黃皮精油對(duì)蓮霧果實(shí)軟腐病抑制機(jī)理的初探

張史青，鐘曼茜，曾 鳳，從心黎

(海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，?？?570228)

黃皮精油對(duì)蓮霧果實(shí)軟腐病抑制機(jī)理的初探

張史青，鐘曼茜，曾 鳳，從心黎

(海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，?？?570228)

以‘黑金剛’蓮霧為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)蓮霧果實(shí)采后軟腐病病原菌進(jìn)行了分離純化，通過從黃皮葉子中提取的精油對(duì)軟腐病進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，研究黃皮精油對(duì)菌絲體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響，探討黃皮精油的抑菌機(jī)制。結(jié)果表明：不同濃度的黃皮精油對(duì)供試的蓮霧軟腐病均有抑制作用，其中0.6 μL/mL濃度下的抑菌率達(dá)到60.62%；0.6 μL/mL的黃皮精油處理后的菌絲體生長(zhǎng)稀疏，分支變少；黃皮精油對(duì)病原菌的細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生了顯著影響，可溶性蛋白和還原性糖含量減少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收受阻。綜合來看，初步明確了黃皮精油的抗菌機(jī)制，其中0.6 μL/mL濃度下的抑菌效果最佳。

蓮霧；軟腐病；黃皮；精油；抑菌效果

蓮霧是一種熱帶常綠果樹，我國(guó)廣東和海南等地大面積栽培[1]。蓮霧果皮薄，呼吸強(qiáng)度高，極其不耐貯藏且較易發(fā)生病害。引起蓮霧果實(shí)采后腐爛的大多數(shù)為真菌病害，主要有炭疽病、軟腐病等，目前國(guó)內(nèi)對(duì)軟腐病的研究工作僅限于對(duì)其形態(tài)學(xué)和常規(guī)的生理生化的研究，主要采取的防治措施包括培育抗病品種、使用化學(xué)藥劑等[2-3]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全的要求也越來越高，應(yīng)用綠色環(huán)保的生物保鮮劑會(huì)更加有利于鮮果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。吳新[3-4]研究表明，香芹酚、肉桂醛、紫蘇醛、沉香萜醇和異硫氰酸烯丙酯(AITC)等5種植物精油對(duì)常見的病原真菌、細(xì)菌等都有較為廣泛的抑菌作用。Smith-Palmer發(fā)現(xiàn)不同種植物精油混合使用或單一精油與其他抑菌物質(zhì)混合使用能發(fā)揮更顯著的抑菌效果。黃皮是海南普遍存在的植物材料，而以黃皮葉子提取的植物精油對(duì)蓮霧果實(shí)軟腐病抑制效果的研究未曾見到報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)蓮霧果皮上的軟腐病進(jìn)行分離鑒定，并用黃皮精油對(duì)其病原菌進(jìn)行抑菌測(cè)定，為蓮霧軟腐病的抑菌機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃皮葉子，采摘自海南黃皮種植基地，曬干、粉碎；‘黑金剛’品種蓮霧果實(shí)，九成熟、有病害、大小均勻，購自市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精油的提取 采用水蒸氣蒸餾法提取精油：稱取200 g干燥、粉碎的黃皮葉子粉末裝入2 000 mL蒸餾瓶中并加入蒸餾水1 400 mL，在蒸餾裝置中進(jìn)行蒸餾操作，蒸餾時(shí)間為4～6 h，至沒有油狀物滴出時(shí)停止蒸餾，靜置片刻，收集干燥后于4℃冰箱中黑暗條件下密封保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 黃皮精油抑菌活性的測(cè)定 以菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病的抑制效果。用高溫滅菌的培養(yǎng)基制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL/mL的帶精油培養(yǎng)基，對(duì)照加無菌水，倒大約 15 mL 帶精油培養(yǎng)基于直徑 90 mm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每處理重復(fù) 3 皿，冷卻后，接入已分離純化并生長(zhǎng) 3d的蓮霧軟腐病菌落，用直徑為 5 mm 的打孔器沿菌落的邊緣取菌餅接種于含有不同精油濃度梯度的培養(yǎng)皿中，每皿接1個(gè)菌餅，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于3 d 后用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑[4-5]，并計(jì)算其平均直徑，按式(1)計(jì)算黃皮精油的抑菌率。

1.2.3 病原菌致病力測(cè)定 釆用針刺法運(yùn)用柯赫氏法則進(jìn)行致病力測(cè)定。采取無傷與有傷2種接種方式，于每個(gè)蓮霧果實(shí)表面接種菌餅1個(gè)，均重復(fù)3次。

無傷接種：取PDA培養(yǎng)基的邊緣處生長(zhǎng)3d的病原菌，用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，移到接種的部位。有傷接種：先用無菌針在同一部位進(jìn)行針刺，共剌5個(gè)小孔，每孔約深0.2 mm。取PDA培養(yǎng)基邊緣處生長(zhǎng)3d的病原菌，用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，移到接種的部位。對(duì)照：接種方式同上，接種同樣大小的無菌PDA培養(yǎng)基到接種果實(shí)表皮。接種后于25℃條件培養(yǎng)觀察，每隔1d記錄剌傷接種病斑擴(kuò)展情況。同時(shí)，接種蓮霧果實(shí)發(fā)病后，從果實(shí)發(fā)病部位分離純化出病原菌，與最初分離純化且接種發(fā)病的菌株作對(duì)比，確認(rèn)分離物的一致性。

1.2.4 顯微鏡觀察菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 取供試軟腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在第3 d菌絲覆蓋整個(gè)平板后，用5 mm打孔器取菌餅5個(gè)接入 100 mL 液體培養(yǎng)基中，設(shè)置處理組和對(duì)照組，處理組加入60 μL最適濃度的黃皮精油，對(duì)照組加入相對(duì)應(yīng)滅菌的蒸餾水，將其置于 25 ℃、140 r/min振蕩箱中培養(yǎng)48 h，用0.2mol/L、pH=6.5的磷酸鹽緩沖液將菌絲充分去除培養(yǎng)基，取微量完整菌絲在顯微鏡下觀察記錄[6]。

1.2.5 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定 取供試軟腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在第3 d菌絲覆蓋整個(gè)平板后，用5 mm打孔器取菌餅5個(gè)接入 100 mL 液體培養(yǎng)基中，將其置于 25 ℃、140 r/min振蕩箱中培養(yǎng)48 h，用0.2mol/L、pH=6.5的磷酸鹽緩沖液將菌絲充分去除培養(yǎng)基[6]，設(shè)置處理組和對(duì)照組。處理組把菌絲定量加到最適濃度的黃皮精油培養(yǎng)基中，對(duì)照組把菌絲定量加到滅菌的培養(yǎng)基中。室溫下放置0、1.5、3、4.5、6、7.5 h后，依照謝麗等[7-8]的方法測(cè)定電導(dǎo)率。

1.2.6 還原性糖含量的測(cè)定 取供試軟腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在第3 d菌絲覆蓋整個(gè)平板后，用5 mm打孔器取菌餅5個(gè)接入100 mL 液體培養(yǎng)基中，設(shè)置處理組和對(duì)照組，處理組加入60 μL最適濃度的黃皮精油，對(duì)照組加入相對(duì)應(yīng)滅菌的蒸餾水，將其置于 25 ℃、140 r/min振蕩箱中進(jìn)行培養(yǎng)。樣品中還原糖量的測(cè)定：參照王學(xué)奎和黃見良[9]的方法測(cè)定。

1.2.7 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 取供試軟腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在第3 d菌絲覆蓋整個(gè)平板后，用5mm打孔器取菌餅5個(gè)接入 100 mL 液體培養(yǎng)基中，設(shè)置處理組和對(duì)照組，處理組加入60 μL最適濃度的黃皮精油，對(duì)照組加入相對(duì)應(yīng)滅菌的蒸餾水，將其置于 25 ℃、140 r/min振蕩箱中進(jìn)行培養(yǎng)。樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：參照王學(xué)奎和黃見良[9]的方法測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測(cè)定

通過結(jié)果可知，以針刺法接種的蓮霧果實(shí)均能發(fā)病。刺傷接種3～4d后可觀察到病害癥狀，出現(xiàn)白色菌絲和深色凹陷病斑，后期果肉顏色變深呈水漬狀。無傷接種組發(fā)病較晚，5～6d后果實(shí)才出現(xiàn)明顯病斑，8d后出現(xiàn)水漬狀現(xiàn)象和黑色小點(diǎn)，相對(duì)于針刺接種發(fā)病有明顯的延后。而PDA培養(yǎng)基接種的對(duì)照組則不發(fā)病。對(duì)發(fā)病果實(shí)進(jìn)行再分離，確定了病原物的一致性。

2.2 不同濃度的黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病抑制效果

圖1表明，不同濃度黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病菌絲生長(zhǎng)的抑制程度不同。當(dāng)濃度為0.6μL/mL時(shí)，對(duì)蓮霧軟腐病的抑制率可達(dá)到48.99%，且與其他精油濃度存在顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)精油濃度為0.8μL/mL時(shí)，抑菌效果減弱，僅為33.49%，因此黃皮精油抑制蓮霧軟腐病的最適濃度為0.6μL/mL。

圖1 不同濃度精油對(duì)蓮霧軟腐病的抑菌效果 注：a、b、c不同處理均值存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病菌絲顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

在圖2中，通過低倍鏡，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)稠密，處理組菌絲體生長(zhǎng)稀疏；通過高倍鏡，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)正常，菌絲飽滿，經(jīng)黃皮精油處理的菌絲分叉、斷裂變短，說明黃皮精油對(duì)蓮霧果實(shí)軟腐病菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成抑制，阻礙其生長(zhǎng)發(fā)育。

2.4 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病病原菌相對(duì)電導(dǎo)率的影響

如圖3，從第0 h開始，對(duì)照組與處理組相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中處理組相對(duì)電導(dǎo)率高于對(duì)照組；從1.5 h起，處理組相對(duì)電導(dǎo)率變化幅度大于對(duì)照組，說明處理組的變化趨勢(shì)大于對(duì)照組；在4.5 h時(shí)處理組的相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到44.10 μs/cm，顯著大于對(duì)照組的電導(dǎo)率，兩者存在極顯著性差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過黃皮精油處理的軟腐病病原菌的相對(duì)電導(dǎo)率大于對(duì)照組。

2.5 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病病原菌還原性糖的影響

通過圖4可知，從第0h開始，處理組與對(duì)照組還原性糖含量的變化趨勢(shì)均是先下降后上升，24～48 h時(shí)還原性糖含量急劇下降，48 h時(shí)對(duì)照組的還原糖含量為332.75 μg/mL，而處理組還原糖濃度為349.15 μg/mL，兩者之間存在顯著性差異(P<0.05)，這說明培養(yǎng)基中

圖2 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病菌絲形態(tài)的影響注：A：空白對(duì)照菌絲×20；B：空白對(duì)照菌絲×40；C：處理菌絲樣品×20；D：處理菌絲樣品×40

圖3 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病相對(duì)電導(dǎo)率的影響

圖4 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病病原菌還原糖的影響

圖5 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病病原菌可溶性蛋白含量的影響

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗嚴(yán)重，菌絲生長(zhǎng)達(dá)到頂峰；48～96 h處理組還原糖含量持續(xù)上升，在72h時(shí)達(dá)到最大值。經(jīng)過持續(xù)的下降后，在72～96 h對(duì)照組含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

2.6 黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病病原菌可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5可知，從第0h開始，處理組與對(duì)照組可溶性蛋白含量逐漸降低；24 h時(shí)處理組與對(duì)照組可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)差異，處理組開始升高，而對(duì)照組含量持續(xù)降低，在48h時(shí)處理組可溶性蛋白含量為10.88μg/mL，而對(duì)照組含量?jī)H為1.02 μg/mL，兩者存在顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

陳前等[9-11]運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)蓮霧病原菌進(jìn)行了鑒定并研究其病原菌的生物學(xué)特性，證明了蓮霧果實(shí)軟腐病病原菌有比較強(qiáng)的適應(yīng)能力和生存能力。Prasad KN 等發(fā)現(xiàn)，黃皮中的香豆素類化合物具有很好的抗氧化活性；本次實(shí)驗(yàn)分離純化出蓮霧果實(shí)上的軟腐病并進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，采取菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)黃皮精油進(jìn)行抑菌測(cè)定和利用顯微鏡對(duì)菌絲進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)證明：黃皮精油對(duì)軟腐病病原菌有抑制作用，且不同濃度的精油對(duì)菌絲有不同的抑制程度，最適精油濃度為0.6μL/mL；此外，大于0.8μL/mL的精油濃度反而使抑菌效果減弱。

菌絲在不同條件下培養(yǎng)，菌絲的結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)速度等特征存在一定的差別，菌絲的顯微結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生細(xì)微的變化[11，14，16]。通過顯微觀察菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)0.6 μL/mL的黃皮精油處理后的菌絲體生長(zhǎng)稀疏，菌絲體數(shù)量減少，分支較少，說明黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有明顯的破壞效果，即黃皮精油對(duì)其生長(zhǎng)具有抑制作用。當(dāng)病原菌遇到抑制生長(zhǎng)作用時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而菌體的保護(hù)被打破，其內(nèi)部電解質(zhì)會(huì)滲入到培養(yǎng)液中，導(dǎo)致培養(yǎng)液的電導(dǎo)率升高，因此驗(yàn)證0.6 μL/mL的黃皮精油對(duì)蓮霧果實(shí)軟腐病的抑制效果，可以通過培養(yǎng)液中電導(dǎo)率的變化來反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，處理組的電導(dǎo)率總體呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)且遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，說明黃皮精油對(duì)菌絲細(xì)胞膜具有破壞作用，胞內(nèi)離子的外滲導(dǎo)致電導(dǎo)率的上升。

還原性糖和可溶性蛋白是病原菌能量的來源，試驗(yàn)結(jié)果表明，處理組菌絲的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到黃皮精油破壞，胞內(nèi)物質(zhì)的外滲造成中后期蛋白含量和還原糖含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，證明了黃皮精油對(duì)蓮霧軟腐病原菌具有一定的抑制作用。而對(duì)照組在后期蛋白含量和還原糖含量的上升，是由于菌絲呈現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)，細(xì)胞大量死亡，胞內(nèi)物質(zhì)釋放造成。

綜上來看，從葉子中提取的黃皮精油具有較好的抑菌活性，再加上黃皮是我國(guó)普遍存在且非常易得的植物，開發(fā)成本低廉，在資源開發(fā)和果蔬保鮮技術(shù)方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Inhibition Mechanism of Essential Oil ofClausenalansiumfor Soft Rot of Wax-apple Fruits

ZHANG Shi-qing，ZHONG Man-xi，ZENG Feng，CONG Xin-li

(College of Horticulture and Landscape，Hainan University，Haikou 570228，China)

Taking‘Heijingang’wax apples as the test object，the soft rot pathogen has been separated and purified after harvesting the wax apple fruit.Based on the testing result of anti-fungal activity of the essential oil(EO)extracted from the foliage ofClausenalansiumagainst soft rot，we analyzed influence of such essence oil on both the form and structure of mycelia to probe into the antibacterial mechanism of essential oil ofClausenalansium.The results showed all essential oil ofClausenalansiumof different concentrations displayed antibacterial effects over the testing soft rot and the inhibition rate of 0.6 μL/mL EO reached 60.62%.The mycelium processed with 0.6 μL/mL EO was sparse with less branches.Essential oils ofClausenalansiumhad significant impacts over the permeability of pathogenic fungus membrane，which reduced the content of soluble protein and reducing sugar and hindered the fungus’s absorption of nutrients.To conclude，we identified the antibacterial mechanism of essential oils ofClausenalansiumpreliminarily and found 0.6 μL/mL EO had the best antibacterial effect.

wax apple；soft rot；Clausenalansium；essential oil；antibacterial effect

海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：ZDYF2016090)。

張史青(1991— )，男，碩士，研究方向：果蔬采后生理與貯藏技術(shù)。

從心黎(1980— )，女，博士，副教授，研究方向：果蔬采后生理與貯藏技術(shù)。