CPB-LAR-GFP表達載體的構建及其在紫花苜蓿愈傷組織中的表達

陳春艷，馬暉玲，董文科，楊江偉，李玉珠

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.河南科技大學 農(nóng)學院，河南 洛陽 471003；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學 生命科學院，甘肅 蘭州 730070)

CPB-LAR-GFP表達載體的構建及其在紫花苜蓿愈傷組織中的表達

陳春艷1,2，馬暉玲1，董文科1，楊江偉3，李玉珠1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.河南科技大學 農(nóng)學院，河南 洛陽 471003；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學 生命科學院，甘肅 蘭州 730070)

以無色花青素還原酶編碼基因LAR為靶序列，構建攜帶綠色熒光蛋白GFP和抗除草劑bar基因的雙標記選擇植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法對紫花苜蓿進行遺傳轉化，經(jīng)PCR檢測和PPT篩選出抗性愈傷組織，轉基因紫花苜蓿愈傷組織的縮合單寧含量比對照高30.8%。試驗證明重組基因已轉化至紫花苜蓿愈傷組織中并發(fā)揮生理功能，為研究縮合單寧合成與代謝的分子調(diào)控機制和培育具有抗除草劑和抗臌脹病的牧草新品種奠定基礎。

甘肅紅豆草；無色花青素還原酶；抗除草劑；綠色熒光蛋白；紫花苜蓿；轉化

紫花苜蓿(Medicagosativa)葉片中不含有縮合單寧[1,2]，反芻動物采食鮮嫩紫花苜蓿后會引起臌脹病。因此，含縮合單寧苜蓿新品種的培育和飼草組合利用被認為是解決采食紫花苜蓿引起牲畜臌脹病發(fā)生的兩條途徑。選育出遺傳穩(wěn)定的抗臌脹病苜蓿新品種無疑是牧草新品種培育者的首選途徑。植物體內(nèi)縮合單寧物質(zhì)的積累受到自身遺傳和調(diào)節(jié)因子的控制[3-6]。紅豆草生長的各個時期葉片中均含有較高濃度的縮合單寧，反芻動物大量采食紅豆草后不會引起臌脹病。有報道從紅豆草(Onobrychisviciaefolia)中鑒定和分離控制縮合單寧積累的基因，利用基因工程技術將此基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ惺菍崿F(xiàn)遺傳資源創(chuàng)新的途徑之一[7-10]。既可解決牲畜鮮食紫花苜蓿引發(fā)的臌脹病問題，也利于降低牲畜瘤胃消化過程溫室氣體的排放，對草業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展及緩解其對環(huán)境造成的壓力都有重要的意義[11]。

縮合單寧(即花青素)屬于類黃酮生物合成途徑中的植物次生代謝產(chǎn)物。植物次生代謝物合成與積累量取決于其合成途徑中的限速酶，其限速酶在植物次生代謝物生物合成途徑中往往位于代謝支路分叉口或途徑的下游[12]。無色花青素還原酶(LAR)位于縮合單寧合成途徑的下游，直接將無色花青素轉化成兒茶酚(2,3-反式黃烷-3-醇)，即一類縮合單寧單體，最終聚合形成縮合單寧。LAR被認為是縮合單寧生物合成途徑的限速酶[12]。因此，LAR在縮合單寧生物合成途徑中尤為重要。除了擬南芥(Arabidopsisthaliala)中沒有LAR基因，在多種植物中均發(fā)現(xiàn)LAR的活性，并且LAR的活性與縮合單寧的累積相關[13-14]。Bogs[15]發(fā)現(xiàn)LAR的表達決定葡萄中縮合單寧的累積和組成。Paolocci[16]報道LAR的穩(wěn)定表達與百脈根葉中縮合單寧的累積一致。但是也有LAR活性與縮合單寧累積不符的報道，蒺藜苜蓿MtLAR的轉錄水平與縮合單寧的累積并不相符[17]，也有發(fā)現(xiàn)柿中LAR基因的表達與縮合單寧累積不符?？梢姡琇AR基因與縮合單寧合成受到種間差異的影響?？梢酝茢嗬梅N間的遺傳差異和基因工程手段來調(diào)控植物縮合單寧含量是可行的。

研究擬采用廣泛應用的綠色熒光蛋白GFP基因作為報告基因，結合兼具抗鋤草劑特性和報告基因的雙重功能的抗廣譜除草劑草丁膦的bar基因；構建用于農(nóng)桿菌轉化的含雙標記(bar和GFP基因)的LAR植物表達載體，遺傳轉化紫花苜蓿。這將為研究縮合單寧合成與代謝過程中的功能提供基礎資料，也為利用無色花青素還原酶基因調(diào)控紫花苜蓿縮合單寧的含量奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

pMD-GFP質(zhì)粒、pMD-LAR質(zhì)粒、CPB質(zhì)粒、農(nóng)桿菌LBA4404由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室提供。

1.2 材料與試劑

紅豆草品種為甘肅紅豆草，苜蓿品種為和田苜蓿，由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。SanPrep DNA膠回收試劑盒、Amp、Kan、Rif、Str購自上海生工生物工程公司，Taq酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、SmalⅠ、SacⅠ)、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司，其他藥品、試劑為常規(guī)國產(chǎn)分析純。

1.3 CPB-LAR-GFP表達載體的構建

pMD-GFP質(zhì)粒用BamHⅠ和SmalⅠ雙酶切，回收GFP片段(714 bp)；pMD-LAR質(zhì)粒用SmalⅠ和SacⅠ雙酶切，回收LAR片段(1 089 bp)；載體CPB(含bar基因)用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切，回收大片段。通過T4DNA連接酶，將GFP片段、LAR片段與載體大片段16℃連接6 h。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌，經(jīng)藍白斑篩選，挑取陽性單菌落，通過質(zhì)粒PCR和酶切鑒定篩選出重組克隆，送3個克隆樣品到上海生工生物公司測序，將此含LAR和GFP基因的載體命名為：CPB-LAR-GFP(圖1)。

圖1 CPB-LAR-GFP表達載體結構Fig.1 The structure of the eukaryotic expression vector CPB-LAR-GFP

1.4 紫花苜蓿遺傳轉化及檢測

1.4.1 載體CPB-LAR-GFP轉化農(nóng)桿菌 采用文獻[17]方法將植物表達載體CPB-LAR-GFP轉化至農(nóng)桿菌LBA4404。轉化產(chǎn)物涂布于含50 μg/mL Kan、25 μg/mL Str、25 μg/mL Rif的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑取陽性單菌落，質(zhì)粒PCR鑒定。

1.4.2 重組農(nóng)桿菌轉化紫花苜蓿 取含供試質(zhì)粒CPB-LAR-GFP的農(nóng)桿菌LBA4404，在含50 μg/mL Kan，25 μg/mL Str和25 μg/mL Rif的YEB平板培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落接入含相應抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。剪取紫花苜蓿無菌苗的下胚軸，用活化的農(nóng)桿菌(D600 nm值為0.3～0.5)侵染10 min，用無菌水將組織材料清洗干凈，用無菌濾紙吸干水分，放置在25℃共培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 2,4-D)上暗培養(yǎng)3 d，轉入誘導愈傷培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+50 mg/L Kan+300 mg/L Cef)，25℃暗培養(yǎng)25 d，轉入分化培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+50 mg/L Kan+300 mg/L Cef)，進行分化再生培養(yǎng)。

1.5 轉基因愈傷組織的檢測

1.5.1 PCR檢測 取愈傷組織0.10 g，按文獻[18]方法提取基因組DNA，以此為模板，根據(jù)LAR基因設計特異引物P1：ATGGCGACTTCCCCAGCCAATATC，P2：TCAACAGGAAGCTGTTATTGGGACTG，擴增LAR基因。PCR反應體系(25 μL)包括DNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，引物P1和P2(10 pmol/μL)各1 μL，5 U/μLTaq酶0.5 μL。擴增參數(shù)為：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min30 s，38個循環(huán)；72℃延伸10 min，最后于4℃保存。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.2 抗除草劑抗性鑒定 將轉基因愈傷組織接種到含不同濃度(1.0～5.0 mg/L)草丁膦(PPT)的分化培養(yǎng)基上，以組織培養(yǎng)獲得的再生愈傷作抗性篩選對照，觀察抗性愈傷對不同濃度PPT的抗性。

1.5.3 GFP熒光檢測 取轉基因愈傷組織進行壓片，置于OLYPUSBX 51/BX 52型熒光顯微鏡下，用藍光激發(fā)愈傷組織，觀察并拍照。

1.5.4 縮合單寧含量檢測 以未轉基因愈傷為對照，采用正丁醇-鹽酸法測定轉基因愈傷縮合單寧含量[19-20]。

2 結果與分析

2.1 CPB-LAR-GFP植物表達載體的構建

用SmalⅠ+SacⅠ雙酶切pMD-LAR質(zhì)粒，回收LAR目的片段，用BamHⅠ和SmalⅠ雙酶切pMD-GFP質(zhì)粒，回收GFP目的片段，用BamHⅠ+SacⅠ雙酶切載體CPB，回收大片段。將回收的LAR目的片段、GFP目的片段與載體大片段通過T4DNA連接酶連接后，連接產(chǎn)物轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆子搖菌，PCR檢測(圖2)擴增出1 089 bp(LAR基因)和714 bp(GFP基因)的2條帶；雙酶切鑒定(圖2)切下約為714 bp(GFP基因)、1 089 bp(LAR基因)、1 803 bp(LAR基因和GFP基因)的3條帶，PCR與雙酶切均得到預期大小的條帶。說明成功構建了CPB-LAR-GFP植物表達載體。

圖2 重組質(zhì)粒CPB-LAR-GFP PCR及雙酶切Fig.2 PCR and double digestion of the recombined CPB-LAR-GFP plasmid注：1,5.DL2000 Marker;2.BamHⅠ和SmalⅠ雙酶切結果 (714 bp);3.SmalⅠ+SacⅠ雙酶切結果 (1 089 bp);4.BamHⅠ+SacⅠ雙酶切結果 (1 803 bp);6.PCR擴增產(chǎn)物 (1 089 bp);7.PCR擴增產(chǎn)物 (714b p);8.DL1000Marker

2.2 紫花苜蓿遺傳轉化及檢測

2.2.1 植物表達載體CPB-LAR-GFP轉化農(nóng)桿菌 通過直接導入法將植物表達載體CPB-LAR-GFP轉化至根癌農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞中，挑取陽性單菌落搖菌并提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定(圖3)，得到1 089 bp(LAR基因)和714 bp(GFP基因)的條帶，與預期片段大小相符[17]。

圖3 轉LAR基因苜蓿愈傷的PCR檢測Fig.3 PCR identification of Trans LAR gene alfalfa callus注：1,15.DL2000Marker;2.陰性對照;3.水;4.陽性對照;5～14:轉基因苜蓿愈傷

2.2.2 苜蓿遺傳轉化及轉基因愈傷的獲得 苜蓿下胚軸外植體用制備好的菌液侵染10 min，吸干菌液，置于共培養(yǎng)基，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d，使農(nóng)桿菌攜帶的基因轉入苜蓿染色體中。之后轉入愈傷組織誘導培養(yǎng)基，一周后開始形成愈傷組織，轉基因愈傷仍能具有良好的細胞分裂和分化能力，25℃暗培養(yǎng)25 d后，轉入分化培養(yǎng)基，進行分化再生培養(yǎng)。

2.2.3 轉基因愈傷的PCR檢測 經(jīng)檢測，篩選培養(yǎng)后獲得的愈傷組織中大部分為轉基因愈傷。選取的10株抗性愈傷中有7株獲得了1 100 bp左右的LAR基因片段(圖4)。說明轉化的目的基因已整合到苜?；蚪M中。

圖4 CPB-LAR-GFP導入農(nóng)桿菌的PCR鑒定Fig.4 PCR analysis of CPB-LAR-GFP transformed Agrobacterium tumefaciens注：1,4.DL2000Marker;2,5.重組農(nóng)桿菌PCR結果(1 089 bp);3,6.重組農(nóng)桿菌PCR結果 (714 bp)

2.2.4 轉基因愈傷組織抗除草劑抗性鑒定 在轉化篩選培養(yǎng)基中加入適量的PPT利于篩選出轉基因植株。轉基因愈傷接種到含低濃度PPT(1.0 mg/L、2.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基上，對愈傷組織影響比較弱。當PPT濃度為3.0 mg/L時，部分苜蓿愈傷受到抑制，發(fā)生褐化。當PPT濃度大于4.0 mg/L時，培養(yǎng)20 d以后的苜蓿愈傷組織生長受到明顯抑制，隨著培養(yǎng)時間的延長，褐化嚴重，愈傷組織生長受到嚴重抑制，甚至死亡。因此，PPT濃度選擇3.0 mg/L。

2.2.5 轉基因愈傷組織的GFP熒光檢測 經(jīng)檢測含重組質(zhì)粒的苜蓿愈傷組織在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠光(圖5)，說明GFP基因在苜蓿愈傷組織中得到了高效表達。

圖5 轉基因愈傷GFP基因熒光表達Fig.5 Fluorescent expression of GFP gene of alfalfa transgenic callus

2.2.6 轉基因愈傷組織縮合單寧含量檢測 整合有LAR基因的苜蓿愈傷組織中縮合單寧的含量高于對照30.8%(圖6)，證明LAR基因的異源表達促進了紫花苜蓿原花青素的積累。進一步證明此次試驗構建的LAR基因植物表達載體可以用于提高苜蓿CT含量的種質(zhì)創(chuàng)新研究。

圖6 轉基因和未轉基因紫花苜蓿愈傷組織縮合單寧的含量Fig.6 Condensed tannins content in the transgenic and non-transgenic callus in alfalfa注：CK為未轉基因紫花苜蓿愈傷組織；HT1～HT6為轉基因紫花苜蓿愈傷組織

3 討論

3.1 CPB-LAR-GFP表達載體的特點

研究將無色花青素還原酶(LAR)基因和報告基因綠色熒光蛋白(GFP)基因同時連在已含有抗除草劑(bar)基因的載體CPB上，構建了植物表達載體CPB-LAR-GFP。GFP是被廣泛應用的報告基因[21-22]，連在目的基因啟動子之后，在不破壞細胞和不進行化學染色的情況下直接成像，根據(jù)GFP的熒光強度可以檢測目的基因的表達水平，而且能監(jiān)測基因表達和蛋白質(zhì)定位，檢測方便且快速?？箯V譜除草劑草丁膦的bar基因是目前廣泛使用的具有抗鋤草劑特性的報告基因，是一種能避免自身產(chǎn)物Bialaphos毒害的保護基因[23]。本研究構建的具有雙標記bar和GFP基因的LAR基因植物表達載體CPB-LAR-GFP，既具有抗除草劑性質(zhì)，又具有標記基因的功能。這樣既可提高篩選轉化細胞效率，同時使該載體轉化的植株獲得抗除草劑特性。研究也為進一步研究LAR基因的功能及其在縮合單寧合成中的作用奠定了基礎，也為擴充了苜蓿育種的基因庫資源，利用轉基因技術提高苜蓿品質(zhì)和性狀提供支撐[8,10]。

3.2 紫花苜蓿轉基因愈傷的篩選及LAR基因的功能分析

在研究匍匐剪股穎的轉化中[24]，利用卡那霉素作為選擇壓對轉基因植物進行篩選，但篩選效果不佳，造成后期轉基因植株的檢測工作量過大。試驗對轉基因愈傷進行逐級篩選。首先利用卡那霉素作為選擇壓，在愈傷組織誘導培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基均加入適當濃度的卡那霉素；隨后在分化培養(yǎng)基中添加一定濃度的PPT，部分愈傷發(fā)生褐化，生長受到抑制。這樣篩選出抗性愈傷組織，將其放入熒光顯微鏡下照射藍光，可以激發(fā)出綠色熒光的愈傷組織初步篩選成為轉基因愈傷，方便、簡化了后期轉基因愈傷的檢測工作，降低了工作難度。這樣可以發(fā)揮bar基因在此次研究構建的載體中的雙重功能，既作為抗除草劑基因，具有抗除草劑性質(zhì)；又作為標記基因，便于篩選出轉化體和非轉化體。研究發(fā)現(xiàn)，將bar基因轉入苜蓿中[25-26]，轉基因苜蓿對除草劑抗性明顯。此次研究與其研究結果一致，轉bar基因的紫花苜蓿愈傷組織具有抗除草劑特性，可以篩選出具有PPT抗性的愈傷組織。我們研究也發(fā)現(xiàn)，轉LAR基因的紫花苜蓿愈傷的縮合單寧含量明顯高于對照。由此推斷LAR基因在縮合單寧合成途徑中起著至關重要的作用，LAR基因直接影響了縮合單寧的合成，提高該基因的表達有利于合成縮合單寧，期望超量表達該基因以提高縮合單寧的含量。

4 結論

以LAR基因為靶序列，構建攜帶綠色熒光蛋白GFP和抗除草劑bar基因的雙標記選擇植物表達載體CPB-LAR-GFP，并導入農(nóng)桿菌。遺傳轉化紫花苜蓿，提取轉基因愈傷組織DNA，PCR擴增檢測到1 089 bp的LAR片段。PPT抗性試驗證明，構建的載體具有抗除草劑抗性，PPT臨界篩選濃度為3.0 mg/L時。熒光顯微鏡照射轉基因苜蓿愈傷組織呈現(xiàn)綠光。測定轉基因紫花苜蓿愈傷組織縮合單寧的含量明顯高于對照。初步證明轉LAR基因的紫花苜?？梢蕴岣呖s合單寧含量。這將為進一步研究LAR基因的表達與調(diào)控和培育具有抗除草劑和縮合單寧含量高的牧草新品種提供理論依據(jù)。

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Construction of CPB-LAR-GFP expression vector and its transformation in callus of alfalfa

CHEN Chun-yan1,2，MA Hui-ling1，DONG Wen-ke1，YANG Jiang-wei3，LI Yu-zhu1

(1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China； 2.CollegeofAgronomy,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China； 3.CollegeofLifeSciences,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

Leucoanthocyanidin reductase is a key enzyme in plant condensed tannins synthesis.The target was Leucoanthocyanidin reductase encoded by LAR gene,the expression vector was constructed with the double-marker expressing green fluoresce protein GFP gene and herbicide resistance bar gene.Transgenic alfalfa callus were obtained byAgrobacteriumtumefaciensmediated transformation,and the resistant callus were screened by PPT.The condensed tannins content in transgenic alfalfa callus was 30.8% higher than that of control.The recombinant gene had been transformed to alfalfa callus and played a physiological function.These research work will provide the fundamental information and the method for studying the regulation mechanism of condensed tannins synthesis and further alfalfa breeding through transgenic technology with character of resistance to herbicide and bloat disease.

Onobrychisviciaefoliacv.Gansu;leucoanthocyanidin reductase;herbicide resistance;green fluoresce protein;alfalfa;transformation

2016-04-21；

2016-05-16

甘肅省科技廳科技支撐計劃項目(1104NK CA087)；國家自然科學基金項目(41261013)和國家自然科學基金項目(31502012)資助

陳春艷(1977-)，女，甘肅蘭州人，實驗師，在讀博士研究生。 E-mail：ccy0713@126.com 馬暉玲為通訊作者。

Q 814.9；S 54

A

1009-5500(2017)01-0025-06