心肌缺血-致命性心動過緩血清代謝特征分析

吳嘉燕，王典，孔璟，王星星，于曉軍

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，廣東汕頭 515041）

心肌缺血-致命性心動過緩血清代謝特征分析

吳嘉燕，王典，孔璟，王星星，于曉軍

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，廣東汕頭 515041）

目的探討心肌缺血-致命性心動過緩大鼠血清代謝特征。方法制作心肌缺血-心動過緩-死亡（myocardial ischemia-bradycardia-sudden cardiac death，MI-B-SCD）大鼠模型，以假手術(shù)組為對照組，應(yīng)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測死后血清代謝譜，結(jié)合代謝組學(xué)策略分析血清代謝特征。結(jié)果MI-B-SCD大鼠血清代謝輪廓與對照差異顯著。與假手術(shù)組相比，MI-B-SCD大鼠血清賴氨酸、鳥氨酸、嘌呤、絲氨酸、丙氨酸、尿素、乳酸含量明顯升高；琥珀酸、棕櫚酸、酮己二酸、甘油醛、己烯二酸、辛二酸含量明顯下降，其中多種差異代謝物之間存在相關(guān)性。結(jié)論MI-B-SCD大鼠血清代謝顯著改變，賴氨酸與嘌呤有較高的診斷MI-B-SCD價值，可望為心源性猝死的法醫(yī)鑒定及臨床防治提供參考。

法醫(yī)病理學(xué)；心肌缺血；心動過緩；血清；代謝

心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）是潛在的心臟疾病突然發(fā)作或惡化導(dǎo)致的突然而意外的死亡[1]。我國SCD發(fā)生率為41.84/10萬，年死亡人數(shù)約54.4萬人[2]。其中，心肌缺血所致的SCD最常見。目前，對于SCD的研究多集中于心肌缺血快速型心律失常[3]，對其所致的緩慢性心律失常，特別是致死性心動過緩研究甚少。Gaul等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在既往有心血管事件的患者中，盡管發(fā)生率低于室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）或室性纖維性顫動（ventricular tachycardia/fibrillation，VF），嚴(yán)重心動過緩發(fā)生SCD的風(fēng)險明顯高于VT和VF。因此，研究心動過緩的相關(guān)機(jī)制對防治SCD具有重要意義。本研究擬在建立心肌缺血-致命緩慢性心律失常大鼠模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，結(jié)合代謝組學(xué)策略，分析其血清代謝輪廓，探討心肌缺血-致命性心動過緩代謝機(jī)制，尋找相關(guān)標(biāo)記物，為法醫(yī)學(xué)相關(guān)死因鑒定及臨床上SCD的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑

實(shí)驗(yàn)動物：成年Sprague-Dawley（SD）大鼠（12～ 16周齡，體質(zhì)量250～400 g，均為雄性），由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

主要試劑：甲醇（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、正亮氨酸（美國SIGMA-ALDRICH公司）、甲氧胺（純度98%，美國SIGMA-ALDRICH公司）、吡啶（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、二氯甲烷（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、三甲基氯硅烷（TMCS，美國SIGMA-ALDRICH公司）、三氟乙酰胺（MTBSTFA，美國REGIS TECHNOLOGIES公司）。

1.2 心肌缺血-致命性心動過緩-心源性猝死大鼠模型

心肌缺血模型根據(jù)常規(guī)冠狀動脈結(jié)扎術(shù)[5]建立，其簡要步驟如下：大鼠造模前禁食12 h，稱重、3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液（30mg/kg）腹腔注射麻醉，成功后，應(yīng)用BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電。氣管插管后，通過ALC-V8動物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司）人工通氣（呼吸頻率1∶1，潮氣量12mL）。開胸，暴露心臟，撕破心包，擠出心臟，迅速結(jié)扎冠狀動脈前降支后還納心臟，觀察心電變化70min。心電圖（ECG）顯示心肌缺血，并快速發(fā)生心動過緩-死亡大鼠歸為心肌缺血-心動過緩-心源性猝死（myocardial ischemiabradycardia-sudden cardiac death，MI-B-SCD）組。另設(shè)置假手術(shù)組作為對照，該組大鼠在開胸后，縫合針只穿過大鼠左冠狀動脈不作結(jié)扎，觀察70min后，用彎鉤按壓胸廓，擠出心臟處死。大鼠死亡或處死后取腹腔靜脈血，以離心半徑10cm，3000r/min，離心5min后，分離血清，-80℃保存待測。

依據(jù)參考文獻(xiàn)[6]診斷心動過緩，利用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件統(tǒng)計大鼠術(shù)后至發(fā)生心動過緩的時長、術(shù)后VT、VF、室性早搏（ventricular premature beat，VPB）累計時長、術(shù)前以及術(shù)后的心率（heart rate，HR），采用t檢驗(yàn)對比組內(nèi)及組間心肌缺血前后、MI-B-SCD組與假手術(shù)組術(shù)后心率，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后心率若有顯著下降，則可診斷為心動過緩。根據(jù)指南[7]，結(jié)合VT、VF、VPB累計時長計算心律失常評分，利用t檢驗(yàn)對比實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組間差異，作為心動過緩診斷的輔助證明。

1.3 血清的GC-MS檢測

取100 μL血清加入800 μL甲醇、100 μL超純水，漩渦震蕩1 min，以離心半徑10 cm，10 000 r/min，離心10 min（4℃）；取200 μL上清液至GC管，加入20 μL 0.5 mmol/L正亮氨酸（0.1 mmol/L HCl），氮?dú)獯蹈?，加?0 μL二氯甲烷，繼續(xù)吹干；加入30 μL甲氧胺/吡啶（15 mg甲氧胺/mL吡啶），密閉，室溫（20℃）震蕩16h，肟化；加入30μL MTBSTFA（含1% TMCS），密閉，漩渦1 min，20℃震蕩1 h，衍生化，取1μL上機(jī)檢測。

采用GC-MS系統(tǒng)（7890A GC系統(tǒng)與5975C單相四極桿MSD聯(lián)用，美國Agilent公司）采集數(shù)據(jù)，DB-5MS色譜柱（30m×250μm，0.25μm，5%苯交聯(lián)、95%二甲基聚硅氧烷，美國Agilent公司）。GC-MS色譜條件：進(jìn)樣口溫度230℃，脈沖無分流，柱初始溫度為60℃，保持2min，以8℃/min程序升溫至285℃，保持10min，柱流量為1.0mL/min，載氣為高純氦氣。質(zhì)譜條件：接口溫度為290℃，電離方式為標(biāo)準(zhǔn)EI源（70eV），離子源溫度為230℃，選擇質(zhì)荷比（m/z）范圍為50～600。

1.4 數(shù)據(jù)分析

GC-MS數(shù)據(jù)由ChemStation軟件進(jìn)行記錄和導(dǎo)出，轉(zhuǎn)化為CDF類型文件，通過R語言生成數(shù)據(jù)矩陣，并導(dǎo)出為Excel格式；把表格導(dǎo)入SIMCA-P軟件，進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminate analysis，PLS-DA）建模，生成得分散點(diǎn)圖，判斷總體代謝輪廓的差異，并獲得變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP），VIP大于0.75者考慮為差異顯著。同時，計算此模型X矩陣差異（R2X）、Y矩陣差異（R2Y）及預(yù)測模型差異（Q2）用于評價模型解釋率，這3個參數(shù)變化范圍為0～1，越接近1表示模型越好；置換驗(yàn)證得到所解釋的模型差異（R2）截距及所預(yù)測的模型差異（Q2）截距用以評判模型是否過擬合。

應(yīng)用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫2.0對每一譜峰所屬代謝物進(jìn)行定性。用內(nèi)標(biāo)（正亮氨酸）對峰面積進(jìn)行歸一化處理，獲得代謝物的相對含量，計算MI-B-SCD組與假手術(shù)組的變化倍數(shù)。應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)系數(shù)（r）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。利用MedCalc繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并利用此軟件計算出判斷點(diǎn)及ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC），分析差異顯著代謝的診斷價值，判斷點(diǎn)同時可作為診斷臨界點(diǎn)；利用多因素降維（multifactor dimensionality reduction，MDR）軟件進(jìn)行層次聚類分析，篩選具有較高診斷價值的代謝物及其組合。差異代謝物根據(jù)數(shù)據(jù)庫MBRole（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/）、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html），分析相關(guān)代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血致命性心動過緩心電圖特征

本研究制作了40只冠狀動脈結(jié)扎-心肌缺血模型大鼠，其中6只（15%）結(jié)扎后3min內(nèi)發(fā)生心動過緩，且無發(fā)生或僅出現(xiàn)陣發(fā)性VT或VF，直接死亡，定義為MI-B-SCD組，納入本研究；11只發(fā)生VT和VF，其余23只缺血70 min內(nèi)未發(fā)生死亡（伴有陣發(fā)性VT或VF及房室傳導(dǎo)阻滯），根據(jù)本研究目標(biāo)，將后兩者排除。另外，成功制備假手術(shù)組大鼠6只。

結(jié)扎術(shù)后，MI-B-SCD組大鼠ECG出現(xiàn)QRS波群增寬，提示心肌缺血，且在結(jié)扎后3min內(nèi)，心率均有20%～50%的下降（前后對比P＜0.05），直至死亡。假手術(shù)組大鼠術(shù)后ECG改變不明顯，出現(xiàn)偶發(fā)室性早搏（ventricular premature beat，VPB），穿針后心率均無明顯變化（P＞0.05）（圖1及表1）。

圖1 MI-B-SCD組及假手術(shù)組大鼠心電圖

表1 MI-B-SCD組及假手術(shù)組大鼠心電圖特征以及死亡原因

MI-B-SCD組術(shù)后VPB、VT、VF、VT+VF累計時長分別為（13.07±28.86）、（3.55±4.84）、（3.04±7.43）、（6.58±8.65）s，心律失常評分為1.50±1.05，術(shù)后HR為（211.00±28.51）次/min；假手術(shù)組術(shù)后VPB、VT、VF、VT+VF累計時長分別為（0.06±0.13）、（0.52±1.27）、0、（0.52±1.27）s，心律失常評分為0.50±0.84，術(shù)后HR為（342.83±18.71）次/min，兩組間術(shù)后HR差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后VPB、VT、VF累計時長以及心律失常評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 MI-B-SCD組大鼠血清代謝輪廓分析

PLS-DA模型顯示MI-B-SCD組的代謝輪廓明顯分開，該模型的R2X、R2Y及Q2值分別為0.712、0.783、0.497，經(jīng)過200次置換驗(yàn)證得到R2、Q2截距分別為0.573、-0.140，提示PLS-DA模型未過擬合（圖2）。在PLS-DA得分散點(diǎn)圖中，每一個點(diǎn)代表該份血清的總體代謝特征，圖2提示MI-B-SCD大鼠血清代謝輪廓與假手術(shù)組差異顯著。

2.3 MI-B-SCD大鼠血清差異代謝物及代謝路徑分析

本研究發(fā)現(xiàn)，多維模式6種代謝物VIP值＞0.75，包括丙氨酸、甘油醛、酮己二酸、尿素、乳酸、琥珀酸；單維模式中，通過t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)7種代謝物相對含量之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），包括賴氨酸、嘌呤、辛二酸、棕櫚酸、鳥氨酸、己稀二酸、絲氨酸（表2）。根據(jù)數(shù)據(jù)庫MBRole、KEGG，這些差異代謝物提示心肌缺血致命性心動過緩時被擾動的代謝通路包括，糖酵解、自由脂肪酸β-氧化、嘌呤核苷酸代謝、檸檬酸循環(huán)、氰基氨基酸代謝和尿素循環(huán)。

圖2 MI-B-SCD及假手術(shù)組血清代謝輪廓分析

表2 MI-B-SCD組與假手術(shù)組血清差異顯著代謝物

2.4 差異代謝物的交互分析

為了進(jìn)一步整體分析代謝物交互關(guān)系，本研究應(yīng)用SPSS 16.0軟件計算各差異代謝物之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。表3顯示尿素與乳酸、尿素與絲氨酸、絲氨酸、丙氨酸與棕櫚酸、甘油醛與酮己二酸、甘油醛與己稀二酸、辛二酸與己稀二酸、賴氨酸與嘌呤之間均存在強(qiáng)相關(guān)關(guān)系（r≥0.8），其他則均為中度相關(guān)關(guān)系（0.8＞r＞0.5）。這些結(jié)果提示了MI-B-SCD血清代謝的系統(tǒng)性改變。

2.5 差異代謝物的診斷價值分析

本研究通過分析差異代謝物，發(fā)現(xiàn)賴氨酸及嘌呤AUC均大于0. 9；鳥氨酸、乳酸、丙氨酸、絲氨酸、辛二酸、棕櫚酸和甘油醛在0.7～0.9（表2），提示其均具有較高的診斷MI-B-SCD的價值。

另外，本研究應(yīng)用MDR分析各代謝物聚類情況，以此判斷代謝物在區(qū)分MI-B-SCD大鼠與假手術(shù)組的貢獻(xiàn)。首先根據(jù)ROC分析得到判斷點(diǎn)，利用判斷點(diǎn)，生成分類列表，導(dǎo)入MDR軟件，得到層次聚類圖（圖3A），可見辛二酸、鳥氨酸、棕櫚酸、甘油醛及絲氨酸屬于一大類，其中辛二酸與鳥氨酸、甘油醛與絲氨酸位于同一級分支，對區(qū)分MI-B-SCD大鼠具有相同價值；以此類推，嘌呤、尿素和賴氨酸、琥珀酸、乳酸和丙氨酸對心動過緩的區(qū)別及假手術(shù)的診斷均具有相同價值。其中，辛二酸與鳥氨酸、甘油醛與絲氨酸、尿素與賴氨酸均在最高級分支上，提示其共同具有最高的診斷價值。

表3 特異性代謝物相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)）

圖3 差異代謝物的診斷潛能分析

3 討論

心肌缺血后代謝將首先受到影響，并可導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的后果，包括離子平衡的破壞，氧化應(yīng)激、心律失常以及心源性猝死[8]。心律失常是心肌缺血最主要、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，緩慢心律失常是其中重要的類型。從整體上了解心肌缺血-緩慢性心律失常代謝輪廓對探討相關(guān)發(fā)病機(jī)制，尋找SCD診斷或鑒定標(biāo)記物以及治療靶點(diǎn)有重要的意義。

本研究選擇血清為檢測對象考慮如下：（1）血清是體內(nèi)代謝物存儲庫，其中的代謝改變反映了一種疾病或病理生理狀態(tài)下機(jī)體總體的代謝特征；（2）血清數(shù)據(jù)易于臨床轉(zhuǎn)化；（3）可為下一步心肌相關(guān)研究提供方向。

本研究發(fā)現(xiàn)MI-B-SCD組大鼠血清代謝輪廓與假手術(shù)組差異顯著（圖2）。（1）氧化供能底物，包括兩種脂肪酸（辛二酸及棕櫚酸）均有所下降，該結(jié)果與前期類似的研究[9，10]不一致。心肌主要供能物質(zhì)是自由脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA），次要的供能物質(zhì)是葡萄糖、酮體等，在心肌缺血-心動過緩的情況下，由于“保氧原則”，心肌會偏向于糖類作為供能物質(zhì)[11]。但Folmes等[12]的研究提示在輕度缺血的情況下，心肌主要供能物質(zhì)仍然為自由脂肪酸。筆者認(rèn)為，MI-BSCD大鼠，由于缺血時間短，心臟仍處于一種輕度缺血狀態(tài)，心肌的主要供能物質(zhì)仍為脂肪酸。因此，導(dǎo)致其消耗增多，其血清中的含量下降。（2）糖酵解中間產(chǎn)物甘油醛含量下降，終產(chǎn)物乳酸的含量升高，這與前期多項(xiàng)研究[13-15]結(jié)果一致?；凇氨Ｑ踉瓌t”，心肌在缺氧條件下，偏向于耗氧量更少的無氧氧化，即糖酵解增強(qiáng)而糖的有氧氧化受抑制，而檸檬酸循環(huán)中間產(chǎn)物琥珀酸含量下降則為后者的結(jié)果。此外，在缺氧-心動過緩的條件下，ATP合成少，分解增加[16]，導(dǎo)致AMP增加，最終致血清中嘌呤含量升高。（3）丙氨酸含量明顯升高，與Yamamoto等[17]的研究結(jié)果一致。前期另一項(xiàng)研究[18]發(fā)現(xiàn)，離體心肌在低流量缺血條件下，丙氨酸主要來源于丙酮酸。這與心肌缺血-心動過緩時無氧酵解增強(qiáng)，乳酸脫氫酶活性相對不足，造成作為底物的丙酮酸過剩的事實(shí)相吻合。此外，丙氨酸是蛋白分解的重要產(chǎn)物，其含量升高也提示在心肌缺血-心動過緩時心肌蛋白分解加強(qiáng)，功能受損。（4）鳥氨酸及尿素含量明顯升高。該結(jié)果提示，心肌缺血致心動過緩時尿素循環(huán)活躍，更多的氨基酸通過無毒性的尿素實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨基，可能是心肌的一種保護(hù)機(jī)制。Shukla等[19]的研究證實(shí)了此推論，研究發(fā)現(xiàn)，在輻射誘導(dǎo)心動過緩的小鼠模型中，輻射前注射精氨酸加重心動過緩及心肌損害的程度，輻射后注射則逆轉(zhuǎn)心動過緩，保護(hù)心肌。其原因是輻射前注射精氨酸會增強(qiáng)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性，導(dǎo)致一氧化氮的合成過度及心肌損傷。輻射后注射精氨酸，則有助于提高精氨酸酶的活性，減少精氨酸往NOS途徑的代謝，增加其流向尿素循環(huán)的代謝。Nahavandi等的[20]研究也證實(shí)了抑制NOS活性可校正心動過緩。此外，賴氨酸已被證實(shí)對心臟損傷有保護(hù)作用。因此，心肌缺血-心動過緩大鼠血清賴氨酸含量明顯升高亦可能是一種保護(hù)機(jī)制?？傮w上，在缺血-心動過緩的情況下，供能底物消耗增加，糖無氧氧化加強(qiáng)，精氨酸偏向于流向尿素循環(huán)，導(dǎo)致尿素和鳥氨酸的積累，起心肌保護(hù)作用的賴氨酸明顯升高，即呈心肌能量代謝障礙、蛋白分解加強(qiáng)，轉(zhuǎn)氨活躍、心肌保護(hù)等病理生理改變。

在差異代謝物的診斷潛能方面，賴氨酸與嘌呤表現(xiàn)出診斷MI-B-SCD較大的潛能，體現(xiàn)為較大的AUC值及較高的特異性與敏感性，而且，在層次聚類圖中處于最高級。此外，鳥氨酸、乳酸、丙氨酸、絲氨酸、辛二酸、棕櫚酸和甘油醛也具有一定的診斷潛能。這些差異代謝物將為下一步大樣本篩選、確認(rèn)提供重要的方向。這些結(jié)果有望為法醫(yī)病理學(xué)死因鑒定及臨床轉(zhuǎn)化提供重要的參考。

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Metabolic Characteristics of Lethal Bradycardia Induced by Myocardial Ischemia

WU Jia-yan,WANG Dian,KONG Jing,WANG Xing-xing,YU Xiao-jun
（Department of Forensic Pathology,Medical College,Shantou University,Shantou 515041,China）

ObjectiveTo explore the metabolic characteristics of lethal bradycardia induced by myocardial ischemia in rat’s serum.MethodsA rat myocardial ischemia-bradycardia-sudden cardiac death（MI-BSCD）model was established,which was compared with the sham-operation group.The metabolic profile of postmortem serum was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）,coupled with the analysis of serum metabolic characteristics using metabolomics strategies.ResultsThe serum metabolic profiles were significantly different between the MI-B-SCD rats and the control rats.Compared to the control rats,the MI-B-SCD rats had significantly higher levels of lysine,ornithine,purine,serine,alanine, urea and lactic acid;and significantly lower levels of succinate,hexadecanoic acid,2-ketoadipic acid, glyceraldehyde,hexendioic acid and octanedioic acid in the serum.There were some correlations among different metabolites.ConclusionThere is obvious metabolic alterations in the serum of MI-B-SCD rat. Both lysine and purine have a high value in diagnosing MI-B-SCD.The results are expected to provide references for forensic and clinical applications of prevention and control of sudden cardiac death.

forensic pathology;myocardial ischemia;bradycardia;serum;metabolic

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.003

1004-5619（2017）01-0011-06

2016-04-28）

（本文編輯：鄒冬華）

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015A030313437）；廣東省科技創(chuàng)新資助項(xiàng)目（2013KJCX0076）

吳嘉燕（1990—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：184086295@qq.com

王典，男，副研究員，主要從事心源性猝死代謝組學(xué)研究；E-mail：g_dwang@stu.edu.cn