平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)的正交試驗研究

任建宏，王鵬麗，殷麗娜，趙娟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)的正交試驗研究

任建宏，王鵬麗，殷麗娜，趙娟*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]篩選平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方。[方法]以平陸百合的鱗片作為外植體，分別在光照和黑暗培養(yǎng)條件下，利用正交試驗設(shè)計法研究了不同濃度2,4-D、NAA、KT組合對平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響。[結(jié)果]光照培養(yǎng)條件下,百合愈傷組織的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1，誘導(dǎo)率為57.143%，各因子影響程度依次為NAA>KT>2,4-D;黑暗培養(yǎng)條件下，百合愈傷組織的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+2,4-D 5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1，誘導(dǎo)率為50%，各因子影響程度依次為KT>NAA>2,4-D。[結(jié)論]平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為：MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1，培養(yǎng)條件為光照。

平陸百合； 愈傷組織； 正交設(shè)計

平陸百合(Liliumbrownievar.viridulum)屬百合科百合屬多年生草本植物，為可食用百合，生長于山西省中條山下的平陸縣，個頭大、鱗片肉厚無柴，質(zhì)量好、營養(yǎng)價值高，有“中條參”的美稱；含有大量蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、維生素，并含有少量鈣、磷、鐵等，藥用價值高，具有補中益氣，溫肺止咳，安神、清心等功效[1，2]。

愈傷組織培養(yǎng)作為植物離體培養(yǎng)最主要的培養(yǎng)形式[3，4]，既可用于植物生長發(fā)育、分化機制、遺傳變異規(guī)律及遺傳育種等相關(guān)研究[5，6]，又可用于規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)有用化合物，是一種適于植物快繁的新手段[7～9]。雖然近年來已開展一些對食用百合愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)研究，但在采用正交設(shè)計法誘導(dǎo)百合愈傷組織方面還未見系統(tǒng)的研究報道。本試驗以平陸百合脫毒苗鱗片為外植體，采用L25(56)均勻正交設(shè)計分析比較2,4-D、NAA、KT三種激素不同濃度組合在光照與黑暗條件下對百合愈傷組織誘導(dǎo)的影響，旨在為平陸百合脫毒苗快速繁殖提供新途徑，同時建立和優(yōu)化愈傷組織體系，為開展遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

平陸百合(Liliumbrowniivar.viridulum)脫毒試管苗由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實驗室提供。

1.2 試驗方法

平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)采用L25(56)正交表設(shè)計正交試驗，根據(jù)設(shè)計安排25個處理組合。試驗因素水平見表1，所用培養(yǎng)基均按照正交法設(shè)計(表2)。外植體均選用百合鱗片，每組處理接種42塊鱗片，重復(fù)3次。每天觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，接種20 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 L25(56)愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗設(shè)計

Table 1 Design of orthogonal test L25(56) for callus induction

因素Factors水平/mg·L-1Levels2,4-D12345NAA0.10.20.30.40.5KT0.10.20.30.40.5

試驗所用培養(yǎng)基均以MS作為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖3%、瓊脂0.6%，pH為5.6～5.8。光照條件溫度(25±2) ℃，光照16 h·d-1,光照強度1 600～2 100 lx；黑暗條件溫度(16±2) ℃，關(guān)掉接種材料上下的燈管，不需遮光。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析方法

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

試驗所采集數(shù)據(jù)由Spss17.0和Microsoft Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)的正交試驗結(jié)果

3種外源激素及5個濃度梯度，根據(jù)正交表設(shè)計得25組試驗處理，分別置于光照、黑暗條件下，其愈傷組織誘導(dǎo)率均值見表2。多重比較分析可知，2種條件下25組愈傷組織誘導(dǎo)率均值差異顯著。光下5號培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率均值顯著高于其他24組，即MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1適宜平陸百合形成愈傷組織。黑暗下4號激素配方的愈傷誘導(dǎo)率均值顯著高于其他24組，說明黑暗條件適宜愈傷形成的配方為MS+2,4-D 5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1。

表2 平陸百合愈傷誘導(dǎo)率的L25(56)正交試驗方案及結(jié)果

Table 2 Plan and result of L25(56)orthogonal design test for callus induction of Lilium

編號Code因素/mg·L-1Factors愈傷組織誘導(dǎo)率均值/%Frequencyofcallus2,4-DNAAKT光照Illumination黑暗Dark110.40.228.571eE35.714cBC240.50.350.000bB42.857bAB340.20.214.286hJ28.571deCD450.30.29.524ijK50.000aA510.30.557.143aA14.286fEF640.30.428.571eE14.286fEF720.20.120.833gI14.286fEF850.50.125.000fFG0.000940.10.514.286hJ14.286fEF1030.10.223.810fGH14.286fEF1120.40.510.000iK13.333fgF1230.30.140.000cC6.667hiFG1320.10.40.000kL6.667hiFG1410.50.40.000kL0.000iG1510.10.120.000gI0.000iG1620.30.321.429gHI7.692fghFG1710.20.30.000kL0.000iG1850.10.313.043hJ23.077eDE1920.50.231.818dD9.524fghF2050.20.527.273eEF0.000iG2130.50.520.000gI30.769cdCD2240.40.17.692jK0.000iG2330.40.324.138fGH28.571deCD2430.20.40.000kL0.000iG2550.40.440.000cC30.900cdCD

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column.

2.2 光照條件下平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)

平陸百合鱗片接種后置于光下培養(yǎng)，10 d后開始萌動，肉眼可見切口處有白色點狀物質(zhì)，之后鱗片的切口邊緣形成一層綠色緊密型愈傷組織(圖1a)；培養(yǎng)至40 d后一部分愈傷組織出現(xiàn)突起，一部分則褐化變黑(圖1c)。由表2、表3可得其直觀分析，2,4-D、NAA和KT的極差分別是6.152、18.855和12.026，說明2,4-D對平陸百合愈傷組織的誘導(dǎo)作用最小，NAA的誘導(dǎo)作用最大。由此可見，試驗用3種激素對平陸食用百合的愈傷組織誘導(dǎo)作用的主次關(guān)系為NAA>KT>2,4-D。不同濃度NAA對平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)率有極顯著差異(P<0.01)，而2,4-D與KT對愈傷組織的誘導(dǎo)作用差異不顯著(表4)。綜合可得，光照條件下平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)的最佳組合為MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

圖1 平陸百合愈傷組織的誘導(dǎo)Fig.1 Callus induction of Lilium 注：a (培養(yǎng)基:MS+2,4-D 1 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1;培養(yǎng)條件:光照); b (培養(yǎng)基:MS+2,4-D 5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1;培養(yǎng)條件:黑暗); c (光照培養(yǎng)條件下，愈傷組織逐漸褐化變黑); d (光照培養(yǎng)條件下,愈傷組織開始分化)Note: a(medium:MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1; culture conditions:light treatment ); b (medium:MS+2,4-D 5 mg·L-1+NAA 0.3 m g·L-1+KT 0.2 g·L-1;culture conditions:light treatment); c (in light，callus gradually go brown and black); d (in lignt, callus differentiation)

Table 3 Audio-visual analysis for callus induction rate of Lilium

因素Factors2,4-DNAAKTK1105.71471.139113.526K284.0862.392108.009水平和K3107.947156.667108.61K4114.835110.40268.571K5114.84126.818128.701k121.14314.22822.705k216.81612.47821.602水平均值k321.58931.33321.722k422.96722.0813.714k522.96825.36425.74極值R6.15218.85512.026

注：K為各因素在各個水平誘導(dǎo)率的總和，k為各因素在各個水平的平均值，R為極差。表5同。

Note: K the sum of the various factors in each level, k the average of the factors at each level, R Indicate range.The same as in table 5.

表4 平陸百合愈傷組織平均誘導(dǎo)率方差分析

Table 4 Variance analysis for average callus induction rate of Lilium

變異來源Sourceofvariation平方和Sumofsquare自由度df均方MeanofsquareF值FvalueSig2,4-D383.537495.8840.5220.720NAA3681.3214920.3305.008**0.001KT1189.4374297.3591.6180.181誤差11394.19062183.777總計50028.72974

2.3 黑暗條件下平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)

外植體接入培養(yǎng)基在黑暗條件下培養(yǎng)20 d后，鱗片邊緣出現(xiàn)顆粒狀愈傷組織，呈現(xiàn)黃白色；40 d后愈傷組織增多，有少量根出現(xiàn)(圖1b)。由表5可知，2,4-D、NAA和KT的極差分別是10.495、13.133和20.571，說明2,4-D對平陸百合愈傷組織的誘導(dǎo)作用最小，KT的誘導(dǎo)作用最大；各因素對平陸百合的愈傷誘導(dǎo)率影響的主次關(guān)系為KT>NAA>2,4-D。

表5 黑暗條件下平陸百合愈傷誘導(dǎo)率的極差分析/%

Table 5 Audio-visual analysis for callus induction rate of Lilium in the dark condition

試驗因素Factors2,4-D/mg·L-1NAA/mg·L-1KT/mg·L-1K173.07758.31535.238K251.50242.857138.095水平和K380.29392.93102.198K4100108.51951.852K5103.97783.1572.674k114.61511.6637.048k210.38.57127.619水平均值k316.05918.58620.44k42021.70410.37k520.79516.6314.535極值R10.49513.13320.571

由表6可見，不同濃度的KT對平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著差異(P<0.01)，2,4-D與NAA對愈傷誘導(dǎo)率差異顯著(P<0.05)綜合可得，黑暗條件下對平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)的最佳組合為MS+2,4-D 5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1。

表6 黑暗條件下平陸百合愈傷組織平均誘導(dǎo)率方差分析

Table 6 Variance analysis for callus induction rate of Lilium in the dark condition

變異來源Sourceofvariation平方和Sumofsquare自由度df均方MeanofsquareFFvalueSig2,4-D1587.9824396.9953.083*0.022NAA1679.8784419.9703.262*0.017KT4895.93541223.9849.506**0.000誤差7983.15062128.760總計34005.32974

3 討論與結(jié)論

正交設(shè)計具有試驗次數(shù)少，數(shù)據(jù)分析角度多且方法簡單等優(yōu)點，是優(yōu)化植物愈傷組織誘導(dǎo)體系的有效工具[10]。通過對正交試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析、方差分析以及多重比較，能夠確定百合愈傷組織誘導(dǎo)率的主要影響因素，從而對試驗結(jié)果做出準(zhǔn)確評價[11,12]。

愈傷組織是具有分化能力的薄壁細(xì)胞，在快速繁殖、育種、轉(zhuǎn)基因、脫毒苗生產(chǎn)等方面均有極大的應(yīng)用價值，可用于百合愈傷組織誘導(dǎo)的外植體有鱗片、莖段、葉片、花瓣、花絲、子房、種子等，其中鱗片為最常用的外植體。Mori等[13]利用21個百合品種，選用種子、鱗片、葉片等作外植體研究其愈傷組織誘導(dǎo)情況，其中鱗片的愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%。呂玉虎等[14]研究表明鱗片在培養(yǎng)基上的放置方式對其愈傷組織誘導(dǎo)有影響，其誘導(dǎo)能力從強到弱依次為：鱗片內(nèi)側(cè)向上平放>鱗片豎直插入>鱗片內(nèi)側(cè)向下平放。翟彥等[15]研究切花百合時以花絲為外植體，愈傷組織形成先發(fā)生在切口處。在本試驗中，選用平陸百合鱗片作外植體，接種時水平放置內(nèi)側(cè)向上，觀察其切口處愈傷組織的誘導(dǎo)情況，所得結(jié)果與上述結(jié)論相近，這說明鱗片作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，效果較好，且與鱗片的放置方式有關(guān)。

光暗培養(yǎng)條件影響愈傷的誘導(dǎo)。一般而言,暗培養(yǎng)有利于愈傷組織的誘導(dǎo),而光培養(yǎng)對愈傷組織的分化及器官形成有利。張藝萍等[16]研究表明東方百合在黑暗條件下更易形成愈傷組織。本試驗中，光照條件較黑暗條件更適于平陸百合形成愈傷組織，推測這可能與百合品種有關(guān)。形成的愈傷組織一段時間后一部分褐化變黑(圖1c)，一部分出現(xiàn)芽點再生(圖1d)，在試驗中愈傷組織褐化變黑，這可能是由于多酚類化合物在多酚氧化酶作用下氧化形成活性酸化物與環(huán)形多聚體氧化蛋白時形成深色化合物，這類物質(zhì)很快又被氧化形成醌類化合物，導(dǎo)致愈傷組織褐化變黑，從而使其失去再生能力，而芽點再生則可能是因為光照促進(jìn)了組織的分化及器官形成。

外源植物激素對愈傷組織的形成有重要的誘導(dǎo)作用，不同植物、不同外植體以及相同外植體不同部位對所用植物激素都不同[17]。2,4-D常被用來誘導(dǎo)愈傷組織，本研究在光照與黑暗2種條件下，均經(jīng)極差分析得到兩種生長素影響平陸百合愈傷組織形成的主次關(guān)系為NAA>2，4-D；陸美蓮等[18]研究同樣表明NAA對百合愈傷誘導(dǎo)的影響大于2，4-D；孫君社等[19]研究認(rèn)為NAA的生物活性低于2,4-D，且相差3～5倍，這與本試驗所得結(jié)論有差異，這可能是由于不同百合品種對不同生長素類的效應(yīng)有所差異。 KT常被選用誘導(dǎo)百合胚性愈傷，本試驗選用其作為一種外源激素，直觀分析可看出在兩種條件下，對誘導(dǎo)平陸百合愈傷組織影響因素KT>2，4-D，KT的主要作用還需進(jìn)一步驗證。當(dāng)生長素與細(xì)胞分裂素的比例高時，有利于誘導(dǎo)愈傷組織形成；本試驗在光照條件下最佳誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基配方為MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1，黑暗條件下最佳配方為MS+2,4-D 5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1；與上述基本原理基本一致。

此外，愈傷組織還受基因型影響，Mori等[13]對33個不同基因型的百合進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究，結(jié)果30個基因型誘導(dǎo)形成愈傷組織。Loretta等[20]研究發(fā)現(xiàn)，麝香百合較東方百合和亞洲百合相比有較強的愈傷組織誘導(dǎo)能力。

綜合考慮，平陸百合愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為：MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1，培養(yǎng)條件為光照。

[1]陳龍.百合(Lilium)鱗莖薄層胚性愈傷組織誘導(dǎo)及再生植株遺傳穩(wěn)定性鑒定[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2013:1-3.

[2]張傳海,葛自兵,白雪峰,等.食用百合卷丹離體培養(yǎng)再生體系的建立[J].皖西學(xué)院學(xué)報,2012,28(2):1-3.

[3]陳俊男,鄧志英,田紀(jì)春.小麥成熟胚組織培養(yǎng)體系優(yōu)化及其影響因素的研究[J].麥類作物學(xué)報,2012,32(2):197-202.

[4]豐先紅,李健,羅孝貴.百合病毒脫除技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報,2015,5(9):91-95.

[5]韓婷婷,孫周平.矮叢藍(lán)莓葉片的愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生[J].西北植物學(xué)報2010,30(3):0615-0620.

[6]陳超.紅掌愈傷組織和再生團塊的發(fā)育及四倍體誘導(dǎo)[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011:7-9.

[7]馬怡迪.野生百合高效再生體系建立及愈傷組織增殖調(diào)控研究[D].浙江:浙江大學(xué),2015:10-13.

[8]袁雪,鐘雄輝,李曉昕,等.鐵炮百合的胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J].核農(nóng)學(xué)報,2012,26(3):0454-0460.

[9]崔瑞峰,張麗霞,韓曉紅.不同激素配比對百合鱗片愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(9):8-9.

[10]王興仁,張錄達(dá),王華方.正交試驗設(shè)置重復(fù)的必要性和統(tǒng)計分析方法[J].土壤通報,2000,31(3):135-139.

[11]劉建軍,龔一富,王世安,等.銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的多因子正交試驗研究[J].廣西植物,2014,34(1):116-119.

[12]方萍.實用農(nóng)業(yè)試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析指南[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:193-231.

[13]Mori S, Adachi Y, Horimoto S, et al. Callus formation and plant regeneration in various Lilium species and cultivars[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2005,41 (6):783-788.

[14]呂玉虎,李彬青,吳淑平,等.百合的離體組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報,2002,12(2):19-20.

[15]翟彥,張宗勤,賈敏，等.百合體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生[J].西北植物學(xué)報,2011,31(4):0834-0841.

[16]張藝萍,吳麗芳,吳學(xué)尉,等.東方百合胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008, 20(12):33-36.

[17]Wang D M,Huang X L,Huang SH, et al. The action mechanism of cytokinins in plant tissue culture[J]. Plant Physiology Communications,1996,32(5):373-377.

[18]陸美蓮,徐新萍,周厚高，等.均勻正交設(shè)計在百合組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004,26(12):699-702.

[19]孫君社,方曉華.植物激素對百合鱗片愈傷組織生長的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,6(2):58-61.

[20]Loretta Bacchetta, Patrizio C Remotti, Claudia Bemardini, et al. Adventitious shoot regeneration from leaf explants and stem nodes of Lilium[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2003,74(1):37-44.

(編輯：馬榮博)

Callus induction ofLiliumbrowniivar.viridulumby orthogonal test

Ren Jianhong, Wang Pengli, Yin Li’na, Zhao Juan*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective] Search the optimal medium of callus inducement ofLiliumbrowniivar.viridulum.[Methods]With the scales ofLiliumas explants, the effect of different hormone combines (2,4-D、NAA、KT )on the callus induction ofLiliumwere studied by design test in light and darkness respectively. [Results]In light, the effect of three hormones on callus induction was NAA>KT>2,4-D. The optimal medium for callus induction ofLiliumwas MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1,the callus induction frequency was 57.143%; In darkness, the effect of three hormones on callus induction was KT>NAA>2,4-D.The optimal medium for callus induction ofLiliumwas MS+2,4-D 5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1, the callus induction frequency was 50%.[Conclusion]The best medium for callus induction ofLiliumbrowniivar.viridulumwas MS+2,4-D 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1, inducing condition was light．

Liliumbrownievar.viridulum， Callus， Orthogonal design

2016-10-23

2016-12-28

任建宏 (1991-)，男(漢)，山西壽陽人，碩士研究生，研究方向：植物組織培養(yǎng)

*通信作者：趙娟，博士，副教授。Tel:13834836658；E-mail:sxndzhaojuan@163.com

山西省科技攻關(guān)項目(20130311014-1) ；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動項目(2012YJ13)；山西省青年科技研究基金(201601D202054)

S644.1

A

1671-8151(2017)03-0189-05