductivity of cadaver skeletal muscle：a promising method for the estimation of late postmortem interval[J].J Forensic Sci Med，2015，1（1）：16-20.

[13]Xia Z，Zhai X，Liu B，et al.Conductometric titration to determine total volatile basic nitrogen（TVB-N）for post-mortem interval（PMI）[J].J Forensic Leg Med，2016，44：133-137.

[14]Ekanem EO，Achinewhu SC.Effects of shucking method on opening，meat yield and selected quality parameters of West African Clam，Galatea paradoxa（Born）[J].J Food Process Pres，2000，24（5）：365-377.

[15]Vass AA.The elusive universal post-mortem interval formula[J].Forensic Sci Int，2011，204（1-3）：34-40.

[16]Oliver MA，Gispert M，Tibau J，et al.The measurement of light scattering and electrical conductivity for the prediction of PSE pig meat at various times post mortem[J].Meat Sci，1991，29（2）：141-151.

[17]Byrne CE，Troy DJ，Buckley DJ.Postmortem changes in muscle electrical properties of bovine M.longissimus dorsi and their relationship to meat quality attributes and pH fall[J].Meat Sci，2000，54（1）：23-34.

[18]周睿卿，張付，王曄，等.家兔死后玻璃體液電導(dǎo)率變化與死亡時(shí)間的關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（1）：12-14.

Relationship between Electrical Conductivity and Decomposition Rate of Rat Postmortem Skeletal Muscle

XIA Zhi-yuan,ZHAI Xian-dun,LIU Bei-bei,ZHENG Zhe,ZHAO Lin-lin,MO Yao-nan
（School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China）

ObjectiveTo analyze the relationship among electrical conductivity（EC）,total volatile basic nitrogen（TVB-N）,which is an index of decomposition rate for meat production,and postmortem interval（PMI）.To explore the feasibility of EC as an index of cadaveric skeletal muscle decomposition rate and lay the foundation for PMI estimation.MethodsHealthy Sprague-Dawley rats were sacrificed by cervical vertebrae dislocation and kept at 28℃.Muscle of rear limbs was removed at different PMI,homogenized in deionized water and then skeletal extraction liquid of mass concentration 0.1 g/mL was prepared.EC and TVB-N of extraction liquid were separately determined.The correlation between EC（x1）and TVB-N（x2）was analyzed,and their regression function was established.The relationship between PMI（y）and these two parameters were studied,and their regression functions were separately established.ResultsThe change trends of EC and TVB-N of skeletal extraction liquid at different PMI were almost the same,and there was a linear positive correlation between them.The regression equation was x2=0.14x1-164.91（R2=0.982）.EC and TVB-N of skeletal muscle changed significantly with PMI,and the regression functions were y=19.38x13-370.68x12+2526.03x1-717.06（R2=0.994）,and y=2.56x23-48.39x22+ 330.60x2-255.04（R2=0.997）,respectively.ConclusionEC and TVB-N of rat postmortem skeletal muscle show similar change trends,which can be used as an index for decomposition rate of cadaveric skeletal muscle and provide a method for further study of late PMI estimation.

forensic pathology;decomposition rate;muscle,skeletal;electrical conductivity;total volatile basic nitrogen;postmortem interval;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.004

1004-5619（2017）01-0017-04

2015-10-08）

（本文編輯：鄒冬華）

河南省基礎(chǔ)與前沿課題資助項(xiàng)目（112300410082）

夏志遠(yuǎn)（1988—），男，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：forensic-science@qq.com

莫耀南，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)臨床學(xué)研究；E-mail：forensic@haust.edu.cn