響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取碎米薺多糖工藝及其抗氧化活性

羅 凱，黃秀芳，周毅峰，張 弛

（湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取碎米薺多糖工藝及其抗氧化活性

羅 凱，黃秀芳，周毅峰，張 弛*

（湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000）

利用人工種植的碎米薺為原料，研究其粗多糖的提取工藝參數(shù)及抗氧化活性。首先對(duì)提取條件的單因素進(jìn)行優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化。單因素優(yōu)化條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%復(fù)合酶（m（纖維素酶）∶m（果膠酶）=2∶1）、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度60 ℃、酶解pH 4.0。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為：酶解時(shí)間91.8 min、酶解溫度57.1 ℃、酶解pH 4.17。在此條件下，碎米薺粗多糖提取率最高，粗多糖提取率預(yù)測值為4.14%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際粗多糖的平均提取率為4.07%；與理論預(yù)測值相比，其相對(duì)誤差約為1.62%?？寡趸钚匝芯拷Y(jié)果顯示，碎米薺多糖具有抗氧化活性，且效果優(yōu)于VC。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為碎米薺多糖的提取以及多糖的性質(zhì)研究提供理論依據(jù)。

碎米薺；多糖；提取條件；優(yōu)化

壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis），簡稱碎米薺屬1～2 a生草本植物，屬十字花科。大部分生長在海拔約1 000 m的山坡林下溝邊濕地，全世界發(fā)現(xiàn)了大約130 種，我國發(fā)現(xiàn)大約40 種。分布于我國南北各地[1]。碎米薺最初出現(xiàn)在《野菜譜》上[2]，碎米薺的幼嫩莖葉可以作為珍貴的野菜食用且口感良好。碎米薺藥用也有很長的歷史[3]，《食性本草》和《食療本草》均有相關(guān)記載。碎米薺屬中大多數(shù)種類都可以作為藥用，如紫花碎米薺（Cardamine tangutorum）能治黃水瘡和筋骨疼痛[4]；大葉碎米薺（Cardamine macrophylla）當(dāng)作草藥用可以利通小便、止痛和治療敗血病[5]；華中碎米薺（Cardamine urbaniana）的根狀莖可以治哮喘和支氣管炎[6]；光頭山碎米薺（Cardamine engleriana）的植株能化痰止咳；彈裂碎米薺（Cardamine impatiens）可以用于月經(jīng)不調(diào)；水田碎米薺（Cardamine lyrata Bunge）和碎米薺（Cardamine hirsuta）可以清熱去濕氣；彎曲碎米薺（Cardamine fl exuosa）可以清熱去濕健胃和止瀉[7]。同時(shí)有研究證明碎米薺具有超強(qiáng)的硒聚集功能[8-12]，其聚集的硒部分與多糖進(jìn)行結(jié)合，因此碎米薺多糖與一般植物多糖相比較，其功能更加豐富。碎米薺多糖不僅可以使癌細(xì)胞的DNA合成受阻而抑制癌細(xì)胞生長，而且可以通過提高相關(guān)酶的活性來拮抗重金屬中毒和抗氧化活性的能力[13-16]。碎米薺多糖的提取效率和質(zhì)量對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)碎米薺資源，生產(chǎn)出碎米薺保健品具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)人工種植碎米薺多糖提取條件的探索下，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法提取多糖的工藝，并進(jìn)行其體外抗氧化活性研究，旨在為碎米薺的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碎米薺采自于恩施市碎米薺人工種植基地。

纖維素酶（15 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、三正丁醇乙醇、氯甲烷、無水乙醇、乙醚（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

500 g XFB-200型多功能粉碎機(jī) 永康市小寶電器有限公司；DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；AL204電子天平（精確至0.000 1 g） 梅特勒-托利多儀器有限公司；AKHL-Ⅲ-24超純水機(jī) 成都康寧試驗(yàn)專用純水設(shè)備廠；RE5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；5417R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UV-3802H型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DF-101J型磁力攪拌器、SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；DHZ-C大容量冷凍恒溫振蕩器 江蘇太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 碎米薺粗多糖酶法提取工藝[17-20]

碎米薺材料干燥粉粹，過80 目篩，60 ℃干燥2 h。稱取100 g置于250 mL圓底燒瓶，加石油醚100 mL，75 ℃回流1 h脫脂，過濾，石油醚回收重復(fù)利用，濾渣揮干備用。準(zhǔn)確稱取1 g處理樣品，加蒸餾水100 mL，調(diào)pH值，升溫至50 ℃，加入酶，不同條件下進(jìn)行酶解，離心，濾液加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液使體系中乙醇含量達(dá)80%，冰箱靜置過夜沉淀。適量水溶解，加入3 倍體積Sevag試劑，振蕩、靜置、分液，再進(jìn)行2～3 次振蕩分離后醇沉過夜。沉淀再次溶解，定容至10 mL，苯酚-硫酸法測定粗多糖含量，按公式（1）計(jì)算提取率：

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及粗多糖含量的測定

粗多糖含量檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考文獻(xiàn)[21-22]。

1.3.3 碎米薺粗多糖提取單因素試驗(yàn)

在碎米薺粗多糖的酶法提取制備過程中，影響提取率最重要的因素是酶的種類和有效質(zhì)量濃度。為了研究這些因素對(duì)粗多糖提取率的影響規(guī)律，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行設(shè)置：控制碎米薺酶解溫度為60 ℃，酶解pH值為4，然后分別選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的果膠酶、纖維素酶以及2 種酶的復(fù)合酶，對(duì)碎米薺粉末進(jìn)行持續(xù)60 min的酶解反應(yīng)。對(duì)提取液進(jìn)行處理，測定碎米薺粗多糖的提取率。

選取優(yōu)化后的最優(yōu)復(fù)合酶，控制其他反應(yīng)條件（如酶解溫度60 ℃、pH 4），分別測定酶解時(shí)間為30、60、90、120、150 min時(shí)碎米薺粗多糖的提取率；根據(jù)以上研究結(jié)果，選取最優(yōu)復(fù)合酶組合，控制其他反應(yīng)條件（如酶解時(shí)間60 min、pH 4），分別測定酶解溫度為30、40、50、60、70 ℃時(shí)碎米薺粗多糖的提取率。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)最優(yōu)復(fù)合酶的酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）和酶解pH值（C）3 個(gè)因素進(jìn)行三因子響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化碎米薺粗多糖的復(fù)合酶提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案見表1。對(duì)各因素水平下碎米薺粗多糖提取率進(jìn)行測定，并以計(jì)算所得碎米薺粗多糖的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸分析。

表1 復(fù)合酶提取碎米薺粗多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table1 Coded values and corresponding actual values of factors used in Box-Behnken design

1.3.5 碎米薺粗多糖體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)[21-22]

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL以及DPPH溶液2 mL（0.08 mg/mL），置于預(yù)先編號(hào)的潔凈三角瓶中（100 mL），混勻，待反應(yīng)進(jìn)行30 min后于波長517 nm處測定其吸光度，用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。按照公式（2）計(jì)算碎米薺粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除率：

式中：ADPPH為DPPH溶液的吸光度；A樣品為加入樣品溶液或加入VC后樣品DPPH溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)檢測中，每組數(shù)據(jù)均檢測3 次取平均值，采用Origin 7.5軟件以及Excel 2007進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響

表2 酶種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響Table2 Effects of type and dosage of enzyme on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis

如表2可知，不同種類和配比的酶對(duì)碎米薺粗多糖的提取率影響各不相同，但規(guī)律基本一致，且粗多糖的提取率都隨酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)先增大后稍微有減少的變化趨勢(shì)。纖維素酶、果膠酶、纖維素-果膠復(fù)合酶（1∶1、1∶2、2∶1，質(zhì)量比）均在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，碎米薺粗多糖提取率達(dá)到最大。其中，由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的纖維素-果膠復(fù)合酶（2∶1）輔助提取時(shí)，碎米薺粗多糖的提取率最高達(dá)到3.95%。因此本研究擬定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的纖維素-果膠復(fù)合酶（2∶1）為最佳復(fù)合酶，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響

圖1 酶解時(shí)間對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis

由圖1可知，在提取的前90 min內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長，碎米薺粗多糖的提取率逐漸上升；但在90 min后提取率反而呈逐步下降趨勢(shì)。這種變化趨勢(shì)可能與酶發(fā)揮作用的最適反應(yīng)時(shí)間以及酶的最適反應(yīng)溫度有關(guān)，因此發(fā)現(xiàn)酶促提取時(shí)間越長不一定越適合酶的活力發(fā)揮。據(jù)此，最佳的碎米薺酶解時(shí)間為90 min，此時(shí)粗多糖的提取率最高。

2.1.3 酶解溫度對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響

圖2 酶解溫度對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis

如圖2所示，溫度低于50 ℃時(shí)，隨著溫度的提升，酶的活性也隨著升高，碎米薺粗多糖的提取率也隨之提高；但溫度超過50 ℃以后，粗多糖的提取率變化不大，溫度超過60 ℃以后，提取率下降十分明顯，這可能是當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，酶蛋白開始受熱變性，使得酶的活性降低，從而降低了粗多糖的提取率。據(jù)此擬確定碎米薺粗多糖提取的最佳酶解溫度應(yīng)約為60 ℃。

2.1.4 酶解pH值對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響

pH值過小（過酸）、過大（過堿）都能使酶蛋白變性而失活，pH值的改變能影響酶活性中心上必須基團(tuán)的解離程度，同時(shí)也可以影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化，只有在特定的pH值條件下，酶、底物和輔酶的解離狀態(tài)，最適宜它們相互結(jié)合，并發(fā)生催化作用，從而使酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值。如圖3所示，當(dāng)提取液的pH值由2.0升至4.0時(shí)，碎米薺粗多糖的提取率隨著pH值的升高而提高，在pH值大于4.0后碎米薺粗多糖的提取率隨著pH值的升高而下降。結(jié)果表明復(fù)合酶在pH 4.0條件下活性較好，因此將酶解最佳pH值定為4.0，此時(shí)碎米薺粗多糖的提取率最高。

圖3 酶解pH值對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of initial pH on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碎米薺粗多糖提取率的二次多項(xiàng)回歸方程

表3 復(fù)合酶提取碎米薺粗多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

通過單因素優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在酶解過程中當(dāng)纖維素酶與果膠酶的復(fù)配比例2∶1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%）、酶解的時(shí)間控制在90 min、溫度控制在60 ℃、pH值調(diào)至4.0時(shí)，能夠得到碎米薺粗多糖的最大提取率。如表3所示，將酶解時(shí)間、酶解pH值和酶解溫度作為研究的對(duì)象條件，以碎米薺粗多糖提取率為響應(yīng)值，共得到17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)為析因點(diǎn)，1 個(gè)為中心點(diǎn)，中心點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行了5 次，用來估計(jì)誤差。利用Design-Expert 7.5軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到碎米薺粗多糖提取率對(duì)以上因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=4.074+0.065A-0.414B+0.210AB-0.255AC-0.356BC-0.781A2-0.563B2-0.638C2。

2.2.2 回歸模型的方差分析

表4 二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table4 Analysis of variance the regression model

對(duì)復(fù)合酶法輔助提取碎米薺粗多糖的回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)，回歸模型的方差分析如表4所示。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)，該試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.000 1），方差的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.136 5＞0.05），說明模型的選擇是合適的；另外，所選模型的R2為0.997，證明該模型能解釋99.7%的結(jié)果值的變化規(guī)律，僅有總變異0.3%不能用該模型來解釋，基本可用于復(fù)合酶輔助提取碎米薺粗多糖的分析與預(yù)測。同時(shí)，表4結(jié)果還顯示，在此試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，A項(xiàng)顯著（P＜0.05），B、AB、AC、BC、A2、B2、C2項(xiàng)均為極顯著（P＜0.01），C項(xiàng)不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析與最佳提取條件的確定

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effect of various hydrolysis conditions on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis

如圖4所示，通過對(duì)以上3 個(gè)曲面的分析可以預(yù)測和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值以及確定變量之間的相互關(guān)系[25]，響應(yīng)面越陡，反映出各因素之間的兩兩交互作用越顯著。同樣，等高線的形狀也可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[26]。通過響應(yīng)面的陡峭程度分析發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間對(duì)碎米薺粗多糖提取率的影響最大，其次是酶解溫度和酶解pH值，這與方差分析結(jié)果一致。

通過Design-Expert 7.5軟件分析，獲得碎米薺粗多糖的最佳復(fù)合酶輔助提取條件：酶解時(shí)間91.8 min、酶解溫度57.1 ℃、酶解pH 4.17。在此條件下，碎米薺粗多糖的提取率最高，粗多糖的提取率預(yù)測值為4.14%，在此條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)），得到實(shí)際粗多糖的平均提取率為4.07%；與理論預(yù)測值相比，其相對(duì)誤差約為1.62%，說明模型可以較好地反映出碎米薺粗多糖提取的條件。

2.2.4 碎米薺粗多糖體外抗氧化活性分析

圖5 碎米薺粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH free radical-scavenging effect of Cardamine hupingshanensis polysaccharides

大多數(shù)從植物體內(nèi)提取的多糖都具有抗氧化活性。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了碎米薺粗多糖也具有一定的抗氧化活性，并對(duì)其抗氧化活性與VC的抗氧化活性進(jìn)行比較。如圖5所示，在設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著碎米薺粗多糖質(zhì)量濃度的升高，對(duì)DPPH自由基清除率也隨之升高，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其DPPH自由基清除率均大于VC。

3 結(jié) 論

酶具有速度快、專一性強(qiáng)和反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，在酶提取多糖的研究中所用的酶有果膠酶、淀粉酶、半纖維素酶和纖維素酶等[21-22]。酶在提取植物多糖時(shí)能快速除去沒有生物活性纖維素、分解細(xì)胞壁和淀粉雜質(zhì)等，從而能大大提高提取率[23-24]。本實(shí)驗(yàn)利用人工種植的碎米薺為原料，研究其粗多糖的復(fù)合酶法提取工藝參數(shù)及其抗氧化活性。抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明碎米薺粗多糖具有抗氧化活性，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其抗氧化活性強(qiáng)于VC，與其他植物多糖相比較，碎米薺粗多糖的抗氧化活性略強(qiáng)于阿克蘇駿棗多糖[25]，略差于松茸多糖[26]，這可能與粗多糖的提取純度有關(guān)，下一步實(shí)驗(yàn)將對(duì)碎米薺粗多糖進(jìn)一步純化，進(jìn)行后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為碎米薺多糖的提取以及多糖的性質(zhì)研究與運(yùn)用提供了一定的理論依據(jù)。

[1] 劉蚌, 鄭甲成, 張百忍. 碎米薺屬研究現(xiàn)狀及前景展望[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012(4): 127-129. DOI:10.3969/j.issn.0488-5368.2012.04.044.

[2] 向極釬, 李亞杰, 楊永康, 等. 碎米薺的研究現(xiàn)狀[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011, 29(4): 440-443. DOI:10.3969/ j.issn.1008-8423.2011.04.021.

[3] 孫紫薇, 施波, 石開明, 等. 湖北省恩施高硒地區(qū)碎米薺的形態(tài)特征與核型分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(2): 199-200. DOI:10.3969/ j.issn.1002-1302.2010.02.082.

[4] 劉曉靜, 朱學(xué)靈, 田野, 等. 天然銳齒櫟林下紫花碎米薺的生長特性[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011, 32(5): 53-59. DOI:10.3969/j.issn.1672-6871.2011.05.014.

[5] 周凱, 李東輝, 劉江舟, 等. 大葉碎米薺膠囊治療腰肌勞損76例臨床觀察[J]. 中醫(yī)中藥, 2011, 32(8): 99-100. DOI:10.3969/ j.issn.1673-7210.2011.32.044.

[6] 趙利霞, 譚軍, 潘思軼, 等. 華中碎米薺礦質(zhì)元素分析[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9): 385-387. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2005.09.098.

[7] 劉婷, 鄭甲成, 張百忍. 碎米薺屬研究現(xiàn)狀及前景展望[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 58(4): 127-129. DOI:10.3969/j.issn.0488-5368.2012.04.044.

[8] 彭誠, 丁莉, 羅紅藝. 堇葉碎米薺不同生長期營養(yǎng)成分與含硒量的關(guān)系[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(9): 1860-1861. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2006.09.050.

[9] 陳里, 楊大偉, 周海燕, 等. 恩施碎米薺硒多糖提取條件的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 8(8): 1459-1461. DOI:10.3969/ j.issn.1673-6273.2008.08.019.

[10] 趙利霞. 碎米薺硒多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006. DOI:10.7666/d.Y1004846.

[11] 石寶霞, 車會(huì)蓮, 趙利霞, 等. 碎米薺硒多糖的分離純化及光譜分析[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(6): 298-302. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.06.072.

[12] 楊帆. 白花碎米薺正丁醇萃取部分化學(xué)成分研究[D]. 天津: 天津大學(xué), 2010. DOI:10.7666/d.y1874370.

[13] HU Y J, CHEN Y, ZHANG Y Q, et al. The protective role of selenium on the toxicity of cisplatin-contained chemotherapy regimen in cancer patients[J]. Biological Trace Element Research, 1997, 56(3): 331-336. DOI:10.1007/BF02785304.

[14] 仇玉蘭, 祝壽芬, 韓光. 砷對(duì)機(jī)體抗氧化能力的影響及硒多糖的拮抗作用[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志, 2001, 15(2): 86-87. DOI:10.3969/ j.issn.1002-3127.2001.02.008.

[15] 戴偉娟, 仲偉法, 索金良, 等. 4-硒酸醋多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel/7402、DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成的影響[J]. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 24(l): 18-19. DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2001.01.007.

[16] 唐福, 周靜, 谷連坤, 等. 富硒大蒜對(duì)體內(nèi)外人胃癌細(xì)胞生長的影響[J]. 中華腫瘤雜志, 2001, 23(6): 461-464. DOI:10.3760/ j.issn:0253-3766.2001.06.007.

[17] 李小平, 陳錦屏. 油棗多糖的酶法提取及其對(duì)多糖分子量分布的影響[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(8): 191-194. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.08.042.

[18] CHANDINIA S K, JAGANMOHAN R L, GOWTHAMAN M K, et al. Enzymatic treatment to improve the quality of black tea extracts[J]. Food Chemistry, 2011, 127(3): 1039-1045. DOI:10.1016/ j.foodchem.2011.01.078.

[19] 龔玉雷. 纖維素酶和果膠酶復(fù)合體系在茶葉提取加工中的應(yīng)用研究[D]. 杭州: 浙江工業(yè)大學(xué), 2013. DOI:10.7666/d.Y2411335.

[20] 李亞輝, 馬艷弘. 黃開紅, 等. 蘆薈多糖的超聲波輔助纖維素酶提取及抗腫瘤活性研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2015, 15(11): 91-96. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.11.014.

[21] 尹團(tuán)章, 熊國璽, 王娜, 等. 復(fù)合酶輔助微波技術(shù)提取紅棗多糖的工藝研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 55(7): 1799-1801. DOI:10.14088/ j.cnki.issn0439-8114.2016.07.044.

[22] 齊欣欣, 王遂. 假酸漿多糖的酶法提取及純化工藝的研究[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 32(2): 220-224. DOI:10.3969/ j.issn.1672-0946.2016.02.022.

[23] 張?jiān)? 趙微, 趙欣言, 等. 酶法輔助超聲波提取玉米皮多糖的工藝研究[J]. 糧食與油脂, 2015, 28(12): 49-53. DOI:10.3969/ j.issn.1008-9578.2015.12.014.

[24] 衛(wèi)喬宇, 游江, 汪蘭, 等. 纖維素酶法提取山藥多糖的工藝優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(20): 4926-4930. DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.041.

[25] 陳煉紅, 楊麗珠, 索化夷, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化松茸多糖酶法提取工藝及其體外抗氧化性分析[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(16): 23-28. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201416005.

[26] 黎云龍, 于震宇, 郜海燕, 等. 駿棗多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J].食品科學(xué), 2015, 36(4): 45-49. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201504009.

Optimization of Multi-Enzymatic Extraction of Polysaccharides from Cardamine hupingshanensis and Their Antioxidant Activity

LUO Kai, HUANG Xiufang, ZHOU Yifeng, ZHANG Chi*
(Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province, College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

The extraction of crude polysaccharides from cultivated Cardamine hupingshanensis was optimized by the combined use of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The results of one-factor-at-a-time experiments demonstrated hydrolysis with a mixture (2:1, m/m) of cellulase and pectinase at a dosage of 2% (m/m) at 60 ℃ and an initial pH of 4.0 for 90 min to be optimum for the extraction of polysaccharides. Furthermore, the extraction conditions optimized by response surface methodology were as follows: hydrolysis time, 91.8 min; hydrolysis temperature, 57.1 ℃; and intial pH, 4.17. Under these conditions, the predicted maximum yield of polysaccharides of 4.14% was obtained, and experiments gave an average value of 4.07%, indicating a relative error of about 1.62% the predicted and experimental values. The results of antioxidant assays showed that Cardamine hupingshanensis. polysaccharides possessed antioxidant activity better than that of VC. Our experimental results provide an experimental basis for studying the extraction and properties of Cardamine hupingshanensis polysaccharides.

Cardamine hupingshanensis; polysaccharide; extraction parameters; optimization

10.7506/spkx1002-6630-201704038

TS255.36

A

1002-6630（2017）04-0237-06

羅凱, 黃秀芳, 周毅峰, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取碎米薺多糖工藝及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 237-242. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704038. http://www.spkx.net.cn

LUO Kai, HUANG Xiufang, ZHOU Yifeng, et al. Optimization of multi-enzymatic extraction of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2017, 38(4): 237-242. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704038. http://www.spkx.net.cn

2016-06-21

湖北民族學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（MY2015B031）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31360498）；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（D20131902）；恩施州科技局技術(shù)支撐項(xiàng)目（D20160055）

羅凱（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：luokai_79@163.com

*通信作者：張弛（1965—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)榈胤教厣称焚Y源開發(fā)。E-mail：zhtzu@163.com