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    嗜水氣單胞菌對氟苯尼考的耐藥性獲得與消失速率

    2017-03-28 21:04:21王小亮賈麗王靜波王姝曹歡張文
    河北漁業(yè) 2017年3期
    關鍵詞:耐藥性

    王小亮 賈麗 王靜波 王姝 曹歡 張文 徐立蒲

    摘要:為摸清淡水魚類最主要的致病菌——嗜水氣單胞菌對國家批準使用的新獸藥——氟苯尼考的耐藥性的獲得與消失速率,提供科學使用該藥的數(shù)據(jù)支撐,測定在低濃度的氟苯尼考壓力下,3株嗜水氣單胞菌對氟苯尼考的最小抑菌濃度(MIC)隨時間的變化,以及3株菌對氟苯尼考的耐藥性獲得速率和消失速率。結(jié)果表明,菌株在低濃度的氟苯尼考下,4~5 d其耐藥濃度升高1.6~2.5倍。同時,菌株對氟苯尼考的耐藥濃度隨著藥物濃度的逐漸增加可迅速上升15.9~40倍,但其消失較慢,28 d的消失速率為1.58~2.54。因此, 在使用氟苯尼考防治細菌性疾病時,連用時間不宜超過4 d,再次使用的間隔不少于28 d。

    關鍵詞:嗜水氣單胞菌;氟苯尼考;耐藥性

    中圖分類號:S948

    文獻標識碼:A

    當前,防治嗜水氣單胞菌性疾病的主要手段是使用化學藥物[1]。然而,我國對魚類的抗菌藥物的藥效學及藥物代謝動力學等基礎研究的薄弱,加上養(yǎng)殖者輕預防重治療,不針對病原的盲目用藥和未進行藥敏實驗的濫用魚藥,導致嗜水氣單胞菌耐受的抗菌藥物種類日益增多,對抗菌藥物的耐受劑量越來越強。目前,嗜水氣單胞菌對上世紀60年代開始使用的磺胺類藥物敏感率不足20%[2],對上世紀80年代開始使用的喹諾酮類藥物的敏感率已從100%下降到40%~60%[3]。

    氟苯尼考又稱氟甲砜霉素,是一種新型的動物專用的氯霉素類廣譜抗生素。20世紀80年代末研制而成,1990年在日本首先用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),之后在世界范圍內(nèi)廣泛上市。我國于1999年批準氟苯尼考為國家二類新獸藥,最早用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上治療鰻鱺愛德華氏菌病和赤鱗病[4],目前,已在水產(chǎn)業(yè)廣泛應用,主要用于防治魚類的各種細菌性疾病。為避免氟苯尼考重蹈磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的覆轍,本文開展嗜水氣單胞菌對氟苯尼考的耐藥性獲得和消失速率研究,為科學規(guī)范氟苯尼考的使用提供依據(jù)。

    1材料和方法

    1.1材料

    3株嗜水氣單胞菌菌株為2013年5月從北京懷柔發(fā)病的養(yǎng)殖鱘魚上分離獲得,純化后經(jīng)API鑒定系統(tǒng)和16S rDNA鑒定為嗜水氣單胞菌,分離部位分別為肝、脾、腎,編號1、2、3。Mulluer-Hinton肉湯(MHB)購于北京陸橋技術有限責任公司,腦心浸液瓊脂(BHIA)購于英國OXOID公司。氟苯尼考購于美國Sigma公司,用甲醇溶解后,用蒸餾水稀釋,制備濃度為2 560 μg/mL,經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌后,作為母液備用。

    1.2方法

    1.2.1菌株最小抑菌濃度的測定采用臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的濃度稀釋法(NCCLS,2010)。操作方法為:菌株接種至BHIA平板,置于28 ℃培養(yǎng)16~20 h后,采用045%無菌生理鹽水制成0.5麥氏濁度菌懸液,稀釋100倍備用。使用母液和無菌MHB培養(yǎng)基制備氟苯尼考濃度梯度,濃度分別為0.5 μg/mL、0.8 μg/mL、1.3 μg/mL、2.0 μg/mL、3.2 μg/mL、5.0 μg/mL、8.0 μg/mL、12.7 μg/mL、20.2 μg/mL、32.0 μg/mL,每管3.0 mL,每管加備用的菌懸液100 μL,無菌塞封口后于28 ℃培養(yǎng)48 h,記錄最小抑菌濃度(MIC)。

    1.2.2一定氟苯尼考濃度壓力下菌株MIC隨時間的變化制備氟苯尼考濃度為0.4 μg/mL滅菌MHB培養(yǎng)基,滅菌試管分裝成5 mL/管。每株菌接種9支試管,每管接種100 μL備用菌懸液。加滅菌塞子,置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育,每天早、中、晚對試管搖勻。每天取一管,按1.2.1方法測定菌株的MIC值。

    1.2.3菌株對氟苯尼考的耐藥性獲得速率測定菌株的MIC后,從肉眼觀察有細菌生長的最高藥物濃度的試管中吸取100 μL培養(yǎng)基,將其接種在不同氟苯尼考濃度的MHB培養(yǎng)基試管中,28 ℃孵育48 h;再從肉眼觀察有細菌生長的最高藥物濃度的試管中吸取100 μL培養(yǎng)基,接種至不同氟苯尼考濃度的MHB培養(yǎng)基試管中,28 ℃孵育48 h。連續(xù)操作7次。使嗜水氣單胞菌在含有氟苯尼考的藥物培養(yǎng)基中傳代7次,比較最后測定的MIC與最初的MIC比較,評價菌株對氟苯尼考的耐藥性獲得速率。

    1.2.4菌株對氟苯尼考的耐藥性消失速率將1.2.3選出的已獲得較高耐藥性的菌株,以瓊脂內(nèi)穿刺法將菌株分別接種在盛有不含氟苯尼考的BHIA培養(yǎng)基中,在4 ℃條件下保存,測定放置1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d后,菌株的MIC值。同時,采用不含氟苯尼考的BHIA平板傳代,連續(xù)傳代7次,測定每次傳代后菌株的MIC值。將菌株4 ℃放置28 d的MIC值及傳代7次后測定的MIC與最初的MIC比較,評價菌株對氟苯尼考耐藥性消除速率。

    2結(jié)果

    2.1一定濃度的氟苯尼考壓力下菌株MIC隨時間的變化規(guī)律

    在一定濃度的氟苯尼考壓力下,氟苯尼考對3株嗜水氣單胞菌的MIC均呈現(xiàn)先逐步上升之后穩(wěn)定的趨勢。經(jīng)0.4 μg/mL的氟苯尼考作用4~5 d,嗜水氣單胞菌對氟苯尼考的耐藥濃度升高2.0~2.5倍。見表1。

    2.2菌株對氟苯尼考的耐藥性獲得速率

    3株嗜水氣單胞菌經(jīng)連續(xù)7次在帶有氟苯尼考的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),菌株對氟苯尼考的耐藥性變化情況見表2。由表2可以看出3株嗜水氣單胞菌在含有氟苯尼考的培養(yǎng)基中傳代7次后,均獲得了較強的耐藥性。3株嗜水氣單胞菌的MIC分別從0.8 μg/mL上升到了12.7 μg/mL、32.0 μg/mL和20.2 μg/mL,分別上升了15.9倍、40.0倍和25.3倍。

    嗜水氣單胞菌對氟苯尼考的MIC隨放置時間和傳代次數(shù)的變化數(shù)據(jù)分別見表3、表4。數(shù)據(jù)表明,菌株對氟苯尼考的MIC值隨放置時間和傳代次數(shù)逐漸降低,表明菌株的耐藥性在逐漸消失。菌株放置28 d,MIC值分別由12.7 μg/mL、32.0 μg/mL、20.2 μg/mL下降至5.0 μg/mL、12.7 μg/mL、8.0 μg/mL。菌株傳代7次,MIC值分別下降至5.0 μg/mL、20.2 μg/mL、8.0 μg/mL。菌株對氟苯尼考的耐藥性消失速率在1.58~254之間。

    本文實驗了低濃度的氟苯尼考壓力下的嗜水氣單胞菌耐藥性變化以及菌株對氟苯尼考的耐藥性獲得速率和消失速率。在低濃度的氟苯尼考作用下4~5 d即可導致菌株的耐藥濃度升高1.6~2.5倍。這與Pallares等[5]發(fā)現(xiàn)低濃度的抗菌藥物與細菌長期接觸會導致菌株產(chǎn)生耐藥性和治療失敗觀點基本一致。同時,菌株對氟苯尼考的耐藥濃度隨著藥物濃度的增加,7次即可上升15.9~40.0倍。氟苯尼考是濃度依賴型藥物,宜每日用藥1次。以上信息提示我們使用氟苯尼考治療疾病時,使用劑量需要用到殺菌濃度,使用時間不宜超過4 d,不然會導致菌株產(chǎn)生耐藥突變,疾病更難治療。在使用劑量如何用到殺菌濃度方面,李夢影等[6]通過對氟苯尼考在鯽和草魚體內(nèi)的藥代/藥效動力學聯(lián)合參數(shù)及臨床給藥方案的研究,建議氟苯尼考的給藥劑量為30 mg/kg。陳昌福教授依據(jù)日本學者研究的魚類病原菌的MIC與使用劑量的關系,建議給藥劑量為鯉科病魚分離菌的MIC乘以8.1。無論何種給藥劑量,只有充分了解病原菌的藥物感受性水平、藥物在魚體的藥代動力學特性,完美結(jié)合兩者才能達到精準藥效。

    嗜水氣單胞菌對氟苯尼考的耐藥性消失速率較慢,28 d的下降速率為1.58~2.54。顯然,菌株一旦獲得較高的耐藥水平,自然恢復最初的耐藥水平則至少需要28 d。因此,為避免耐藥菌株產(chǎn)生,延長藥物使用年限,兩次使用氟苯尼考的時間間隔至少在28 d以上才更為科學。

    參考文獻:

    [1]

    李愛華.水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗菌藥物及細菌耐藥性[J].中國水產(chǎn)科學,2002,9(1):87-91

    [2] 王小亮,徐立蒲,王靜波,等.北京市主要養(yǎng)殖魚類病原菌藥物敏感性分析[J].北京農(nóng)業(yè),2012,(36):79-81

    [3] 王小亮,徐立蒲,曹歡,等.魚源病原菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(3):195-199

    [4] 張雷,張驪,徐倩,等.氟苯尼考的毒性及殘留檢測方法研究進展[J].中國獸藥雜志,2009,43(6):49-52

    [5] Pallares R,F(xiàn)enoll A,Linares J.The epidemiology of antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae and the clinical relevance of resistance to cephalosporins,macrolides and quinolones[J].International Journal of antimicrobial agents,2003,(22):12-24

    [6] 李夢影,徐麗娟,呂利群.氟苯尼考在鯽和草魚體內(nèi)的藥代/藥效動力學聯(lián)合參數(shù)及其臨床給藥方案的研究[J].水產(chǎn)學報,2014,38(6):888-894

    (收稿日期:2016-11-11)

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