河豚毒素DNA適配子核心區(qū)域的識別

邵碧英，陳文炳，劉正才，繆婷玉，彭 娟，楊 方

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建 福州 350001）

河豚毒素DNA適配子核心區(qū)域的識別

邵碧英，陳文炳，劉正才，繆婷玉，彭 娟，楊 方

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建 福州 350001）

用DNA folding form在線軟件分析河豚毒素DNA適配子A3、G10的二級結(jié)構(gòu)，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)，分別合成適配子A3、G10的各4 個區(qū)域的5’端地高辛標(biāo)記的序列。用丙烯酸-環(huán)氧乙烷珠子固定河豚毒素，測定抗地高辛堿性磷酸酶的適宜稀釋倍數(shù)，用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶系統(tǒng)檢測各區(qū)域與河豚毒素的親和力，識別出適配子的核心區(qū)域。結(jié)果表明，抗地高辛堿性磷酸酶的適宜工作濃度為2×104倍稀釋；合成的適配子A3的4 個區(qū)域中，A3-2區(qū)域與河豚毒素的親和力最強(qiáng)，即適配子A3的核心區(qū)域為A3-2區(qū)域，實際上含有47 個核苷酸；合成的適配子G10的4 個區(qū)域中，G10-4區(qū)域與河豚毒素的親和力最強(qiáng)，即適配子G10的核心區(qū)域為G10-4區(qū)域，實際上含有56 個核苷酸。

河豚毒素；適配子；核心區(qū)域；親和力

適配子（也稱適體）是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)從人工合成的DNA或RNA隨機(jī)庫中篩選出來的，與非核酸靶物質(zhì)特異結(jié)合的高親和性單鏈寡核苷酸序列。適配子在蛋白質(zhì)[1-5]、病毒[6]、細(xì)菌[7-9]、生物毒素[10-16]、重金屬[17-18]、小分子物質(zhì)[19-23]等的篩選、制備及應(yīng)用方面的報道已有不少。河豚毒素是毒性最強(qiáng)的非蛋白類神經(jīng)毒素之一，是一種小分子物質(zhì)，在采用SELEX技術(shù)篩選制備其DNA適配子的研究上已取得一定進(jìn)展，應(yīng)用SELEX技術(shù)、結(jié)合誘變聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，通過克隆、測序、親和力測定等手段，從人工合成的隨機(jī)ssDNA文庫中篩選、制備了2 條能特異結(jié)合河豚毒素且親和力強(qiáng)的DNA適配子A3和G10，并進(jìn)行了初步應(yīng)用，在河豚毒素的分子生物學(xué)檢測、化學(xué)分析中有較好的效果[24-26]。但是，有文獻(xiàn)報道，經(jīng)過實驗篩選獲得的適配子在實際應(yīng)用中起主要作用的只是其中的一小部分核苷酸，即所謂的核心區(qū)域[3]。一旦識別出適配子的核心區(qū)域，剔除了不需要的核苷酸部分，既有利于適配子二級結(jié)構(gòu)的形成使之更易與靶物質(zhì)結(jié)合，又便于人工合成，減少成本。因此，本實驗在前期研究成果[25-26]基礎(chǔ)上，以制備的河豚毒素DNA適配子為研究對象，分析其二級結(jié)構(gòu)，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)合成不同區(qū)域的地高辛標(biāo)記的序列，采用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶系統(tǒng)測定各區(qū)域與河豚毒素的親和力，從而識別出適配子A3、G10的核心區(qū)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚毒素（純度≥99%，HPLC純） 成都曼思特生物技術(shù)有限公司；丙烯酸-環(huán)氧乙烷珠子 美國Promega公司；抗地高辛堿性磷酸酶 艾美捷科技有限公司；對硝基苯磷酸二鈉 廈門泰京生物技術(shù)有限公司；DNase/RNase-Free Deionized Water（ddH2O）天根生化科技（北京）有限公司；結(jié)合緩沖液、磷酸鉀緩沖液、洗滌緩沖液、封閉液、對硝基苯磷酸二鈉溶液、酶終止液參照文獻(xiàn)[24]配制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mikro 120臺式高速離心機(jī) 德國Hettich zentrifugen公司；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 適配子二級結(jié)構(gòu)的分析及各區(qū)域的合成

將適配子A3、G10的序列用DNA folding form在線軟件進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析[27]。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)，選擇不同的區(qū)域，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成5’端地高辛標(biāo)記的序列。加ddH2O將序列稀釋至50 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 河豚毒素的固定

加1 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液，將1 mg河豚毒素干粉完全溶解，用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）稀釋至質(zhì)量濃度為100 mg/L；稱取250 mg丙烯酸-環(huán)氧乙烷珠子，加入1 mL稀釋后的河豚毒素溶液，渦旋混勻，在室溫條件下放置48 h；用0.01 mol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）懸浮珠子，在垂熔漏斗中用至少10 mL相同緩沖液漂洗，真空抽濾；加入1 mL含體積分?jǐn)?shù)為5%的水合巰基乙醇的1 mol/L甘氨酸溶液（pH 7～8），室溫條件下放置16 h；將珠子置于垂熔漏斗上，先用10 mL ddH2O后用10 mL 0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）沖洗，真空抽濾；加入25 mL結(jié)合緩沖液，使河豚毒素-珠子的質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

1.3.3 抗地高辛堿性磷酸酶適宜稀釋倍數(shù)的測定

加500 μL ddH2O溶解抗地高辛堿性磷酸酶干粉，再加500 μL滅菌甘油，混勻，分裝成100 μL/管，-20 ℃保存；用結(jié)合緩沖液將抗地高辛堿性磷酸酶分別進(jìn)行5×103、1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105倍稀釋；各取200 μL抗地高辛堿性磷酸酶溶液，加200 μL對硝基苯磷酸二鈉溶液，顯色20 min；加200 μL NaOH溶液（2 mol/L），終止顯色反應(yīng)。在30 min內(nèi)，吸取200 μL反應(yīng)液于酶標(biāo)微孔中，于多功能酶標(biāo)儀測定OD405nm值。

1.3.4 核心區(qū)域的識別

1.5 mL離心管先用封閉液于37 ℃封閉4 h，用洗滌緩沖液洗滌1 次，風(fēng)干；用結(jié)合緩沖液將各區(qū)域序列稀釋至1 μmol/L，95 ℃變性5 min，冷卻至室溫；在封閉管中加入100 μL河豚毒素-珠子和150 μL各區(qū)域序列，同時以不加序列的河豚毒素-珠子為空白對照，各重復(fù)3 管，室溫結(jié)合30 min，期間不斷渦旋；瞬離，棄上清液，加600 μL結(jié)合緩沖液漂洗，重復(fù)3 次；加入200 μL經(jīng)1.3.3節(jié)測定的適宜稀釋度的抗地高辛堿性磷酸酶，室溫條件下放置20 min，期間不斷渦旋；瞬離，棄上清液，漂洗3 次；加入200 μL對硝基苯磷酸二鈉溶液，顯色20 min；加200 μL NaOH（2 mol/L）溶液，中止顯色；吸取200 μL于酶聯(lián)板的微孔中，測定OD405nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 適配子二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果

圖1 適配子的二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Secondary structures of DNA aptamers A3 and G10

適配子A3的序列為：5’-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AAC CCT GCC GGG GGC TTC TCC TTG CTG CTC TGC TCT GTT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3’，共78 個堿基。適配子G10的序列為：5’-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AAC CGC GGT TCC TCG GCC CCC CGT CCA TGT CGA GCC TCG AAT ACT CCC CAG ATG TAG TAG CCC ACA GCA TAG TTC GAC ATG AGG CCC GGA TC-3’，共113 個堿基。經(jīng)DNA folding form在線軟件分析，獲得的適配子A3、G10的二級結(jié)構(gòu)如圖1所示。A3的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)明顯地被分為2 個部分，分別由5’-GAG CTC AGA ATA AAC GCT C-3’、5’-CCG GGG GCT TCT CCT TGC TGC TCT GCT CTG TTC GAC ATG AGG CCC GG-3’這2 段序列組成。G10的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)明顯地被分為3 個部分，分別由5’-AAA CGC TCA ACC GCG GTT-3’、5’-CGG CCC CCC G-3’、5’-CAT GTC GAG CCT CGA ATA CTC CCC AGA TGT AGT AGC CCA CAG CAT AGT TCG ACA TG-3’這3 段序列組成。

2.2 區(qū)域的選擇結(jié)果

根據(jù)適配子二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，又考慮到合成序列的5’端需標(biāo)記地高辛，為了不影響完整的二級結(jié)構(gòu)的形成，參考文獻(xiàn)[2]，在選取的各個區(qū)域的5’端多出3個堿基，在3’端多出1 個堿基。A3、G10各選取了4 個區(qū)域（表1），其中A3-3、A3-4是A3-2的部分區(qū)域，G10-3包括了G10-1和G10-2兩個部分。用DNA folding form軟件分析后，選取的各區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)不受增加的堿基的影響，且與在適配子A3、G10二級結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)完全一致。

表1 選擇的區(qū)域及二級結(jié)構(gòu)Table1 Regions selected and their secondary structures

2.3 河豚毒素的固定

河豚毒素是一種小分子物質(zhì)，在測定河豚毒素與各區(qū)域的親和力時，需要固定河豚毒素。河豚毒素的分子式為C11H17O8N3，結(jié)構(gòu)特征是有1 個碳環(huán)，1 個胍基，6 個羥基，在C-5和C-10位有一個半醛糖內(nèi)酯連接著的分開的環(huán)（圖2）。丙烯酸-環(huán)氧乙烷珠子具有化學(xué)穩(wěn)定性高、極端的機(jī)械強(qiáng)度、非常良好的流動性能、良好的結(jié)合能力以及在pH值在0～12范圍不受限制的適用性等優(yōu)點，它通過環(huán)氧乙烷基團(tuán)可以與蛋白質(zhì)、硫醇、羥基和胺反應(yīng)。鑒于河豚毒素和丙烯酸-環(huán)氧乙烷珠子的特性，因此完全可以用丙烯酸-環(huán)氧乙烷珠子來固定河豚毒素。

圖2 河豚毒素的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of tetrodotoxin

2.4 抗地高辛堿性磷酸酶適宜稀釋倍數(shù)的測定結(jié)果

隨著抗地高辛堿性磷酸酶稀倍數(shù)的增加，加入底物后顯色反應(yīng)越來越弱，黃色越來越淺，稀釋度為5×103、1×104、2×104時，顏色均很明亮（圖3）。OD405nm值也隨著稀釋倍數(shù)的增加而減小，同一稀釋度的平行3 管的讀數(shù)接近，重復(fù)性好（表2）。當(dāng)稀釋度為1×104時，顏色過深超出了儀器的讀數(shù)范圍，而當(dāng)稀釋度為2×104時，OD405nm即為正常值，所以選擇2×104為抗地高辛堿性磷酸酶的適宜稀釋倍數(shù)。

圖3 不同稀釋倍數(shù)的抗地高辛堿性磷酸酶的顯色結(jié)果Fig.3 Coloration results of anti-digoxin alkaline phosphatase diluted at different ratios

表2 不同稀釋倍數(shù)的抗地高辛堿性磷酸酶的OD405nm測定值Table2 OD405nmvalues of anti-digoxin alkaline phosphatase diluted at different ratios

2.5 核心區(qū)域的識別結(jié)果

核心區(qū)域是通過測定各區(qū)域與河豚毒素的親和力來進(jìn)行識別的，而各區(qū)域與河豚毒素親和力的強(qiáng)弱通過酶標(biāo)儀測定的OD405nm值的大小來反映，數(shù)值越大親和力越強(qiáng)，OD405nm值最大或與原適配子接近的區(qū)域即為核心區(qū)域。親和力測定結(jié)果如表3所示。對于適配子A3，選定的4 個區(qū)域中，A3-1區(qū)域的OD405nm值與空白對照接近；A3-2區(qū)域的OD405nm值最大且稍大于適配子A3的OD405nm值；A3-3、A3-4區(qū)域的OD405nm值雖然大于A3-1區(qū)域，但都低于A3-2區(qū)域。對于適配子G10，選定的4 個區(qū)域中，G10-1、G10-2、G10-3區(qū)域的OD405nm值均低于G10，而G10-4區(qū)域的OD405nm值最大且稍大于適配子G10的OD405nm值。結(jié)果表明，原先含有78 個核苷酸的適配子A3的核心區(qū)域為A3-2區(qū)域，實際上含有47 個核苷酸；原先含有113 個核苷酸的適配子G10的核心區(qū)域為G10-4區(qū)域，實際上含有56 個核苷酸。

表3 各區(qū)域與河豚毒素親和力的OD405nm測定結(jié)果Table3 Results for the determination of aff i nity between each region with tetrodotoxin

3 討 論

河豚毒素是一種毒性很強(qiáng)的小分子物質(zhì)，目前使用較普遍的檢測方法是色譜法[28]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[29]、液相色譜-熒光檢測法[30]等，這些方法雖然特異性強(qiáng)、靈敏度高，但都需要昂貴的儀器且有很強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實驗成功篩選到2 條能與河豚毒素特異結(jié)合、親和力高的DNA適配子A3、G10，建立了基于DNA適配子的河豚毒素分子生物學(xué)檢測方法，無需昂貴的儀器和復(fù)雜的操作，具有操作簡便、成本低廉、快速、靈敏等優(yōu)點[26]，應(yīng)用于色譜檢測法中能很好地解決基質(zhì)抑制效應(yīng)[24]。適配子的二級結(jié)構(gòu)是適配子能與靶物質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，適配子的寡核苷酸之間可以通過堿基的相互作用，形成各種形狀的空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡、莖-環(huán)、凸環(huán)、G-四分體、假結(jié)等，這些結(jié)構(gòu)通過靜電引力、分子間氫鍵、分子堆積及形狀互補(bǔ)匹配等作用形式與靶物質(zhì)特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的靶物質(zhì)-核酸適體復(fù)合物。在國內(nèi)，雖然有多篇適配子（適體）的篩選及應(yīng)用的研究報道，但是還未見識別適配子核心區(qū)域的研究報道。河豚毒素DNA適配子A3、G10均包括了兩端固定序列和采用SELEX技術(shù)從隨機(jī)序列庫中篩選到的特定序列[20-21]，本實驗在分析適配子二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對其核心區(qū)域進(jìn)行了識別。

本實驗先前是采用DNAMAN軟件對適配子進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的分析[24-26]，根據(jù)分析得到的二級結(jié)構(gòu)合成各區(qū)域的序列，但是親和力測定結(jié)果都不滿意。參考了國外的研究報道[3,27]，采用DNA folding form在線軟件來分析適配子的二級結(jié)構(gòu)，終于獲得滿意結(jié)果，識別出適配子的核心區(qū)域。將適配子A3由78 個堿基縮短為47 個堿基，將GA10從113 個堿基縮短為56 個堿基，降低了合成序列的成本。從親和力測定結(jié)果看，2 個核心區(qū)域與河豚毒素的親和力均大于原適配子，可能與序列縮短了、避免了額外無關(guān)序列的干擾更容易形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，從而更有利于與河豚毒素的結(jié)合有關(guān)。識別到的2 個核心區(qū)域均較長，其二級結(jié)構(gòu)均較復(fù)雜，有可能是由于河豚毒素是小分子物質(zhì)，越復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)越有利于與河豚毒素的結(jié)合。河豚毒素DNA適配子A3的核心區(qū)域A3-2以及適配子G10的核心區(qū)域G10-4的應(yīng)用效果如何尚待研究。

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Identif i cation of Core Region of DNA Aptamers against Tetrodotoxin

SHAO Biying, CHEN Wenbing, LIU Zhengcai, MIAO Tingyu, PENG Juan, YANG Fang
(Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)

The secondary structures of DNA aptamers A3 and G10 against tetrodotoxin were analyzed using DNA folding form online software. Further, digoxin labeled 5’ end sequences of four regions in each aptamer were separately synthesized. Tetrodotoxin was fixed by acrylic acid-epoxy ethane beads. The core regions of these aptamers were identified using digoxin-anti digoxin alkaline phosphatase system to detect the affinity of these various regions with tetrodotoxin, after determining the appropriate dilution ratio of anti-digoxin alkaline phosphatase. The results showed that the suitable working concentration of anti-digoxin alkaline phosphatase was 2 × 104times dilution. The core region of aptamer A3 was A3-2 area which had the strongest aff i nity with tetrodotoxin among the four regions, including 47 nucleotides, while the core region of aptamer G10 was G10-4 area, including 56 nucleotides.

tetrodotoxin; aptamer; core region; aff i nity

10.7506/spkx1002-6630-201704042

Q78

A

1002-6630（2017）04-0260-05

邵碧英, 陳文炳, 劉正才, 等. 河豚毒素DNA適配子核心區(qū)域的識別[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 260-264. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704042. http://www.spkx.net.cn

SHAO Biying, CHEN Wenbing, LIU Zhengcai, et al. Identif i cation of core region of DNA aptamers against tetrodotoxin[J]. Food Science, 2017, 38(4): 260-264. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704042. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK104）

邵碧英（1973—），女，研究員，博士，研究方向為食品生物學(xué)分子檢測。E-mail：byshao@sohu.com