西洋參總皂苷對(duì)大鼠肝微粒體CYP1A2活性的影響

鮑珍貝，楊 青，胡 敏，童靜玲

西洋參總皂苷對(duì)大鼠肝微粒體CYP1A2活性的影響

鮑珍貝，楊 青*，胡 敏，童靜玲

目的 考察西洋參總皂苷對(duì)大鼠肝微粒體CYP1A2活性的影響。方法 將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(空白組)、西洋參總皂苷低劑量組[低劑量組，50 mg/(kg·d)]、西洋參總皂苷中劑量組[中劑量組，100 mg/(kg·d)]、西洋參總皂苷高劑量組[高劑量組，200 mg/(kg·d)]和β-萘黃酮陽(yáng)性藥對(duì)照組[陽(yáng)性藥組，80 mg/(kg·d)]，預(yù)處理11 d后，觀察大鼠肝微粒體CYP1A2酶活性、CYP1A2 mRNA表達(dá)和CYP1A2酶蛋白表達(dá)情況，研究CYP1A2特異性探針底物非那西丁在預(yù)處理大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)變化。結(jié)果 預(yù)處理后，大鼠肝微粒體CYP1A2活性、mRNA和蛋白表達(dá)隨西洋參總皂苷劑量升高有增加趨勢(shì)，非那西丁在預(yù)處理大鼠體內(nèi)代謝速率加快。結(jié)論 西洋參總皂苷對(duì)大鼠肝微粒體CYP1A2活性有一定誘導(dǎo)作用。

西洋參總皂苷；大鼠；肝微粒體；CYP1A2；非那西丁

0 引言

西洋參為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumLinne)的干燥根，性涼，味甘微苦，歸心、肺、腎三經(jīng)[1-2]。具有“補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津”之功效，臨床多用于氣虛陰虧，虛熱煩倦，內(nèi)熱消渴，咳喘痰血等癥[3-6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，西洋參具有抗疲勞、耐缺氧、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、保護(hù)肝細(xì)胞和提高免疫功能的作用[7-10]。

本研究采用西洋參總皂苷對(duì)大鼠進(jìn)行預(yù)處理，分別研究大鼠肝微粒體CYP1A2酶活性、CYP1A2 mRNA表達(dá)和CYP1A2酶蛋白表達(dá)情況，以及CYP1A2的特異性探針底物非那西丁在西洋參總皂苷預(yù)處理大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的變化。從體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)全面考察西洋參總皂苷對(duì)大鼠肝微粒體CYP1A2酶活性的影響，本研究結(jié)果對(duì)西洋參總皂苷及其相關(guān)制劑和復(fù)方的臨床應(yīng)用具有參考價(jià)值。

1 材料

1290超高效液相色譜儀、6410B三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；BioBasic-18色譜柱(2.1 mm×50 mm，5 μm，美國(guó)Thomer Scientific公司)；Micro.CL 21R型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thomer Scientific公司)；MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；電泳儀、半干槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；PHS-3D pH儀(上海SANXIN公司)；IKA T10 basic S25勻漿器(德國(guó)IKA公司)；KQ 250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLER ME104E型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

西洋參藥材購(gòu)自湖北蘄州中藥材市場(chǎng)，西洋參總皂苷由本院藥學(xué)部自制；β-萘黃酮(β-NF)、非那西丁和對(duì)乙酰氨基酚(美國(guó)Sigma Aldrich公司)；辛伐他汀(IS，中國(guó)食品藥品鑒定研究院)、NADPH(瑞士Roche公司)。Anti-Cytochrome P450 1A2 antibody(美國(guó)Abcam公司)；乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司)；甲酸、磷酸二氫鉀(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為純凈水。

普通級(jí)雄性SD大鼠，60只，體重230～270 g，由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：BioBasic-18色譜柱(2.1 mm×50 mm，5 μm)。流動(dòng)相：0.1%甲酸(A)-乙腈(B)梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～1.5 min，15% B；1.5～2.5 min，15%～80% B；2.5～2.6 min，80%～15% B；2.6～3.0 min，15% B。流速0.45 mL/min；柱溫為室溫。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行正離子掃描，毛細(xì)管溫度300 ℃，毛細(xì)管電壓4 000 V，霧化電壓25 psi，干燥氣流速10 L/min。非那西丁、對(duì)乙酰氨基酚和內(nèi)標(biāo)辛伐他汀的檢測(cè)離子對(duì)分別選擇m/z 180.2→110.0，m/z 152.0→110.2和m/z 441.2→325.2。

2.2 生物樣品處理 取生物樣品100 μL，加入沉淀劑(乙腈∶甲醇=1∶1，含內(nèi)標(biāo)100 ng/mL)300 μL，渦旋混合1 min，14 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析。

2.3 大鼠預(yù)處理 取60只大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白對(duì)照組(空白組)、西洋參總皂苷低劑量組[低劑量組，50 mg/(kg·d)]、西洋參總皂苷中劑量組[中劑量組，100 mg/(kg·d)]、西洋參總皂苷高劑量組[高劑量組，200 mg/(kg·d)]和β-萘黃酮陽(yáng)性藥對(duì)照組[陽(yáng)性藥組，80 mg/(kg·d)]?？瞻捉M給予同等劑量的生理鹽水?？瞻捉M和低、中、高劑量組連續(xù)灌胃給藥10 d，在第8天陽(yáng)性藥組腹腔注射β-萘黃酮，連續(xù)3 d。每組大鼠等分為2批，分別用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

2.5 體外實(shí)驗(yàn)[11-14]

2.5.1 CYP同工酶活性測(cè)定 大鼠預(yù)處理給藥結(jié)束后，禁食12 h，股動(dòng)脈放血處死大鼠，并立即切除肝臟，制作大鼠肝微粒體。采用CYP1A2的特異性探針底物非那西丁研究大鼠肝微粒體CYP1A2酶的活性。采用典型的500 μL反應(yīng)體系，包含0.1 mol的磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)，10 mmol MgCl2，0.25 mg/mL微粒體和CYP1A2探針底物非那西丁?；旌衔锏慕K體積為500 μL，在37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min，然后加入1 mmol NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，并在反應(yīng)20 min后加入含有內(nèi)標(biāo)的預(yù)冷的沉淀劑終止反應(yīng)。按照上述生物樣品處理方法處理，采用LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)樣分析，測(cè)定反應(yīng)體系中CYP1A2特異性探針底物非那西丁的代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚的濃度來(lái)比較5組大鼠肝微粒體CYP1A2的活性(見圖1)。

結(jié)果顯示，高劑量組和陽(yáng)性藥組大鼠肝微粒體CYP1A2活性與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，低劑量組和中劑量組與空白組比較，大鼠CYP1A2活性增加不顯著，但呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且具有一定的劑量依賴性。

圖1 大鼠肝微粒體CYP1A2的相對(duì)活性(n=6)

2.5.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)結(jié)果 RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝臟樣本中CYP1A2基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。預(yù)處理大鼠所得肝臟，切取一小塊肝左葉迅速在液氮中冷凍并在-80 ℃保存。大約取100～200 mg肝組織進(jìn)行勻漿，并用Trizol試劑提取總RNA。RNA的含量采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。大鼠肝微粒體CYP1A2的引物依據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。反轉(zhuǎn)錄采用經(jīng)典的20 mL反應(yīng)體系，包含：4單位的Omniscript逆轉(zhuǎn)錄酶，1×RT緩沖液，10單位的RNA酶抑制劑，1 mmol的隨機(jī)六聚物引物，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.5 mmol，以及8 mL的總RNA提取物。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42 ℃進(jìn)行60 min，然后93 ℃保持5 min以終止反應(yīng)。5 mL cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。凝膠用溴化乙錠染色。采用基因CYC測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，調(diào)節(jié)每一個(gè)肝臟標(biāo)本RNA的回收率。

結(jié)果如圖2所示，高劑量組和陽(yáng)性藥組大鼠CYP1A2 mRNA表達(dá)與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠CYP1A2 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

圖2 大鼠肝微粒體CYP1A2 mRNA的相對(duì)表達(dá)(n=6)

2.5.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)結(jié)果 用Western blot方法檢測(cè)大鼠肝臟微粒體樣本中CYP1A2酶的蛋白表達(dá)情況。大鼠肝微粒體通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。封閉該膜，與一抗和二抗孵育，并在增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光溶液中浸泡60 s，顯影并定影(圖3)。結(jié)果顯示，大鼠CYP1A2酶的蛋白表達(dá)隨西洋參總皂苷劑量的增加，呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，具有一定的劑量依賴性。

2.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué) 預(yù)處理的另外一批5組大鼠，共30只進(jìn)行體內(nèi)非那西丁藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。于第11天實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。按0.5 mg/kg劑量腹腔注射非那西丁。于給藥前及給藥后5、10、20、30、45、60、90、120、240和480 min，眼球靜脈叢取血0.3 mL。4 500 r/min離心10 min，取血漿-30 ℃保存?zhèn)溆?。血漿樣品按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行處理，并測(cè)定藥物濃度，分別采用DAS 2.0軟件和Origin 8.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和制作藥時(shí)曲線圖(圖4，表1)。與空白組比較，低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組的AUC(0-t)分別降低8.88%、23.82%、42.10%和64.95%；低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組的非那西丁清除率(CLz)呈劑量依賴性，逐漸升高。

圖3 大鼠肝微粒體CYP1A2的蛋白表達(dá)

圖4 非那西丁在預(yù)處理大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線(n=6)

表1 非那西丁在預(yù)處理大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)西洋參實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究的逐步深入，西洋參皂苷已被確定為西洋參的主要藥效成分，現(xiàn)已分離鑒定出49種，包括32種達(dá)瑪烷型皂苷，3種齊墩果酸型皂苷，2種奧克梯隆醇型皂苷，另外還有其他皂苷類成分12種[1]。

隨著對(duì)西洋參研究的深入，其臨床應(yīng)用也在逐漸增加，闡明中藥的相互作用對(duì)于研究中藥的配伍機(jī)制和臨床的用藥安全具有重要意義。但是中藥成分復(fù)雜，藥物的相互作用形式多種多樣，其中基于CYP450酶的藥物相互作用在中藥藥物相互作用研究中占很高的比例[15]。CYP450是藥物Ⅰ相代謝反應(yīng)的主要超家族酶系，為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，參與內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝，參與介導(dǎo)藥物的氧化、還原或水解反應(yīng)。CYP450酶系是導(dǎo)致藥物相互作用發(fā)生關(guān)系最為密切的酶系，凡參與代謝的酶亞型都與藥物相互作用有關(guān)。而CYP1A2是肝臟微粒體CYP450中比較重要的酶亞型，在藥物代謝中發(fā)揮重要作用[16]。

為了探討西洋參總皂苷對(duì)大鼠肝微粒體CYP1A2活性的影響，本研究分別通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了探討。本研究結(jié)果顯示，西洋參總皂苷干預(yù)后，大鼠肝微粒體CYP1A2酶活性、CYP1A2 mRNA表達(dá)和CYP1A2酶蛋白表達(dá)隨干預(yù)劑量的增加有不同程度的增加。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，西洋參總皂苷干預(yù)的大鼠非那西丁藥物代謝速率加快，血漿暴露量減少，也具有一定的劑量相關(guān)性。

本研究并沒有探討西洋參總皂苷誘導(dǎo)CYP1A2的分子機(jī)制。研究表明，芳香烴受體可以介導(dǎo)外源化學(xué)物對(duì)人類和其他動(dòng)物的CYP1A2配體介導(dǎo)的基因表達(dá)[17]。因此，需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明西洋參總皂苷誘導(dǎo)CYP1A2酶的分子機(jī)制，特別是芳香烴受體在該誘導(dǎo)過(guò)程可能發(fā)揮的作用。

綜上所述，西洋參總皂苷對(duì)大鼠CYP1A2活性具有一定的誘導(dǎo)作用，長(zhǎng)期服用含有西洋參總皂苷的制劑或者復(fù)方時(shí)，臨床聯(lián)合應(yīng)用的CYP1A2酶底物藥物應(yīng)該調(diào)整給藥劑量。此結(jié)果可能受限于種屬差異，但是對(duì)于闡明西洋參總皂苷的藥物相互作用機(jī)制以及臨床合理安全用藥仍具有重要意義。

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Influence of total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne on the activity of CYP1A2 in rats

BAO Zhen-bei,YANG Qing*,HU Min,TONG Jing-ling

(Luqiao Hospital of Taizhou Enze Medical Center in Zhejiang,Taizhou 318050,China)

Objective To study the influence of total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne on the activity of CYP1A2 in rats.Methods Rats were randomly divided into control group,total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne groups [50,100 and 200 mg/(kg·d)] and positive control group.After pretreatment for 11 consecutive days,the activity,mRNA expression and protein expression of CYP1A2 were measured.The pharmacokinetic changes of phenacetin (probe substrate of CYP1A2) in pretreatment rats were investigated.Results After pretreatment with total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne,the activity,mRNA expression and protein expression of CYP1A2 in rats were improved with dose increasing.The metabolic rate of phenacetin was speeded up.Conclusion Total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne might induce the activity of CYP1A2.

Total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne;Rats;Liver microsomes;CYP1A2;Phenacetin

2016-08-30

臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))路橋醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318050

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2015ZB131)；臺(tái)州市科技局自助A類課題(14SF07)

10.14053/j.cnki.ppcr.201703003

*通信作者