不同高度鈍力打擊致大鼠皮膚與骨骼肌挫傷的對(duì)比

百茹峰，呂小嬌，鄂曉霏，于天水，劉冉，張海東

（1.2011司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

·論著·

不同高度鈍力打擊致大鼠皮膚與骨骼肌挫傷的對(duì)比

百茹峰1，2，呂小嬌1，2，鄂曉霏1，2，于天水1，2，劉冉1，2，張海東1，2

（1.2011司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

目的探討不同高度鈍力打擊下，皮膚與骨骼肌挫傷后的修復(fù)過(guò)程差異。方法采用自主設(shè)計(jì)的自由落體打擊裝置，以打擊高度為主要損傷程度考量因素，將自由落體從15、30、50cm高度打擊造成SD大鼠下肢三種不同程度的挫傷。采用組織形態(tài)學(xué)方法觀察損傷后6h、24h、3d、7d、13d皮膚及肌肉的修復(fù)過(guò)程。結(jié)果三個(gè)打擊高度引起實(shí)驗(yàn)大鼠下肢挫傷，基本都可形成皮下組織和（或）肌肉內(nèi)的出血，在傷后24h內(nèi)修復(fù)的過(guò)程基本類(lèi)似，但表現(xiàn)程度隨打擊高度增加而明顯；15cm挫傷組在3d時(shí)出血區(qū)紅細(xì)胞已基本融解消散，而30cm挫傷組則延遲至7d；傷后13d時(shí)，15cm和30cm挫傷組表現(xiàn)基本類(lèi)似，但50cm挫傷組則仍處于增生旺盛期。結(jié)論隨著打擊高度的增加，皮膚及肌肉同時(shí)出血的比例明顯增加，挫傷后組織修復(fù)的炎癥反應(yīng)、增生反應(yīng)表現(xiàn)逐漸加重，修復(fù)的過(guò)程也出現(xiàn)相應(yīng)的延長(zhǎng)。綜合法醫(yī)學(xué)實(shí)踐應(yīng)用以及本研究結(jié)果，推薦以50cm高度所致挫傷（2.58J/cm2）作為今后挫傷損傷時(shí)間研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物參考模型。

法醫(yī)病理學(xué)；皮膚；挫傷；肌，骨骼；大鼠；損傷時(shí)間

在機(jī)械性損傷的法醫(yī)學(xué)鑒定中，尤其是對(duì)于在一定時(shí)間段內(nèi)受到多次損傷的案例，損傷時(shí)間的判定是需要重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容。在日常法醫(yī)學(xué)實(shí)踐檢案中，挫傷是一種常見(jiàn)的損傷類(lèi)型，其損傷時(shí)間的準(zhǔn)確推斷也是法醫(yī)病理學(xué)研究熱點(diǎn)之一。在既往研究中，建立動(dòng)物挫傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆椒ú⒉煌耆恢?，如止血鉗鉗夾法、不同高度自由落體打擊等[1-3]，并且未能對(duì)使用不同方法所致挫傷的損傷情況、挫傷后的組織修復(fù)基本過(guò)程如炎癥階段、增生階段等進(jìn)行詳細(xì)報(bào)道，使得應(yīng)用這些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫降膶?shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性；同時(shí)，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，亦需要針對(duì)不同程度挫傷情況采用相應(yīng)的損傷時(shí)間推斷數(shù)學(xué)模型。鑒于此，本研究采用自由落體打擊方法，對(duì)比不同打擊力量對(duì)大鼠下肢形成挫傷的損傷程度、損傷的可重復(fù)性、挫傷后的修復(fù)過(guò)程，試圖為今后挫傷的損傷時(shí)間研究探索重復(fù)性好、容易控制實(shí)施的大鼠挫傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年健康Sprague-Dawley雄性大鼠61只，體質(zhì)量350～420g（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），隨機(jī)分為15 cm、30 cm、50 cm挫傷組，每個(gè)挫傷組按傷后6h、24h、3d、7d、13d時(shí)間段進(jìn)行觀察。每個(gè)挫傷組每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)大鼠4只及正常對(duì)照組1只。

1.2 打擊裝置的構(gòu)成

本研究中的簡(jiǎn)易打擊裝置主要由3部分構(gòu)成：固定架、滑道管、打擊錘。滑道管為一50cm不銹鋼管，兩端鐵片焊接密閉，并在密閉鐵片中心鉆孔，孔的大小可容下打擊錘兩端柱形鋼，打擊錘上下兩端各焊接一柱形鋼，總質(zhì)量為500 g，放置于滑道管內(nèi)，可在上下方向自由滑動(dòng)。通過(guò)調(diào)整、固定滑道管和打擊錘的位置，使得打擊錘能夠按固定高度垂直擊打，打擊錘末端柱形鋼作為與動(dòng)物相接觸的結(jié)構(gòu)，表面為平面作為打擊面。

1.3 主要試劑

CD3兔抗大鼠多克隆抗體（標(biāo)記T淋巴細(xì)胞）、CD20小鼠抗大鼠單克隆抗體（標(biāo)記B淋巴細(xì)胞）、CD68小鼠抗大鼠單克隆抗體（標(biāo)記單核巨噬細(xì)胞）、alpha-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）小鼠抗大鼠單克隆抗體（標(biāo)記肌成纖維細(xì)胞）、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，以上抗體均購(gòu)自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）兔抗大鼠單克隆抗體（標(biāo)記中性粒細(xì)胞，英國(guó)abcam公司）；過(guò)氧化物酶封閉液、羊血清封閉液（進(jìn)口，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色濃縮試劑盒（北京Solarbio科技有限公司）。

1.4 動(dòng)物模型制備

動(dòng)物采用速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司）按0.1mL/kg在左后肢進(jìn)行肌肉注射麻醉，右后肢剪毛備皮。將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，于右小腿內(nèi)側(cè)面（距跟骨2.5 cm），分別用自由落體打擊器從15、30、50cm高度打擊致傷。按自由落體勢(shì)能計(jì)算公式（Ep=mgh）計(jì)算打擊勢(shì)能，本研究中3個(gè)挫傷組打擊的勢(shì)能分別為0.74 J、1.47 J、2.45 J。其中，15cm打擊錘末端的直徑為0.8cm（1.46J/cm2），30 cm、50 cm打擊時(shí)為了防止皮膚被撕裂，將打擊錘末端直徑增加至1.1cm（1.55J/cm2、2.58J/cm2）。

1.5 取材方法

挫傷后不予任何處理，大鼠分籠飼養(yǎng)于自由獲得飼料與水的潔凈環(huán)境中，待至預(yù)定觀察時(shí)間點(diǎn)后頸椎脫臼法處死，并立即取右后肢打擊區(qū)域皮膚與肌肉（腓腸?。瑯?biāo)本大小為1.0cm×0.6cm×0.3cm，在生理鹽水中簡(jiǎn)易清洗表面血液后，用4%多聚甲醛溶液固定。正常對(duì)照組動(dòng)物備皮后直接取材。

1.6 切片染色與觀察

HE染色：4μm切片脫蠟至水，蘇木素染色10min，1%鹽酸-乙醇分化，60℃溫水返藍(lán)，1%伊紅染色40s，自來(lái)水水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

免疫組織化學(xué)染色：4μm切片脫蠟至水，將切片浸泡在檸檬酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH=6.0）中，95℃或沸水中加熱10 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)；3%過(guò)氧化氫溶液20 min，PBS水洗，山羊血清封閉，室溫孵育10 min；直接滴加適當(dāng)比例一抗（CD3/CD20/CD68：1∶ 200；MPO：1∶ 40；ɑ-SMA：1∶1 200），4℃冰箱過(guò)夜；滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗30min；DAB顯色；染核、脫水、透明、封片。

觀察：在CX22型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）下由3名高級(jí)職稱(chēng)法醫(yī)病理學(xué)專(zhuān)家分別進(jìn)行觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 皮膚及骨骼肌挫傷后的肉眼觀察

所有實(shí)驗(yàn)大鼠均能保持皮膚完整，未出現(xiàn)撕裂創(chuàng)，三組不同高度打擊挫傷大鼠基本都可形成皮下和（或）肌肉組織的出血，具體見(jiàn)表1。50cm高度打擊時(shí)出現(xiàn)1例骨折，余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未發(fā)生骨折。大鼠右后肢被擊打后均出現(xiàn)不同程度腫脹，呈暗紅色，取材時(shí)可見(jiàn)皮膚、肌肉明顯水腫，3d后腫脹基本消退，7d后挫傷區(qū)皮膚類(lèi)似于正常對(duì)照組動(dòng)物皮膚，在50cm挫傷組中仍可見(jiàn)肌肉內(nèi)灶性出血。

表1 3個(gè)挫傷組中皮下和肌肉組織傷后出血例數(shù)[n（%）]

2.2 免疫組織化學(xué)和HE染色形態(tài)觀察

無(wú)論是皮膚挫傷區(qū)還是肌肉挫傷區(qū)，隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)均可分為炎癥、增生、瘢痕形成3個(gè)階段，即便在無(wú)明顯出血的樣本中，仍可看到有不同程度的修復(fù)過(guò)程，如炎癥反應(yīng)等。

隨著打擊高度的增加，挫傷的程度明顯增強(qiáng)，主要表現(xiàn)在皮下組織與肌肉區(qū)挫傷后無(wú)出血的例數(shù)下降，以及皮下組織與肌肉區(qū)同時(shí)出血例數(shù)增加，并且出血的范圍亦明顯擴(kuò)大，修復(fù)時(shí)間也隨著損傷程度的加重而延長(zhǎng)（表2、圖1～2）。

表2 不同打擊高度損傷在觀察時(shí)間段的組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×100，標(biāo)尺長(zhǎng)度：100μm）

圖2 50cm挫傷組修復(fù)過(guò)程（HE×100，標(biāo)尺長(zhǎng)度：100μm）

3 討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的主要局限性是難以找到與人體對(duì)外界刺激反應(yīng)完全相類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，盡管如此，動(dòng)物模型對(duì)認(rèn)識(shí)人類(lèi)損傷、疾病的原因及病理生理過(guò)程仍起到至關(guān)重要的作用，并且已成為證實(shí)藥物治療作用的有效工具。大鼠與人類(lèi)在很多器官系統(tǒng)如皮膚等，都具有相似的病理生理特征，大鼠皮膚由表皮和真皮層所構(gòu)成，損傷后的修復(fù)過(guò)程同人體大體類(lèi)似，也要經(jīng)歷炎癥、增生、瘢痕三個(gè)過(guò)程。其與人體的主要區(qū)別是大鼠屬于“松散皮膚化動(dòng)物（loose skinned animal）”，皮膚具有較大彈性并缺乏與皮下組織的牢固結(jié)合，創(chuàng)口修復(fù)的主要方式是皮膚收縮，而不是人體的皮膚再生修復(fù)[4]。大鼠作為皮膚實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是其強(qiáng)大的免疫抵抗能力，與大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如豬）相比，大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不易受到外源性細(xì)菌感染而發(fā)生敗血癥，亦不出現(xiàn)免疫抑制，其損傷后修復(fù)時(shí)間縮短以利于研究者快速認(rèn)識(shí)整個(gè)創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。因此，利用大鼠進(jìn)行皮膚損傷修復(fù)研究，具有經(jīng)濟(jì)、高效的特征[4]?；诖?，大鼠被廣泛選用為多種皮膚損傷后的修復(fù)研究，如藥物在全層皮膚切除模型的治療作用[5]、放射性損傷模型[6]、皮膚切割傷模型[7]、皮膚燒傷模型[8]等。

損傷時(shí)間推斷研究是法醫(yī)病理學(xué)的一個(gè)長(zhǎng)期關(guān)注熱點(diǎn)，研究對(duì)象主要是皮膚[2，3，9，10]、骨骼肌[11，12]等，既往多集中于皮膚切創(chuàng)的損傷時(shí)間研究[13，14]。但本實(shí)驗(yàn)室的前期研究[13，15]結(jié)果證實(shí)，在皮膚切創(chuàng)和挫傷中，檢測(cè)的3個(gè)炎癥因子（IL-1beta、COX-2和MCP-1 mRNAs）出現(xiàn)不同的表達(dá)方式，說(shuō)明不同類(lèi)型的損傷可能存在不同的修復(fù)過(guò)程，這就意味著需要針對(duì)不同類(lèi)型損傷研究相應(yīng)的損傷時(shí)間推斷方法[13，15]。近年來(lái)，損傷時(shí)間的研究開(kāi)始關(guān)注挫傷類(lèi)損傷[2，3，11，16]，并開(kāi)展了相應(yīng)的動(dòng)物模型研究[17]，但對(duì)皮膚挫傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯縿t較少。因此，本研究通過(guò)對(duì)大鼠下肢不同打擊高度所致挫傷的組織病理學(xué)變化進(jìn)行系統(tǒng)觀察，以說(shuō)明不同挫傷程度的組織修復(fù)過(guò)程。

在此次研究中，隨著挫傷程度增加，組織學(xué)表現(xiàn)逐漸加重，修復(fù)的過(guò)程也出現(xiàn)相應(yīng)的延長(zhǎng)。其中50cm挫傷組與彭雪等[3]研究中采用的打擊高度（54 cm）類(lèi)似，在觀察的時(shí)間段中，24 h內(nèi)主要以中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)為主，而至3d以后肌纖維細(xì)胞增生為主要表現(xiàn)，7d之后主要表現(xiàn)為肉芽組織增生，炎癥細(xì)胞反應(yīng)明顯減少，但仍可見(jiàn)B、C淋巴細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞，而這些炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的表現(xiàn)與15、30cm挫傷組的表現(xiàn)明顯不同。此外，50cm挫傷組中肌肉的組織病理學(xué)表現(xiàn)與于天水等[17]建立的重度肌肉挫傷模型相類(lèi)似，但該研究未對(duì)損傷后炎癥細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，且觀察時(shí)間最長(zhǎng)至傷后第7天。損傷后3d內(nèi)主要以肌肉細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主，3 d后則出現(xiàn)分化再生的肌細(xì)胞，后者所用的打擊動(dòng)能為2.25J，與本次研究中50cm挫傷組的勢(shì)能2.45J較接近。在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究中，常用的SD大鼠骨骼肌鈍挫傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)自于Kami等的實(shí)驗(yàn)[18]，采用的是自由落體打擊方法，打擊錘質(zhì)量為350g，高度為45.7cm，打擊動(dòng)能為1.57J，在劉樹(shù)坤等[19]的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)此類(lèi)大鼠肌肉鈍挫傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在挫傷后3 d內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，5d時(shí)明顯下降，并開(kāi)始出現(xiàn)少量瘢痕組織，7d后炎癥細(xì)胞基本消失，直到14d后仍有瘢痕組織增生趨勢(shì)，但在該研究中未能對(duì)炎癥細(xì)胞進(jìn)行種類(lèi)鑒別。

另一方面，在本研究中，30cm、50cm挫傷組在增加打擊高度的同時(shí)，亦增加了打擊面積，通過(guò)計(jì)算單位面積釋放能量，30 cm挫傷組（1.55 J/cm2）與15 cm挫傷組（1.46J/cm2）接近，但通過(guò)觀察兩組損傷后的出血情況及修復(fù)過(guò)程中的組織學(xué)表現(xiàn)，30cm挫傷組較15cm挫傷組仍然為重，這說(shuō)明挫傷的嚴(yán)重程度不僅與單位面積釋放能量有關(guān)，同時(shí)與受力面積成正相關(guān)，由此建議在今后的損傷模型實(shí)驗(yàn)中，不僅應(yīng)報(bào)道打擊能量或高度，亦應(yīng)同時(shí)報(bào)道打擊錘面積的相關(guān)數(shù)據(jù)。

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，需要推斷損傷時(shí)間的案例往往經(jīng)歷了嚴(yán)重的損傷，甚至最終死亡；另一方面，本研究結(jié)果證明不同程度挫傷的修復(fù)過(guò)程具有差異性，并且在15cm打擊高度時(shí)，挫傷后出血情況具有不確定性，可出現(xiàn)在皮下組織和（或）肌肉組織，甚至表現(xiàn)為無(wú)出血，而在50 cm打擊高度時(shí)，挫傷后出血在皮下和肌肉組織中的占比為87.5%，表明50cm高度打擊所致?lián)p傷具有較好的可重復(fù)性。因此，綜合考慮這些因素，筆者認(rèn)為在開(kāi)展挫傷損傷時(shí)間推斷研究工作中，以50cm打擊高度（2.58J/cm2）建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下肢挫傷模型不僅能夠更客觀模擬現(xiàn)實(shí)中需要推斷損傷時(shí)間的情況，而且具有較好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。但還需要引起重視的是，在本研究50 cm挫傷組中，發(fā)生1例骨折情況，意味著隨著打擊高度或者勢(shì)能的進(jìn)一步增加，骨折的發(fā)生率會(huì)有相應(yīng)增加，而骨折無(wú)疑是在挫傷動(dòng)物模型基礎(chǔ)上另一新類(lèi)型損傷的疊加，骨折因素在挫傷實(shí)驗(yàn)中的影響程度可能是進(jìn)一步研究的內(nèi)容，并且亦是今后挫傷研究者需要認(rèn)真考慮的因素之一。

（本研究由中國(guó)政法大學(xué)青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助）

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Comparison of the Skin and Skeletal Muscle Contusion in Rats Induced by Blunt Force with Different Heights

BAI Ru-feng1,2,Lü Xiao-jiao1,2,E Xiao-fei1,2,YU Tian-shui1,2,LIU Ran1,2,ZHANG Hai-dong1,2
（1.2011 Cooperative Innovation Center of Judicial Civilization,Beijing 100088,China;2.Key Laboratory of Evidence Science,China University of Political Science and Law,Ministry of Education,Beijing 100088,China）

ObjectiveTo explore the differences in the repair process of skin and skeletal muscle after contusion caused by blunt force attack with different heights.MethodsThree degrees of contusion were performed on SD rats’right hind limbs by a designed free-dropping device falling from 15,30 and 50cm heights,which as a main consideration factor for degree of injury.The repair process of skin and skeletal muscle at 6 h,24 h,3 d,7 d and 13 d after contusion were observed using routine histological methods. Results Hematoma within skin and/or muscle was found in the rats’hind limbs after contusion with three different heights.The repair processes were similar at 24 h after contusion.However,with the increase of height,the display degree was more obvious.At 3 d after contusion,the RBC of the hemorrhagic region would be decomposed and elapsed in 15 cm contusion group,but for 30 cm contusion group,it delayed to 7 d.At 13d after contusion,the similar result was found in 15cm and 30cm contusion groups,in contrast,the 50 cm contusion group was still in the proliferative phase.ConclusionWith the increase of height,the occurring rate of hematoma within skin and muscle at the same time increases,and the more serious histological appearance after contusion,including inflammation and proliferation,the longer healing process are observed.According to the results of present study and considering forensic application,the contusion model with 50cm height（2.58J/cm2）is recommended as the experimental animal model for the future study of wound age estimation on contusion.

forensic pathology;skin;contusions;muscle,skeletal;rats;wound age

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.001

1004-5619（2017）01-0001-05

2015-12-03）

（本文編輯：鄒冬華）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172902，81373241）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題資助項(xiàng)目（KF-116）

百茹峰（1977—），男，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)損傷學(xué)研究；E-mail：brf1000cn@aliyun.com

于天水，男，副教授，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：30030005@qq.com