針刺結(jié)合音樂療法對焦慮模型大鼠行為學(xué)及T淋巴細(xì)胞亞群的影響*

周雙明，劉海靜，趙日霞，段必雙，郭 瑾，凌 嫻

(1.云南省第二人民醫(yī)院，云南昆明650000;2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500)

針刺結(jié)合音樂療法對焦慮模型大鼠行為學(xué)及T淋巴細(xì)胞亞群的影響*

周雙明1，劉海靜2△，趙日霞2，段必雙2，郭 瑾2，凌 嫻2

(1.云南省第二人民醫(yī)院，云南昆明650000;2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500)

目的:探討針刺結(jié)合音樂療法對焦慮模型大鼠行為學(xué)及T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的影響。方法:選用健康雌性成年SD大鼠60只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、針刺治療組、音樂治療組和針刺音樂治療組(簡稱音針組)。采用不可預(yù)知的慢性情緒應(yīng)激方法制作焦慮模型，造模同時，針刺組、音樂組和音針組分別進(jìn)行相應(yīng)治療，觀察大鼠各組體重增長和行為學(xué)的變化、檢測全血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的百分率。結(jié)果:①針刺組和音針組大鼠體重較模型組顯著增長;②3個治療組第21天OT%值、OE%值、曠場試驗水平得分及垂直得分均較模型組顯著升高;③與空白組相比，模型組CD8+顯著降低，CD4+/CD8+顯著升高，針刺組及音針組CD8+較模型組顯著升高，CD4+/CD8+較模型組顯著下降。結(jié)論:針刺結(jié)合音樂療法及針刺療法對焦慮模型大鼠的T淋巴細(xì)胞亞群起到了良性調(diào)節(jié)作用。針刺結(jié)合音樂療法有較好的抗焦慮作用。

焦慮癥;針刺;音樂療法;T淋巴細(xì)胞亞群

流行病學(xué)調(diào)查顯示，廣泛性焦慮癥的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，因此，探討GAD的發(fā)病機(jī)制并且發(fā)現(xiàn)有效可行的治療方法意義深遠(yuǎn)。近年來，針刺療法憑借對本病顯著的臨床療效和較少的毒副作用，日益受到患者及家屬的信賴，醫(yī)學(xué)界也開始廣泛關(guān)注針刺療法對該疾病的治療及機(jī)理研究。本研究采用不可預(yù)知的慢性情緒應(yīng)激法建立焦慮大鼠模型，從行為學(xué)角度探討針灸結(jié)合音樂療法的抗焦慮效果，從免疫細(xì)胞的角度探討針刺結(jié)合音樂療法治療廣泛性焦慮的部分免疫學(xué)機(jī)制，為其治療焦慮癥的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為焦慮癥的病機(jī)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SD大鼠，雌性，清潔級，65只，體質(zhì)量220～260 g，購自于四川省實(shí)驗動物檢測中心;抗CD3+-APC、抗CD4+-PE、抗CD8+-FITC、溶血素(以上購自于美國BD公司)、PBS溶液(云南省中醫(yī)院中心實(shí)驗室自備);高架十字迷宮(elevated plus-maze，EPM)，采用國際通用方法自制;曠場實(shí)驗(Openfield test):自制立方體敞箱;流式細(xì)胞儀:BD AccuriTM C6(美國 BD公司產(chǎn));電子天平:Mettler Toledo MS104S(瑞士Mettler Toledo公司生產(chǎn));手術(shù)用器械:鑷子、手術(shù)剪、止血鉗等。

1.2 動物造模

本研究采用慢性情緒應(yīng)激-CES(Chronic Emotion Stress)改進(jìn)制作焦慮癥模型［1-2］。于第8天起除空白組外，其余4組大鼠接受不可預(yù)見性共9種應(yīng)激刺激，連續(xù)隨機(jī)安排3周，每種刺激形式不在連續(xù)的2天出現(xiàn)。分別為24 h禁食、24 h禁水、兩籠混為一籠、單籠、傾斜、從兩籠各抓兩只混籠、24 h光照、24 h黑暗、不可逃避的足底電擊(每只大鼠每次接受電流強(qiáng)度10 mA，20次電擊，間隔30 s行下1次電擊，電流持續(xù)時間5 s/次)。

1.3 動物分組及處理方法

動物適應(yīng)1周后，通過曠場實(shí)驗將垂直運(yùn)動次數(shù)和水平運(yùn)動次數(shù)相加，次數(shù)不足30次或超過120次的大鼠剔除后，進(jìn)行編號，查隨機(jī)數(shù)字表分為空白對照組、模型組、針刺治療組、音樂治療組和針刺音樂治療組(音針組)5組，每組12只。除空白組外，其它4組動物均給予連續(xù)21天不可預(yù)見性的刺激。針刺治療組和針刺音樂治療組及音樂治療組均在每次治療結(jié)束1 h后對大鼠進(jìn)行造模試驗，具體方法同模型組。

1.3.1 針刺取穴 參照《實(shí)驗針灸學(xué)》(全國協(xié)編教材)大鼠穴位定位［3］，取“百會”“內(nèi)關(guān)”“三陰交”，進(jìn)行針刺治療。

1.3.2 針刺操作方法 取針身長度為2 mm的32號麥粒型皮內(nèi)針用于“百會”的針刺，取針身長度為5 mm的32號圖釘型皮內(nèi)針用于“內(nèi)關(guān)”和“三陰交”的針刺，每次留針30 min，每日1次，共21天。

1.3.3 音樂治療 將大鼠置于黑暗密閉空間，用錄音機(jī)播放音樂45 min。針刺音樂治療組在大鼠進(jìn)行針刺治療留針期間進(jìn)行音樂治療。

1.4 一般情況觀察

觀察各組大鼠精神、活動狀態(tài)。分別于實(shí)驗開始的第1天和第21天測量各組大鼠體重，觀察各組大鼠體重增長變化情況。

1.5 行為學(xué)測試

1.5.1 高架十字迷宮實(shí)驗 大鼠從中央?yún)^(qū)面向閉合臂放入迷宮，記錄5 min內(nèi)活動的情況。觀察指標(biāo):開放臂進(jìn)入次數(shù)(OE);閉合臂進(jìn)入次數(shù)(CE);開放臂停留時間(OT);閉合臂停留時間(CT)。分別計算大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)(OE)占兩臂總次數(shù)(TE)的百分比以及大鼠在開臂停留時間(OT)分別占總時間(TT)的百分比。

1.5.2 曠場試驗 將大鼠置于敞箱底面的中心方格內(nèi)，以動物穿越底面的格數(shù)為水平運(yùn)動次數(shù)，以后肢直立次數(shù)為垂直運(yùn)動次數(shù)。于實(shí)驗開始后的第7、14、21天進(jìn)行行為學(xué)測試，各組大鼠交叉進(jìn)行。

1.6 T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)百分率檢測

流氏細(xì)胞儀檢測全血 T淋巴細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+水平。具體步驟為:取大鼠外周抗凝全血(內(nèi)眥靜脈取血)30 ul;分別添加5 ul抗 CD3+、抗CD4+、抗CD8+表面抗體，重懸，室溫避光孵育15 min; 2倍稀釋溶血素，加入1 ml稀釋后的溶血素裂解紅細(xì)胞10 min，加入2 ml PBS溶液洗1次，1200轉(zhuǎn)/min離心5 min棄上清，用500 ulPBS溶液重懸;2 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本實(shí)驗采用SPSS19.0統(tǒng)計系統(tǒng)對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用±s表示。組間差異比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，組間兩兩數(shù)據(jù)比較前進(jìn)行方差齊性檢驗，滿足方差齊性則采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane，s T2檢驗，以P＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白組大鼠精神狀態(tài)良好，皮毛有光澤，行動敏捷。模型組大鼠較空白組大鼠皮毛晦暗，反應(yīng)遲鈍，梳理毛發(fā)動作明顯過多。經(jīng)3周治療干預(yù)后，3個治療組大鼠以上表現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 體重變化

與模型組比較，針刺組和音針組大鼠體重增長顯著(P＜0.01)。見表1。

2.3 行為學(xué)測試

2.3.1 OT/TT(%) 第21天3個治療組較模型組均顯著升高(P＜0.0l);第21天音針組OT%值較音樂組明顯升高(P＜0.01)。見表2。

2.3.2 OE/TE(%) 3個治療組第21天OE%值較模型組明顯升高(P＜0.01或P＜0.05)，三者比較均無顯著差異。見表3。

表1 各組大鼠體重增長比較(±s)

表1 各組大鼠體重增長比較(±s)

注:與空白組比較，△P＜0.01;與模型組比較，◇P＜0.01

組別 n 體重增長(g)空白組12 83.25±9.94模型組 12 24.33±5.66△針刺組 12 38.50±7.33△◇音樂組 12 30.33±8.17△音針組 12 43.20±22.53△◇

表2 各組大鼠OT/TT(%)比較(±s，n=12)

表2 各組大鼠OT/TT(%)比較(±s，n=12)

注:與空白組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01;與模型組比較，◆P＜0.01;與音樂組比較，▼P＜0.01

組別 7天 14天 21天空白組14.14±2.65 12.86±3.31 13.36±3.30模型組 2.83±1.37▲1.97±0.97▲1.08±0.93▲針刺組 3.31±0.88▲3.08±0.78▲9.53±2.04△◆音樂組 3.25±1.12▲2.94±1.25▲7.08±2.06▲◆音針組 3.50±0.69▲3.25±1.14▲11.06±2.70◆▼

表3 各組大鼠OE/TE(%)比較(±s，n=12)

表3 各組大鼠OE/TE(%)比較(±s，n=12)

注:與空白組比較，▲P＜0.01;與模型組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01

組別 7天 14天 21天空白組30.58±8.48 32.01±8.79 33.21±7.88模型組 11.07±6.40▲7.59±6.81▲4.11±3.24▲針刺組 11.00±5.40▲8.90±6.61▲17.40±6.15▲◆音樂組 10.27±4.84▲7.27±7.34▲14.46±9.53◇▲音針組 12.12±5.70▲11.64±6.84▲22.68±9.38◆

2.3.3 曠場試驗水平得分 與模型組比較，第14和第21天3個治療組水平得分較模型組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。其中音針組第21天水平得分明顯高于針刺組(P＜0.01)。見表4。

表4 各組大鼠曠場試驗水平得分比較(±s，n=12)

表4 各組大鼠曠場試驗水平得分比較(±s，n=12)

注:與空白組比較，▲P＜0.01;與模型組比較，◆P＜0.01;與針刺組比較，▼P＜0.01

組別 7天 14天 21天空白組76.25±14.65 71.67±12.87 79.58±7.13模型組 38.08±7.40▲31.92±7.76▲23.25±9.73▲針刺組 44.50±11.37▲48.08±9.71▲◆55.83±5.91▲◆音樂組 46.50±11.78▲51.00±9.92▲◆61.67±10.28▲◆音針組 46.92±9.15▲55.25±8.30▲◆67.58±8.88▲◆▼

2.3.4 曠場試驗垂直得分 與模型組比較，第14天音針組及音樂組垂直得分顯著升高(P＜0.01)，其中，音針組第14天垂直得分較針刺組明顯升高(P＜0.05)。第21天3個治療組垂直得分較模型組升高有顯著差異(P＜0.01)。音針組第21天垂直得分較音樂組及針刺組顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。見表5。

表5 各組大鼠曠場試驗垂直得分比較(±s，n=12)

表5 各組大鼠曠場試驗垂直得分比較(±s，n=12)

注:與空白組比較，▲P＜0.01;與模型組比較，◆P＜0.01;與音針組比較，▽P＜0.05，▼P＜0.01

組別 7天 14天 21天空白組20.92±3.78 19.42±4.85 22.08±3.63模型組 10.17±3.01▲8.42±2.39▲4.92±1.98▲針刺組 10.83±3.69▲11.08±3.37▲12.67±2.84▲◆▼音樂組 11.75±4.14▲12.08±2.68▲◆13.92±2.68▲◆▽音針組 12.08±2.15▲14.33±3.20▲◆16.83±2.95▲◆

2.4 T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)百分率

經(jīng)過3周的造模及治療后，數(shù)據(jù)顯示，與空白組相比，模型組CD8+降低顯著(P＜0.01)，CD4+/CD8+明顯升高(P＜0.05)，CD3+有下降趨勢，但未達(dá)統(tǒng)計意義(P＞0.05)，CD4+未見明顯變化(P＞0.05);3個治療組各數(shù)值與空白組無顯著差異。與模型組相比，針刺組、音針組的CD8+均明顯升高(P＜0.01)，針刺組、音針組CD4+/CD8+的比值較模型組降低顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);3個治療組CD3+較模型組均有升高趨勢，但差異不顯著(P＞0.05);各組CD4+較模型組未見明顯變化(P＞0.05)。音針組與針刺組各組數(shù)據(jù)之間無明顯差異(P＞0.05)。見表6。

表6 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化(±s，n=12)

表6 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化(±s，n=12)

注:與空白組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01;與模型組比較，□P＜0.05，■P＜0.01

組別 CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+空白組56.70±3.48 41.33±2.86 22.38±2.41 1.859±0.161模型組52.49±6.36 40.85±4.75 18.43±1.88▲2.232±0.305△針刺組55.44±5.74 41.05±4.44 22.23±3.11■1.898±0.377□音樂組55.35±5.10 41.15±5.69 20.34±3.12 2.068±0.463音針組56.68±5.63 41.22±3.67 21.98±3.12■1.907±0.292□

3 討論

針灸治療焦慮癥已有大量臨床報道［4-6］。也有研究證實(shí)音樂和歌聲能有效改善情感障礙患者認(rèn)知功能和社交能力，有效干預(yù)和緩解情感障礙患者抑郁、焦慮程度及軀體、精神痛苦，從而提高患者生理、心理健康水平［7-9］。但針刺與音樂療法相結(jié)合對焦慮癥的作用尚未見報道。本研究采用不可預(yù)知的慢性情緒應(yīng)激法建立焦慮大鼠模型，采用目前公認(rèn)的高架十字迷宮試驗以及曠場實(shí)驗兩種行為學(xué)評測方法［10-12］對大鼠行為進(jìn)行測評，采用流式細(xì)胞儀檢測大鼠全血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的百分率。從行為學(xué)角度探討針灸結(jié)合音樂療法的抗焦慮效果，從免疫細(xì)胞的角度探討針刺結(jié)合音樂療法治療廣泛性焦慮的部分免疫學(xué)機(jī)制。

本研究中高架十字迷宮實(shí)驗(焦慮程度評估)結(jié)果提示，不可預(yù)知的慢性情緒應(yīng)激制造焦慮模型方法可顯著減少大鼠在開放臂的停留時間和大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)，表明大鼠已處于明顯焦慮狀態(tài)，提示本實(shí)驗造模成功。而3種治療方法均可增加焦慮模型大鼠在開放臂的停留時間和進(jìn)入開臂次數(shù)的比例，提示3種治療方法均對模型大鼠的焦慮行為有明顯緩解作用。音針組顯著優(yōu)于音樂組和針刺組。

曠場試驗(活動性和探究行為)結(jié)果提示:不可預(yù)知的慢性情緒刺激制造焦慮模型方法可顯著減少大鼠水平移動格數(shù)次數(shù)和直立次數(shù)，而3種治療方法均可增加焦慮模型大鼠的水平移動格數(shù)和直立次數(shù)，提高焦慮大鼠的活動性和探究行為。音針組顯著優(yōu)于音樂組和針刺組。

免疫系統(tǒng)與情緒活動以及精神障礙之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，但其心身交互作用機(jī)制及其因果關(guān)系目前尚不十分清楚。許多研究指出免疫功能的改變影響認(rèn)知功能［13-14］。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)看，機(jī)體細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能等與不良負(fù)性情緒密切相關(guān)［15］。D Atanackovic等［16］研究發(fā)現(xiàn)心理治療期間的焦慮障礙患者外周血CD4+/CD8+比值顯著升高，CD8+降低。莊潔等［17］發(fā)現(xiàn)處于高應(yīng)激狀態(tài)下的不同特質(zhì)焦慮運(yùn)動員，高焦慮組CD4+/CD8+比值明顯下降，CD4+明顯減少。可見，不良情緒及心理應(yīng)激可致免疫系統(tǒng)功能紊亂。免疫功能紊亂涉及免疫細(xì)胞、免疫分子多個方面。

T淋巴細(xì)胞作為人體最重要的免疫細(xì)胞之一，T淋巴細(xì)胞之間的細(xì)微平衡對維持免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到至關(guān)重要的作用［18］。CD3+T細(xì)胞反映總T淋巴細(xì)胞水平。成熟T淋巴細(xì)胞中細(xì)胞免疫有兩類重要效應(yīng)細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞［18］。CD4+T主要功能是輔助或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。CD8+T主要為抑制性T細(xì)胞(Ts)或細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)，主要發(fā)揮殺傷和抑制作用，是免疫反應(yīng)中直接殺傷性細(xì)胞。CD4+/CD8+比值在一定程度上表示輔助性T細(xì)胞(Th)和抑制性T細(xì)胞(Ts)比值，反映了機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)是否穩(wěn)定，是判斷機(jī)體免疫功能的敏感指標(biāo)。CD4+/CD8+比值倒置或下降提示機(jī)體免疫功能紊亂。CD4+/CD8+降低代表細(xì)胞免疫功能降低，處于免疫抑制狀態(tài)，是免疫缺陷的重要指征;其增高表明細(xì)胞免疫功能處于“過度活躍”的異常狀態(tài)。免疫器官的臟器指數(shù)直接的反應(yīng)了該免疫器官的大小，是反映臟器受損的一個靈敏、有效和經(jīng)濟(jì)的指標(biāo)［19］。

針刺對機(jī)體免疫功能有良好、整體調(diào)整作用［20］。有研究顯示針刺療法可調(diào)節(jié)焦慮婦女受損的免疫功能，明顯增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，明顯升高過低的淋巴細(xì)胞增殖，明顯降低過高的淋巴細(xì)胞增殖［21］。音樂療法對機(jī)體免疫系統(tǒng)亦有調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者報道連續(xù)8天播放某德國樂曲，5 h/天，結(jié)果BALB/c小鼠T細(xì)胞數(shù)目增加，增值反應(yīng)增強(qiáng)［21］。由此可見適宜的音樂刺激可改善人和動物的不良情緒，增強(qiáng)其免疫功能。

本實(shí)驗通過流式細(xì)胞儀對各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，結(jié)果表明:針刺結(jié)合音樂療法及針刺療法可有效升高慢性情緒應(yīng)激所致焦慮模型大鼠降低的CD8+，降低焦慮大鼠過高的CD4+/CD8+，對焦慮模型大鼠機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群起到了良性調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗從行為學(xué)證實(shí)了針刺結(jié)合音樂療法對焦慮模型大鼠焦慮征象的有效性，從T淋巴細(xì)胞方面證實(shí)了焦慮模型大鼠存在T細(xì)胞免疫功能紊亂，并揭示針刺結(jié)合音樂療法及針刺療法調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能的有效性，但其作用機(jī)制與途徑還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Acupuncture Combined with Music Therapy on Behavior and T Lymphocyte Subsets in Anxiety Disorder Model Rats

ZHOU Shuang-ming1，LIU Hai-jing2△，ZHAO Ri-xia2，DUAN Bi-shuang2，GUO Jin2，LING Xian2
(1.Yunnan Second People＇s Hospital，Kunming 650000，China;2.Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China)

Objective:To explore the effect of acupuncture combined with music therapy in anxiety disordered (AD)rats by exploring changes in behavior and T lymphocytes.Methods:Female SD rats were randomly divided into normal(N)，model(M)，acupuncture therapy(AT)，music therapy(MT)and acupuncture combined with music therapy(AMT)groups.Chronic unpredictable emotional stress lasted 21 days to establish AD rat models.All the rats were observed according to the weight changes during 21 days.Behavioral activity was measured by using the elevated plus-maze and open-field test in all rats.Observe T lymphocytes subgroup by using flow cytometry.Results:1.Changes in weight gain:Compared with the M，weight gain in AT and AMT was significantly higher 2.Behavior tests:Elevated Plus-maze Test:OT%，OE%in AT，MT and AMT were significantly higher than those in M on the 21st day.Open-field Test:Horizontal scores and Vertical scores in AT，MT，AMT were significantly higher than those in M on the 21st day.3.T lymphocytes subgroup:The data showed CD8+in M was significantly lower than that in N(P＜0.01)，and CD4+/CD8+in M were significantly higher than those in N(P＜0 05);CD8+in AT and AMT was significantly higher than that in M(P＜0 01).CD4+/CD8+in AT and AMT were significantly lower than those in M(P＜0.05).Conclusion:It is suggested that AMT has a good anti-anxiety effect.Moreover，ATM and AT can regulate the level of T lymphocytes in anxiety disorder rats.

Anxiety disorder;Acupuncture;Music therapy;T lymphocytes subgroup

R246.6

A

1005-0779(2017)03-0057-04

2016-08-28

云南省醫(yī)療衛(wèi)生單位內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)(針灸研究中心)科研項目，編號:YN2015021。

周雙明(1985-)，女，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)針灸治療心身疾病的臨床及基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:劉海靜(1973-)，女，副教授，主要從事中醫(yī)針灸治療心身疾病的臨床及基礎(chǔ)研究。