貓免疫缺陷病毒的病毒載體研究進(jìn)展

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

貓免疫缺陷病毒的病毒載體研究進(jìn)展

艾有為，王亞君，潘美喬，馬建章

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

Niels Pedersen等人于1987年在家貓?bào)w內(nèi)發(fā)現(xiàn)了貓免疫缺陷病毒，并證實(shí)該病毒是貓艾滋病(AIDS)的病原。該病毒在形態(tài)學(xué)、Mg2+依賴的逆轉(zhuǎn)錄酶活性、在貓?bào)w內(nèi)的持續(xù)感染性以及基因組結(jié)構(gòu)等方面的特點(diǎn)，都與慢病毒極其相似，因此將之分為慢病毒的一員。由于該病毒引起貓科動(dòng)物的免疫缺陷綜合征與人1型免疫缺陷病毒(HIV－1)引起的艾滋病的密切相關(guān)性，可以將貓作為研究HIV－1的動(dòng)物模型。因此，貓免疫缺陷病毒(FIV)開始受到廣泛的關(guān)注［1］。

1 FIV基因組結(jié)構(gòu)

FIV基因組RNA由大約9 500個(gè)核糖核苷酸組成。基因組兩端為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，長(zhǎng)355 bp到361 bp，分成U3、R和U5這3個(gè)部分。同其他慢病毒一樣，F(xiàn)IV的3個(gè)主要開放閱讀框(ORF)，分別是gag、pol和env。gag基因長(zhǎng)約1 350 bp，先翻譯形成大約50 kD的核心蛋白前體，隨后在病毒蛋白酶的作用下該蛋白前體被水解為基質(zhì)蛋白(MA)、衣殼蛋白(CA)和核衣殼蛋白(NA)。pol基因與gag基因的3'末端重疊109 bp，編碼病毒生命周期中需要的幾種酶。env基因編碼囊膜表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)。除了3個(gè)主要ORF外，F(xiàn)IV還含幾個(gè)類似HIV的小ORF，Vif、orf2和rev［2－3］。

2 FIV常見的兩種病毒載體

所謂病毒載體，是指利用分子克隆的方法將病毒基因連接到特殊的表達(dá)載體上，構(gòu)建的載體可以用于病毒拯救。即在載體的驅(qū)動(dòng)下病毒基因獲得轉(zhuǎn)錄或翻譯等過(guò)程，一方面生成病毒遺傳物質(zhì)，另一方面翻譯病毒蛋白裝配成病毒。這是我們常說(shuō)的反向遺傳操作技術(shù)。這種研究方法與經(jīng)典病毒學(xué)研究方法思路相反，能夠?qū)崿F(xiàn)從基因型到表型的研究。目前絕大部分FIV載體的構(gòu)建主要都是基于34TF10質(zhì)?；蛞愿脑斓?4TF10為參照進(jìn)行操作［4－5］。

常見的病毒載體分為病毒報(bào)告系統(tǒng)和基因治療系統(tǒng)兩種。為提供具有進(jìn)入和整合能力的病毒又減少病毒部分的加入，同時(shí)攜帶外源基因的一套系統(tǒng)，這套系統(tǒng)往往由3個(gè)質(zhì)粒構(gòu)成:包裝質(zhì)粒提供病毒結(jié)構(gòu)蛋白、穿梭質(zhì)粒提供精簡(jiǎn)的基因組以及修飾基因，還有一個(gè)表達(dá)廣嗜性細(xì)胞進(jìn)入的囊膜蛋白VSV－G的質(zhì)粒，又稱為in trans載體系統(tǒng)［6］。

2．1 基因治療載體的構(gòu)建

C載體為包裝質(zhì)粒，為病毒提供蛋白結(jié)構(gòu)。D載體為穿梭質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)奇特的發(fā)卡結(jié)構(gòu)與gag蛋白相互作用包裝進(jìn)病毒樣顆粒中，如圖1所示。

C載體將病毒LTR換成強(qiáng)活動(dòng)性的CMV(人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子)使FIV病毒蛋白在人細(xì)胞中高效表達(dá)。在gag前端添加了一個(gè)常規(guī)的拼接捐贈(zèng)位點(diǎn)(9 bp)，在pol和rev間選擇性插入拼接捐贈(zèng)位點(diǎn)和拼接接受位點(diǎn)，使得rev蛋白的表達(dá)不受gag－pol多聚蛋白的干擾;病毒序列起始于gag的ATG，終止于rev的TAA。Rev兩個(gè)表達(dá)序列中間為RRE，調(diào)節(jié)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。在rev后具有poly(A)的尾巴的BGH結(jié)構(gòu)提供翻譯終止信號(hào)。

D載體中由R、U5及后續(xù)非編碼區(qū)和gag蛋白的前230 bp組成病毒基因的包裝信號(hào)，更換啟動(dòng)子的時(shí)候，保留R、U5的部分而替換U3部分。在RRE和第二個(gè)啟動(dòng)子間插入了cPPT－CTS(central DNA flap)，此區(qū)域不僅對(duì)反轉(zhuǎn)錄很重要，而且參與整合前復(fù)合物(PIC)的核輸入分裂或者非分裂細(xì)胞的過(guò)程。其中，gene1可以根據(jù)需要進(jìn)行克隆或者替換，用于基因治療時(shí)常將eGFP換成需要修飾的基因，通過(guò)載體輸入目的細(xì)胞獲得表達(dá)。Gene2通常為一些抗性基因，用于建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選。在gene1和gene2之間的小RNA病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的插入使得兩段基因同時(shí)獲得表達(dá)。

圖1 包裝質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒

具有包裝質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒后，還需要一個(gè)表達(dá)非慢病毒囊膜糖蛋白的質(zhì)粒VSV－G(水泡型口角炎病毒糖蛋白)提供病毒包膜構(gòu)成三質(zhì)粒系統(tǒng)。將C質(zhì)粒、D質(zhì)粒和囊膜表達(dá)質(zhì)粒按照3∶3∶1的比例用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞可以獲得大量的缺陷病毒的產(chǎn)生［9－10］。

2．2 病毒報(bào)告系統(tǒng)為了精細(xì)地分析病毒復(fù)制的特定生命過(guò)程(如進(jìn)入、反轉(zhuǎn)錄、核輸入、整合、組裝、出芽等)，通常對(duì)全長(zhǎng)基因組進(jìn)行遺傳修飾的感染性分子克隆。通過(guò)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行移碼突變或刪除獲得最小變化基因組與野生型基因組進(jìn)行對(duì)比，分析變化基因的功能。FIV并沒(méi)有類似HIV－1系統(tǒng)中的區(qū)域供報(bào)告基因的插入，作者在刪除的env中進(jìn)行了報(bào)告基因的插入。圖2中載體的骨架來(lái)源于34TF10，將U3替換成CMV，能夠在人的細(xì)胞中高效傳染和表達(dá)。該載體orfA中間有一個(gè)自然存在的預(yù)終止密碼，通過(guò)點(diǎn)突變使TGA變成TGG，得到orfA陽(yáng)性版本。由于FIV env對(duì)感染非貓細(xì)胞的低效性，作者將env中間部分進(jìn)行刪除并替換成報(bào)告基因(如eGFP)，同時(shí)提供一個(gè)外源VSV－G表達(dá)質(zhì)粒。為防止插入基因與env前端融合表達(dá)，在env前端插入一個(gè)2A表位，待env N端152個(gè)aa表達(dá)后斷裂，再表達(dá)報(bào)告基因。

圖2 報(bào)告病毒系統(tǒng)

3 貓免疫缺陷病毒載體的應(yīng)用

FIV可以感染家養(yǎng)貓?jiān)趦?nèi)的多種貓科動(dòng)物。國(guó)外對(duì)家養(yǎng)貓F(tuán)IV流行情況調(diào)查發(fā)現(xiàn):健康貓群中，F(xiàn)IV的血清陽(yáng)性率很低，大約為1%左右;患病貓群中陽(yáng)性率很高，可以達(dá)到30%，有的地方甚至報(bào)道42%的陽(yáng)性率。FIV感染過(guò)程中并沒(méi)有特異性臨床癥狀，但病毒在體內(nèi)復(fù)制的過(guò)程逐步地引起宿主免疫抑制，從而引起包括其他病毒、細(xì)菌、寄生蟲等在內(nèi)的機(jī)會(huì)感染。慢病毒的易變性導(dǎo)致疫苗研發(fā)非常困難，病毒攻擊免疫系統(tǒng)又繼發(fā)其他疾病而束手無(wú)策［11］。由于很難從發(fā)病動(dòng)物體內(nèi)分離到慢病毒，同時(shí)FIV在培養(yǎng)的細(xì)胞系中很難產(chǎn)量化繁殖，而構(gòu)建病毒載體后通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染能有效解決病毒來(lái)源的問(wèn)題。隨著近些年先天免疫學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)從宿主細(xì)胞內(nèi)定義出包括APOBEC3、Tetherin、SAMHD1以及MOV10等在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白［12－14］。通過(guò)特定的功能在某一特定的過(guò)程對(duì)病毒進(jìn)行攻擊，阻止病毒復(fù)制，控制病情發(fā)展。例如APOBEC3在病毒組裝的過(guò)程中包裝進(jìn)入病毒粒子，在反轉(zhuǎn)錄時(shí)APOBEC3通過(guò)其胞嘧啶脫氨基酶活性將病毒cDNA中C(胞嘧啶)脫氨基轉(zhuǎn)變成U(尿嘧啶)，導(dǎo)致病毒基因降解或者翻譯出預(yù)終止蛋白［15］。而Tetherin則在病毒出芽的過(guò)程中通過(guò)細(xì)胞外功能區(qū)將病毒錨定于細(xì)胞膜，切斷病毒的傳播［16］。

多年的觀察和研究結(jié)果均表明，F(xiàn)IV能利用人細(xì)胞表面的趨化因子受體進(jìn)入細(xì)胞，但并且不造成人體感染和患病。同時(shí)，由于慢病毒在進(jìn)入細(xì)胞后通過(guò)自身編碼整合酶的催化活性作用下將前病毒DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。例如，小孩遺傳性γ－鏈缺陷癥時(shí)，修飾后的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于非修飾細(xì)胞。同樣，慢病毒的基因治療對(duì)青光眼患者也有很好的效果。因此FIV作為載體對(duì)慢性疾病或遺傳缺陷病進(jìn)行基因治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

在基因治療載體的研究中，最關(guān)鍵的幾個(gè)問(wèn)題無(wú)非是:怎樣去除病毒蛋白的表達(dá)序列、怎樣去除病毒致病區(qū)而又要保證病毒基因的包裝、整合和驅(qū)使目的基因的表達(dá)。即在要能保證病毒成功的進(jìn)入宿主基因組中的前提下去除對(duì)人體而言有害的、增加有益的成分［17］。但是要應(yīng)用于臨床還有很長(zhǎng)的路要走。

［1］Bendinelli M，Pistello M，Lombardi S，et al．Feline immunodeficiency virus:an interesting model for AIDS studies，and an important cat pathogen［J］．Clin Microbiol Rev，1995，8:87-112．

［2］Kashiwase H，Katsube T，Kimura T，et al．8－Difluoromethoxy－4－quinolone derivatives as anti－feline immunodeficiency virus (FIV)agents:important structural features for inhibitory activity of FIV replication［J］．J Vet Med Sci，2000，62:499-504．

［3］Kenyon J C，Lever A M．The molecular biology of feline immunodeficiency virus(FIV)［J］．Viruses，2011，3:2192-2213．

［4］Talbott R L，Sparger E E，Lovelace K M，et al．Nucleotide sequence and genomic organization of feline immunodeficiency virus［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86:5743-5747．

［5］Saenz D T，Poeschla E M．FIV:from lentivirus to lentivector［J］．J Gene Med，2004，6 Suppl 1:S95-104．

［6］Fadel H J，Saenz D T，Poeschla E M．Construction and testing of orfA+/－FIV reporter viruses［J］．Viruses，2012，4:184-198．

［7］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Feline immunodeficiency virus－based lentiviral vectors［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):71-76．

［8］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Titration of feline immunodeficiency virus－based lentiviral vector preparations［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):126-128．

［9］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Production and harvest of feline immunodeficiency virus－based lentiviral vector from cells grown in T75 tissue－culture flasks［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):124-125．

［10］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Production，harvest，and concentration of feline immunodeficiency virus－based lentiviral vector from cells grown in CF10 or CF2 devices［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):118-123．

［11］Hosie M J，Addie D，Belak S，et al．Feline immunodeficiency．ABCD guidelines on prevention and management［J］．J Feline Med Surg，2009，11:575-584．

［12］Zheng Y H，Jeang K T，Tokunaga K．Host restriction factors in retroviral infection:promises in virus－h(huán)ost interaction［J］．Retrovirology，2012，9:112．

［13］Ai Y，Ma J．Multiple lysines combined in HIV－1 Vif determines the responsiveness to CBF－beta［J］．Biochemical and biophysical research communications，2015，457:385-390．

［14］Ai Y，Zhu D，Wang C，et al．Core－binding factor subunit beta is not required for non－primate lentiviral Vif－mediated APOBEC3degradation［J］．Journalofvirology，2014，88: 12112-12122．

［15］Sheehy A M，Gaddis N C，Choi J D，et al．Isolation of a human gene that inhibits HIV－1 infection and is suppressed by the viral Vif protein［J］．Nature，2002，418:646-650．

［16］Neil S J，Zang T，Bieniasz P D．Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV－1 Vpu［J］．Nature，2008，451:425-430．

［17］Barraza R A，Poeschla E M．Human gene therapy vectors derived from feline lentiviruses［J］．Vet Immunol Immunopathol，2008，123:23-31．

Q782

A

0529-6005(2017)01-0065-02

2016－07－04

國(guó)家自然科學(xué)基金(313172209;L1322010);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(DLBCA05)

艾有為(1990－)，男，博士，從事慢病毒與宿主天然免疫相互作用研究工作，E－mail:18246194641@163．com

王亞君(1976－)，女，副教授，博士，從事野生動(dòng)物疾病診斷和防治，E－mail:1402834602@qq．com

注:王亞君與艾有為對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

馬建章，E－mail:350946335@qq．com