不同初始pH值對(duì)保加利亞乳桿菌關(guān)鍵蛋白酶基因表達(dá)的影響

張鴻超，逄詩玥，王海梅，韓巍巍2，姜瞻梅，杜鵬，侯俊財(cái)

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；2.哈爾濱豐瑞生物科技有限公司，哈爾濱150036）

不同初始pH值對(duì)保加利亞乳桿菌關(guān)鍵蛋白酶基因表達(dá)的影響

張鴻超1，逄詩玥1，王海梅1，韓巍巍2，姜瞻梅1，杜鵬1，侯俊財(cái)1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；2.哈爾濱豐瑞生物科技有限公司，哈爾濱150036）

由于保加利亞乳桿菌自身不能直接利用外源蛋白，其必須通過蛋白水解體系外源蛋白質(zhì)，生成供菌體正常生長需要的短肽和游離氨基酸。選擇具有高蛋白水解活力的6株保加利亞乳桿菌作為供試菌種。將菌株接種于不同初始pH值的滅菌脫脂乳中，在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，探討保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中關(guān)鍵蛋白酶基因表達(dá)情況。結(jié)果表明：在脫脂乳體系中，初始pH值對(duì)保加利亞乳桿菌蛋白水解關(guān)鍵酶基因的表達(dá)存在顯著影響，隨著初始pH值的升高菌株KLDS 1.0501，1.9201，1.9203和1.0208的各基因表達(dá)量均上調(diào)，在pH=6.5時(shí)，部分基因表達(dá)量繼續(xù)上調(diào)，且各菌株間蛋白基因表達(dá)有較大差異。

保加利亞乳桿菌；蛋白水解體系；基因表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指能夠在厭氧或兼性厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的菌。保加利亞乳桿菌是典型的乳酸菌，是酸乳發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸菌和產(chǎn)香菌[1]。乳酸菌的生長代謝需要利用小肽及游離氨基酸[2]，并依賴自身的蛋白水解體系[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌蛋白水解體系的結(jié)構(gòu)特征和乳球菌相似[5-7]。Picon等人[8]發(fā)現(xiàn)很多株菌中含有兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。Henriksen等人[9]通過對(duì)蛋白水解酶基因進(jìn)行基因修飾得到水解能力更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株。目前為止對(duì)保加利亞乳桿菌的蛋白水解酶體系相關(guān)酶基因表達(dá)量的研究較少[10]。本文旨在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，探討不同發(fā)酵初始pH值條件下保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中關(guān)鍵蛋白酶基因（prtB，oppD，pepC，pepF，pepQ，pepX，pepT）表達(dá)情況。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料與設(shè)備

菌種：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存的德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）KLDS 1.0207，1.0501，1.1007，1.9201，1.9203和1.0208。

試劑：復(fù)原脫脂乳，EDTA·2Na(Amresco)，鄰苯二甲醛，DEPC，鄰苯二甲醛，RNA prep pure培養(yǎng)細(xì)菌總RNA提取試劑盒，PrimerScript?RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒。

設(shè)備：離心機(jī)，PCR儀，電泳儀，紫外分光光度計(jì)，實(shí)時(shí)定量PCR儀。

1.2驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌蛋白水解活力的測定

蛋白水解活力的測定參照Church[11]的鄰苯二甲醛（OPA）方法。將活化好的菌株按2%接種于滅菌脫脂乳中，37℃培養(yǎng)。每隔2 h取樣品2 mL，加入4 mL濃度為0.75 mol/L三氯乙酸溶液，漩渦混勻，6 000 g離心5 min。取150 μL上清液與3 mL OPA試劑混合并開始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5 min，在340 nm波長下比色[12]。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)與合成

以16S rRNA作為管家基因[13-14]，根據(jù)GenBank提供的Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusATCC 11842的 DNA序 列（GenBank accession number:NC_ 008054.1）中相應(yīng)基因的序列，采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)16S rRNA，prtB，oppD，pepC，pepF，pepQ，pepX和pepT基因的引物序列進(jìn)行合成（見表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2.3 提取總RNA及其完整性和純度的檢測

在90 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%檸檬酸三鈉溶液中加入10 mL發(fā)酵乳，混合均勻后取10 mL懸浮液6 000×g離心5 min，溫度為4℃，除去上清液后對(duì)菌體進(jìn)行收集[15]。根據(jù)RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)菌總RNA提取試劑盒操說明書立即抽取樣品中的總RNA。

對(duì)樣品進(jìn)行溴乙錠(EB)染色后，取3 μL提取的RNA和2 μL的Loadingbuffer點(diǎn)樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳（150 V，5 min），通過CDS8000型凝膠分析系統(tǒng)成像后，觀察電泳條帶23 s和16 s的性狀判斷RNA的完整性。通過測定260 nm和280 nm處提取的RNA的吸光度，并計(jì)算OD260/OD280的比值來判定RNA的純度。

1.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

提取的總RNA利用PrimerScript?RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA樣本于-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩T反應(yīng)體系如表2所示。

表2 RT反應(yīng)體系

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Takara）和ABI7500 Fast Real-Time PCR System對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定。本實(shí)驗(yàn)使用兩步法標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增程序，反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL；ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL；PCR Forward Primer（10 μmol/ L）0.4 μL；PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL；cDNA模板（稀釋10倍）2 μL；RNase Free dH2O 6.8 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件為：95℃（30 s）預(yù)變性；95℃（5 s），60℃（34 s），40次循環(huán)PCR反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)在不同體系樣品中重復(fù)3次。

1.2.6 不同初始pH值對(duì)基因表達(dá)的影響

在滅菌脫脂乳中接入活化后的6株菌各2%，滅菌脫脂乳的pH值分別為5.6，5.9，6.2，6.5。在37℃環(huán)境下發(fā)酵12 h后分別提取各樣本菌體的RNA。對(duì)提取的RNA進(jìn)行完整性和濃度檢測，對(duì)樣品反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，每組重復(fù)3次。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析

對(duì)基因的CT值進(jìn)行測定，利用2-△△CT法對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估。反應(yīng)中的每個(gè)目的基因和內(nèi)參基因在不同樣本重復(fù)3次，取平均值，從而計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

將每個(gè)待測樣品均重復(fù)3次，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan方法進(jìn)行多重比較，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1保加利亞乳桿菌的蛋白水解曲線

圖1為保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力變化曲線。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），且其水解曲線的線性基本一致。蛋白水解活力最強(qiáng)的菌種為KLDS 1.9201，蛋白水解活力最弱的為KLDS 1.0207。以L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算（相當(dāng)于亮氨酸）游離氨基酸的濃度，培養(yǎng)12 h時(shí)菌株KLDS 1.9201，1.0208，1.0501，1.9203，1.1007和 1.0207分 別 為384.33±0.001，255.50±0.000，181.50±0.002，164.15± 0.002，155.83±0.001和（92.17±0.002）mg/L。

圖1 蛋白水解活力變化曲線

2.2RNA的純度和完整性測定分析

由于RNA的純度和完整性關(guān)系到之后的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率和實(shí)時(shí)熒光PCR測定，因此，本實(shí)驗(yàn)首先通過測定提取保加利亞乳桿菌各樣本RNA的OD260和OD280值來確定其純度，并通過1%瓊脂凝膠電泳來確定其完整性。實(shí)驗(yàn)中測得的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，這表明所提取的RNA中沒有DNA和蛋白質(zhì)的殘留，純度較高。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂凝膠電泳的結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，23S RNA和16S RNA條帶清晰，5S RNA條帶較暗，這一結(jié)果說明RNA樣品質(zhì)量完好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證總RNA的提取是否成功和引物特異性是否完好，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA與管家基因和目的基因引物進(jìn)行了普通PCR實(shí)驗(yàn)和1%瓊脂凝膠電泳。結(jié)果顯示反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA未受污染，引物特異性良好（見圖3）。

圖2RNA電泳樣品結(jié)果

圖3 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA普通PCR電泳結(jié)果

2.3不同初始pH值對(duì)蛋白水解關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

不同初始pH值對(duì)蛋白水解體系關(guān)鍵酶基因表達(dá)結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，總體上基因表達(dá)是隨著初始pH值的升高且上調(diào)的，其中菌株KLDS 1.0207和KLDS 1.1007的基因表達(dá)量隨著初始pH值升高的變化是先下調(diào)再上調(diào)，當(dāng)初始pH值為5.6時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，初始pH值為6.2時(shí)表達(dá)量最低，初始pH值為6.5時(shí)表達(dá)量開始緩慢上調(diào)。在初始pH值為5.6進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，菌株KLDS 1.0207和1.1007的prtB和oppD基因表達(dá)量最大；在初始pH值為5.9培養(yǎng)時(shí)，菌株KLDS 1.1007基因表達(dá)量最大；在初始pH值為6.2時(shí)，菌株KLDS 1.9201，1.9203和1.0208表達(dá)量最大；且與各自對(duì)照組相比分別上調(diào)18.86倍、2.22倍和6.60倍；在初始pH值為6.5時(shí)，菌株KLDS 1.0207和1.0501的pepC基因表達(dá)量和菌株KLDS 1.0501的基因表達(dá)量達(dá)到最大，且以上菌株與各自對(duì)照組（初始pH值為5.6）相比較都存在顯著差異（P＜0.05）。此外，菌株KLDS 1.0501，1.9201，1.9203和1.0208中pepQ和pepT基因在高初始pH值時(shí)表達(dá)量顯著高于低初始pH值時(shí)的表達(dá)量（P＜0.05）。

圖4 不同初始pH值培養(yǎng)下關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)

3 討論

雖然乳酸菌不能直接利用外源蛋白，但其自身具有高效的蛋白水解體系，能夠?yàn)槠渖L代謝提供足夠的游離氨基酸，從而改善機(jī)體對(duì)發(fā)酵乳中乳蛋白的吸收和利用，同時(shí)還賦予了發(fā)酵乳制品更高的營養(yǎng)價(jià)值。Gilbert等[16]研究表明乳桿菌屬在脫脂乳中的生長狀態(tài)更好，且乳酸桿菌的蛋白水解能力明顯高于乳酸球菌；黃昌良等[17]發(fā)現(xiàn)單從菌落總數(shù)來說，以乳清加6%脫脂奶粉作為培養(yǎng)基最好；周德慶[18]發(fā)現(xiàn)其生長繁殖過程中需要多種維生素等生長因子，尤其是B族維生素，如吡哆酸、谷氨酸、葉酸等。Rina Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MRS基質(zhì)的pepP基因在低pH值（2.5）時(shí)的表達(dá)水平低于高pH（6.4）的表達(dá)水平。劉桂芳等[20]在蛋白水平上研究發(fā)現(xiàn)，在不同pH條件下不同菌株水解酪蛋白的能力存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著初始pH值的升高，保加利亞乳桿菌KLDS 1.0501、1.9201、1.9203和1.0208的prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX和pepT基因表達(dá)量均上調(diào)，部分基因在pH值為6.5時(shí)部分基因的表達(dá)量能夠繼續(xù)上調(diào)。這可能是由于初始pH值為6.2和6.5是菌體生長繁殖的最適pH值，可使菌體快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期或者穩(wěn)定期；另外，初始pH值為5.6和5.9會(huì)抑制菌體生長，使菌體緩慢生長。本文研究結(jié)果與劉桂芳等的研究結(jié)果一致。Stressler等[21]研究了溫度和pH值對(duì)Lactobacillus helveticusATCC 12046的pepX和pepN的活性和熱穩(wěn)定的影響，發(fā)現(xiàn)pepX在40～50℃之間和pH值為6.0～7.0之間活性較高。因此，保加利亞乳桿菌蛋白水解活力和蛋白水解體系關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平存在顯著差異，這可能受生長環(huán)境pH值和自身生物學(xué)特性的影響。

另外，隨著培養(yǎng)體系pH值降低至一定值，菌體胞內(nèi)pH值的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，胞內(nèi)pH值隨之降低，則菌體將無法正常生長和代謝，甚至死亡，同時(shí)菌體代謝物的產(chǎn)量也受到影響，即菌體生長受抑制程度還與菌株的特性息息相關(guān)[22]。保加利亞乳桿菌屬同型發(fā)酵性乳酸菌，馬靜等[23]認(rèn)為pH值是影響乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的重要因素之一，培養(yǎng)基的初始pH值和控制培養(yǎng)過程中的pH值都會(huì)影響胞外多糖的最終產(chǎn)量。王立平[24]等認(rèn)為菌株水解酪蛋白的能力受pH值的影響，在酪蛋白和菌株共培養(yǎng)過程中，Lactobacillus helveticus9水解酪蛋白時(shí)產(chǎn)生的一定量的氨基酸殘基會(huì)降低酪蛋白水解液的pH值，通過滴加NaOH溶液調(diào)節(jié)酪蛋白溶液的pH值，使菌體的蛋白酶維持在較適pH值范圍內(nèi)，可以提高菌株蛋白水解度，這樣有利于多肽的生成。

本文就初始pH對(duì)保加利亞乳桿菌蛋白水解體系相關(guān)基因表達(dá)水平的影響進(jìn)行了初步探討，但是菌體在脫脂乳中生長時(shí)，可產(chǎn)生乳酸及少量的醋酸、丙酸、酪酸、異戊酸、己酸、辛酸和癸酸等揮發(fā)性酸[25-28]。脫脂乳體系的pH會(huì)隨著乳酸、氨基酸殘基和有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物的增加而變化，從而影響蛋白酶基因的表達(dá)和蛋白酶的活性。因此，在恒定pH值環(huán)境下培養(yǎng)菌體，其蛋白酶基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)和在蛋白水平的活性有待進(jìn)一步研究。

[1]許本發(fā).酸奶和乳酸菌飲料加工[M].北京:中國輕工業(yè)出版社, 2994：13-20.

[2]CHOPIN A.Organization and regulation of genes for amino acid biosynthesis inLactic acid bacteria[J].FEMS Microbiology Reviews, 1993,12(1):21-37.

[3]TASKALIDOU E,ANASTASIOU R,VANDENBERGHE I,et al. Cell-wall-bound proteinase ofLactobacillus delbrueckiisubsp. LactisACA-DC178 characterization and specificity forβ-Casein [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(5): 2035-2040.

[4]JUILLARD V,LAAN H,KUNJI R,et al.The extracellular PI-type proteinase ofLactococcus lactishydrolyzes beta-casein into more than one hundred different oligopeptides[J].Journal of Bacteriology, 1995,177(12):3472-3478.

[5]ERIC G,PIERRE R,EHRLICH S D,et al.Transcriptional pattern of genes coding for the proteolytic system ofLactococcus lactisand evidence for coordinated regulation of key enzymes by peptide supply [J].Journal of Bacteriology,2001,183(12):3614-3622.

[6]CHRISTENSEN J E,DUDLEY E G,PEDERSIN J A,et al.Peptidases and amino acid catabolism inLactic acid bacteria[J].Antonie van Leeuwenhoek,1999,76:217-246.

[7]ROLAND J S.Multi-Domain,cell-envelope proteinases of lactic acid bacteria[J].Antonie van Leeuwenhoek,1999,76:139-155.

[8]PICON A,GARCIA-CASADO M A,NUNEZ M.Proteolytic activities,peptide utilization and oligopepetide transport systems of wild Lactococcus lactisstrains[J].International Dairy Journal,2010,20(3): 156-162.

[9]HENRIKSEN M E,NILSSOND.Industrial application of genetically medified microorganisms:gene technology at Chr.Hansen A/S[J].Internation Dairy Jounrnal,1999,9:17-23.

[10]MAYO B,KOK J,VENEMA K,et al.Molecular cloning and sequence analysis of the X-propyl dipeptidyl aminopeptidase gene from Lactococcus lactis subsp.Cremoris[J].Applied and Environmental Microbiology,1991,57(1):38-44.

[11]CHURCH F C,SWAISGOOD H E,PORTER D H,et al.Spectrophotometric assay using O-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J].Journal of Dairy Science,1983,66(6):1219-1227.

[12]呂加平,駱承庠,劉鳳民.乳酸菌蛋白水解力的測定及研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,30(1):68-74.

[13]TAKLE G W,TOTH I K,BRUBERG M B.Evaluation of reference genes for real-time RT-PCR expression studies in the plant pathogen pectobacterium atrosepticum[J].BMC Plant Biology,2007, 7(1):50.

[14]BRON P A,MARCO M.HOFFER S M,et al.Genetic characterization of the bile salt response inLactobacillus plantarumand analysis of responsive promoters in vitro and in situ in the gastrointestinal tract[J].Journal of Bacteriology,2004,186(23):7829-7835.

[15]GENAY M,SADAT L,GAGNAIRE V,et al.prtH2,not prtH,is the ubiquitous cell wall proteinase gene inLactobacillus helveticus [J].Applied and EnvironmentalMicrobiology,2009,75(10): 3238-3249.

[16]GILBERT C,ATLAN D,BLANC B,et al.A new cell surface proteinase:sequencing and analysis of the prtB gene fromLactobacillus delbruekiisubsp.bulgaricus[J].Journal of Bacteriology,1996,178 (11):3059-3065.

[17]黃良昌,呂曉玲,邢曉慧.酸奶發(fā)酵劑的研究進(jìn)展[J].廣州食品工業(yè)科技,2002,17(3):4.

[18]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京:高等教育出版社,1999：169-175.

[19]WU R,ZHANG W,SUN T,et al.Proteomic analysis of responses of a new probiotic bacteriumLactobacillus caseiZhang to low acid stress[J].International Journal of Food Microbiology,2011, 147(3):181-187.

[20]劉桂芳.嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌β-半乳糖苷酶和蛋白水解活性的研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[21]STRESSLER T,EISELE T,SCHLAYER M,et al.Characterization of the recombinant exopeptidases PepX and PepN fromLactobacillus helveticusATCC 12046 important for food protein hydrolysis [J].PloS One,2013,8(7):e70055.

[22]熊素玉,姚新奎,譚小海，等.不同溫度及pH條件對(duì)乳酸菌生長影響的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,43(6):533-538.

[23]馬靜,裴家偉,吳榮榮，等.影響乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的因素研究[J].中國乳品工業(yè),2003,(5):12-16.

[24]王立平,廖玲,高莉莉.Lactobacillus helveticus9的酪蛋白水解作用研究[J].食品科學(xué),2008,29(7):286-290.

[25]孫震,張碩,謝晴.雙歧桿菌免疫學(xué)檢測方法的研究[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),1999,18(1):28～32.

[26]周儉.保健食品設(shè)計(jì)原理及其應(yīng)用[M].北京：中國輕工業(yè)出版社, 1998：114-141.

[27]MORISAKI I,MICHALEK G,MARMAN G.Effective immunity to dental caries:Enhancement of salivary anti-Streptococcus mutans antibody with oral adjuvants[J].Infect.Immum,1983,40:577.

[28]SVENNERHOLM A,LANGE S AND HOLMGREN.Intestinal immune response to cholera toxin:dependence on route and dosage of antigen for priming and boosting[J].Infect.Immum,1980,30: 337.

Effect of different initial pH on gene expressions of key proteolytic enzyme of Lactobacillus bulgaricus

ZHANG Hongchao1，PANG Shiyue1，WANG Haimei1，HAN Weiwei2，JIANG Zhanmei1，DU Peng1，HOU Juncai1
(1.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2. Harbin Fengrui Shengwukeji Co.Ltd.,Harbin 150036,China)

Lactic acid bacteria(LAB)obtain all the necessary small peptides and free amino acids by their complex proteolytic system,because LAB itself can not directly use the exogenous proteins.In this study,six Lactobacillus bulgaricu strains(KLDS 1.0207,1.0501,1.1007,1.9201, 1.9203,and 1.0208)which had different initial pH values(5.6,5.9,6.2,6.5)incubated in skim milk were to analyze the dynamic changes of the genes expressions of the key proteinase(prtB,oppD,pepC,pepF,pepQ,pepX and pepT)at the mRNA transcription level using the real-time quantitative PCR technique.The effects of initial pH on key proteolytic enzyme genes expression among the six strains was significant(P＜0.05),it was up-regulated that the genes expression of the key proteolytic enzyme for the strains KLDS 1.0501,1.9201,1.9203 and 1.0208 with the increase of initial pH in skim milk.Meanwhile,some genes increased continuously at the initial pH6.5,significant differences in which are also observed.

Lactobacillus bulgaricus;proteolytic system;gene expression;real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR)

Q933

A

1001-2230（2017）02-0008-04

2016-07-01

黑龍江省新世紀(jì)人才項(xiàng)目資助（1253-NCEF-006）。

張鴻超（1992-），女，碩士，研究方向?yàn)槭称饭こ獭?/p>

侯俊財(cái)