長鏈非編碼LncRNA與雄性生殖初探

劉康生　沈一婷　潘峰　陳亞軍

高等生物體能通過轉(zhuǎn)錄生成大量RNA，尤其以哺乳動物轉(zhuǎn)錄出的 RNA 數(shù)量龐大且種類繁多,而這些轉(zhuǎn)錄本中，只有非常小的一部分(約 25000 個基因)可以編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)或者多肽,這些編碼蛋白質(zhì)的序列總長度只占基因組序列的約 2%，剩余的轉(zhuǎn)錄本均可歸類為非編碼RNA(non-coding RNA)。ncRNA 基本包括 siRNA、miRNA piRNA，lncRNA等幾大類，ncRNA 根據(jù)其分子鏈長度可進一步分為長度小于200nt的短鏈非編碼RNA (small non-coding RNA,sncRNA)和大于200nt的長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNAs通常是多聚腺苷酸化的，受 RNA 聚合酶 Ⅱ 催化轉(zhuǎn)錄合成，主要分布于胞核，在胞漿中也有存在[1]?？茖W界曾經(jīng)認為,相對于功能基因這一類不編碼蛋白質(zhì)的 RNA 是轉(zhuǎn)錄背景噪音(不具備實質(zhì)性的生物學功能)[2-3]。近來的研究表明所關(guān)注對象lncRNA普遍表達在哺乳動物細胞里具有非常廣泛的生物學功能。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)人類基因組雖然有大量轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，但mRNA 在轉(zhuǎn)錄物中的比重僅占 1.2%，而 ncRNAs 在轉(zhuǎn)錄組中的含量竟高達98%以上[4]，提示ncRNAs 可能在生物體內(nèi)具備豐富的生物學功能。在過去的研究中，sncRNA 作為分子生物學領(lǐng)域的研究熱點，已被證實能在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上對靶基因的表達進行調(diào)控[5-6]。然而，作為分子鏈更長、結(jié)構(gòu)更為復雜、量更多的lncRNA的研究才剛起步。關(guān)于這類基因中“暗物質(zhì)”的研究卻已在近年來取得了一定的發(fā)展。

據(jù)世界衛(wèi)生組織( WHO)調(diào)查，育齡夫婦中約 15% 存在不育問題，而發(fā)展中國家某些地區(qū)可高達 30%,其中有50%以上的因素是由男方因素導致的[7]。近年來，不育己儼然成為困擾全球范圍無數(shù)育齡家庭的嚴峻問題，加上環(huán)境食品安全、電磁波輻射、生活情緒壓力增大的影響，人類生殖能力出現(xiàn)下降趨勢，不育癥發(fā)病率將隨之提高[8]。雖然現(xiàn)代諸如“試管”嬰兒(ICSI:卵母細胞胞漿內(nèi)單精子注射)等的輔助生殖技術(shù)為己知病因的男性不育患者帶來一定期望，但是仍然有很多男性不育患者病因并不明確(如：非梗阻性無精癥)，為臨床治療帶來很大瓶頸[9]。

正常男性每天產(chǎn)生超過一億精子，每一個成熟精子生成都是由一個稱為精子發(fā)生的復雜調(diào)控過程完成的。精子發(fā)生(spermatogenesis)是一個復雜且受到精確調(diào)控的生殖細胞增殖、分化過程，涉及多種基因的調(diào)控、染色體重構(gòu)及其他多種因素的共同作用[10]。哺乳動物精子發(fā)生過程中圓形精子發(fā)生階段轉(zhuǎn)錄停滯，生殖細胞復雜的轉(zhuǎn)錄子包括mRNA,非編碼RNA生成，進行基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。研究結(jié)果表明，一些 lncRNA 與胚胎干細胞、誘導多能干細胞、精原干細胞等重要干細胞的增殖分化和自我更新過程關(guān)系密切(例如：HOTAIRM1 lncRNA等)，也參與了調(diào)控細胞周期，細胞凋亡等過程，并在抑制腫瘤(包括：乳腺癌、卵巢癌等)過程中發(fā)揮重要作用[11-14]。評估男性生育能力的主要分子學方法(包括：精子DNA損傷、精漿游離miRNA、精子線粒體基因變異和缺失等)為不育癥病因分析領(lǐng)域起到了一定作用。最近幾年來，長鏈非編碼RNA作為轉(zhuǎn)錄組中的重要成員，在精子發(fā)生以及相關(guān)疾病中的作用被不斷發(fā)現(xiàn)，引起越來越多的關(guān)注[15]，如前所述，長鏈RNA分子在腫瘤、動物發(fā)育等領(lǐng)域均起著重要的作用[11-14]，同樣它在男性生殖方面也顯示出良好的應(yīng)用效能和前景。

本文主要初步綜述了 lncRNA 的來源、分類標準、作用機制、結(jié)構(gòu)預測及相關(guān)研究方法、LncRNA與男性不育等，為更好地理解和研究 lncRNA 在生物體內(nèi)的作用提供參考。

一、LncRNA概述及作用機制

在分子生物學的中心法則中，DNA儲存穩(wěn)定遺傳信息，蛋白質(zhì)行使遺傳信息的生物學功能，而RNA的主要功能是在蛋白質(zhì)和基因間起媒介作用。實際情況，整個基因組僅2%可翻譯成蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。大量的轉(zhuǎn)錄基因并不編碼蛋白質(zhì)，這些轉(zhuǎn)錄物被稱為非編碼RNA LncRNA。LncRNA生物來源廣泛，可粗略劃分為 5 類[16-17]：(I) lncRNA 中相鄰重復單元結(jié)構(gòu)由串聯(lián)復制產(chǎn)生；(II)染色體重組過程中，由多個未轉(zhuǎn)錄且彼此分開的基因序列并置重組產(chǎn)生；(III)在逆轉(zhuǎn)錄過程中，由非編基因復制產(chǎn)生；(IV)由蛋白質(zhì)編碼基因框架結(jié)構(gòu)斷裂產(chǎn)生；(V)直接由轉(zhuǎn)座因子插入產(chǎn)生。

隨著新一代高通量測序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，生物體內(nèi)成千上萬的lncRNAs在近幾年不斷被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于lncRNA的生物學分類標準也隨之不斷更新發(fā)展，目前 lncRNA 的分類并沒有統(tǒng)一的標準。

1.根據(jù)轉(zhuǎn)錄物長分為5類：(I)lncRNA；(II) 位于基因間區(qū)的超長鏈非編碼RNA(very long- integenic noncoding RNA)；(III) 基因間區(qū) 長 鏈 非 編 碼 RNA(long- integenic noncodingRNA,lincRNA)；(IV) 宏RNA(macro RNA)；(V) 與啟動子相關(guān)聯(lián)的 lnc paRNA(promoter- associated long RNA)。

2.根據(jù)與蛋白質(zhì)編碼 RNA 的相似程度可分為 mlncRNA 和 lin-cRNA。

3.根據(jù)其生物學功能可分為 4 類：(I) 作為mi RNA初級轉(zhuǎn)錄本的 lncRNA； (II) 具有增強子作用的lncRNA；(III)作為 pi RNA 初級轉(zhuǎn)錄本的 lncRNA；(IV)競爭性內(nèi)源 RNA 。起初 lncRNA 被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是 PolⅡ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具備任何生物學功能[18-19]。

近年來lncRNA在表觀遺傳學水平通過DNA甲基化或去甲基化，RNA干擾，組蛋白修飾，染色質(zhì)重構(gòu)等表達，在精子發(fā)生及受精過程等生殖過程中起了重要的作用[20-27]。不僅如此，有些 lncRNA 還可作為某些功能性 sn-cRNA，如microRNA 、siRNA和 piwiRNA 等的前體物 質(zhì) 間 接 參 與 靶 基 因 的 調(diào) 控[27]。此外，lncRNA 不僅在表達方式上具有極強的時空特異性[28]在生物體內(nèi)，lncRNA 主要通過 4 種方式行使其生物學功能[29]：(I)招募染色質(zhì)修飾相關(guān)酶，并指導該蛋白復合物順式或反式定位到調(diào)控位點(引導分子的方式)；(II)直接與轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)分子等相關(guān)物質(zhì)結(jié)合，阻斷其對靶基因的作用，間接調(diào)控目標基因的轉(zhuǎn)錄(誘餌分子的方式)；(III)通過識別轉(zhuǎn)錄因子在信號通路中的聯(lián)合作用來調(diào)控靶基因的表達(信號分子的方式)；(IV)作為中央平臺招募多種蛋白質(zhì)分子并形成核糖核蛋白復合物，通過影響組蛋白修飾在表觀遺傳水平上對靶基因進行調(diào)控(支架分子的方式)。

此外，一些lncRNA 在作用方式上還具有多樣性，可同時以信號分子、誘餌分子、引導分子、支架分子中的多種方式參與基因的表達調(diào)控，例如由同源異型框基因 C(homeoboxC,HOXC)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的同源異型框基因反義基因間RNA (HOX antisense intergenic RNA,HOTAIR)在多梳抑制復合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2) 和賴氨酸特異性脫甲基酶 1(lysine- specificdemethylase 1,LSD1)/轉(zhuǎn)錄因子沉默元件 1 輔阻遏物(corepressor for repressor element-1 silencing transcription factor,Co REST)/轉(zhuǎn)錄因子沉默元件 1(repressor element- 1 silencing transcription factor,REST)復合體的招募過程中發(fā)揮著支架分子作用，而在指導PRC2靶向作用于HOXD相應(yīng)基因位點時又充當引導分子的角色。與 mRNA 不同，lncRNA 在一級序列上幾乎沒有保守性，但lncRNA的一些局部序列，如啟動子區(qū)域附近和剪切位點序列保守性卻很強[30]。使得大量 lncRNA 擁有高度保守的二級、三級結(jié)構(gòu)，這些高度保守的結(jié)構(gòu)對其生物學功能的發(fā)揮起著決定性作用。

二、 lnc RNA與雄性生殖

1.表觀遺傳與雄性生殖

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，是強烈的參與基因表達的生理控制，在基因表達調(diào)控精子發(fā)生過程起著舉足輕重的作用[31],在哺乳動物，DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化影響基因的表達，進而影響男性生殖器官的發(fā)育、精子的形成和男性性行為，這表明DNA甲基化的異?？赡苷T導男性發(fā)育及生殖功能的改變。H19基因?qū)儆谌祟惏l(fā)育印跡基因，為目前公認的LncRNA，不表達蛋白質(zhì)產(chǎn)物。2013年李建波等通過染色體核型分析和Y染色體微缺失檢測排除染色體因素干擾篩選出18例單一因素少精子癥患者研究結(jié)果顯示:CTCF6位點的DNA甲基化狀態(tài),少精子癥患者的DNA甲基化丟失程度(2.67±0.75)%顯著高于對照組(0.05±0.03)%和弱精子癥組(0.03±0.02)% ，在少精子癥男性不育患者中，印跡基因H19印記控制區(qū)域DNA甲基化的丟失明顯，而且其精子濃度越低，甲基化丟失程度越高，且與精子活力無關(guān)[32]。

組蛋白修飾影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，通過多種修飾方式的組合發(fā)揮其調(diào)控功能。組蛋白的各種修飾方式存在協(xié)同或拮抗的關(guān)系。組蛋白的甲基化由甲基化轉(zhuǎn)移酶介導，賴氨酸殘基可以發(fā)生單甲基化、二甲基化或三甲基化，精氨酸或賴氨酸的甲基化參與了精子發(fā)生過程中基因轉(zhuǎn)錄的激活或抑制，直接或間接影響精子的發(fā)生。精子發(fā)生過程中這兩種酶所催化的H3和H4上賴氨酸殘基的乙?；腿ヒ阴；诰影l(fā)生過程中起了重要的調(diào)控作用。組蛋白的磷酸化通常與基因激活有關(guān)。組蛋白變體H2AX的磷酸化(也稱為RH2AX)在精子發(fā)生過程中與減數(shù)分裂期間的基因沉默有關(guān)。2013年邱小波等研宄發(fā)現(xiàn)，在精子發(fā)生和體細胞 DNA 損傷修復過程中，組蛋白均會降解，修正了科學界關(guān)于體細胞組蛋白不降解的理論。在精子發(fā)生過程中，單倍體基因組中約96%的組蛋白最終都會丟失，只有4%的組蛋白將其所載表觀遺傳信息傳給了下一代。精子中組蛋白的選擇性降解可能有利于清除可導致疾病的表觀遺傳印記，并避免清除父代獲得的、有益的表觀遺傳印記。其第一次揭示組織特異性蛋白酶體的存在，發(fā)現(xiàn)哺乳動物睪丸中的多數(shù)蛋白酶體(被命名為“生精蛋白酶體”)包含一個特殊激活因子，一個精細胞和精子特異的且與激活因子相鄰的新亞基及三個特殊的催化亞基。 正是這一睪丸特異性蛋白酶體負責精子發(fā)生過程中依賴于乙?；慕M蛋白降解[33]。

最近研究者在雄性生殖細胞發(fā)育過程中的實驗結(jié)果表明lncRNAs表達受到動態(tài)調(diào)控，其能通過遺傳和表觀遺傳兩種機制，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個水平調(diào)控基因表達。具體采用Arraystar Mouse LncRNA芯片對6個時間關(guān)鍵點的lncRNA和mRNA表達進行分析(每個時間點取3對哺乳動物睪丸)結(jié)果發(fā)現(xiàn)均有成百的lincRNA和上千的lncRNAs表達上調(diào)或下調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)被高度調(diào)控的lncRNAs與臨近(<30 KB)mRNA基因簇的表達上調(diào)或下調(diào)高度相關(guān)[34]。

2.lnc RNA NEAT1、lnc RNA Mrhl與雄性生殖

精子發(fā)生過程涉及精原干細胞的命運決定，其通過定向分化產(chǎn)生精子，這個過程非常復雜，涉及很多相關(guān)基因的特異性和時序性表達〔比如在SSCs (spermatogonial stem cells)〕自我更新過程中起重要作用的Bcl6b、Etv5 等，與 SSCs 分化相關(guān)的基因Kit L、EPCAM)等。NEATl是一個長鏈非編碼 RNA，其在小鼠中的轉(zhuǎn)錄本長度約 3.2 kb。目前NEAT1主要發(fā)現(xiàn)其參與旁斑(paraspeckle)結(jié)構(gòu)的形成并且能與其他的蛋白質(zhì)-RNA 復合體共同參與修飾和加工處理編碼蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄等生物學過程。2014年Junhui的研究結(jié)果表明NEAT1 在小鼠睪丸組織、GC-1 細胞系中均表達,注射慢病毒之后，干擾組的小鼠睪丸指數(shù)比對照組有增加，但是實驗結(jié)果顯示這種變化不顯著；而干擾組有精子發(fā)生的曲細精管比例下降到 86%，小鼠睪丸中精子發(fā)生受到影響，表明 NEAT1 參與調(diào)控雄性小鼠的精子發(fā)生[26]。

Mrhl 是一個位于細胞核由小鼠基因組編碼，并在睪丸表達，大小為 2.4 kb 單外顯子 lncRNA[35]。Ganesan & Rao2008年的研究表明 MrhlRNA 可能通過 2種分子機制調(diào)控精子發(fā)生。一是通過 Drosha 分裂 Mrhl 形成一個 80 nt 的 RNA 中間體。證據(jù)表明這些 RNAs 都位于GC1 精原細胞系的細胞核內(nèi)，暗示其與染色質(zhì)可能存在互作的關(guān)系[36]。并且，第一個顯示調(diào)節(jié)的 wnt 信號在調(diào)節(jié)哺乳動物精子發(fā)生過程中起著非常重要的作用[37]。其通過與 p68 互作在小鼠精原細胞的 wnt 信號中發(fā)揮負調(diào)控作用。在 GC-1 Spg 細胞系中敲低 Mrhl RNA的表達，能導致一些與細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞發(fā)育及分化相關(guān)基因表達的紊亂，這其中大多是 wnt 信號通路中的基因[13]。由于Wnt信號通路能夠?qū)е录毎只?，抑制細胞增殖，因此Mrhl在精原細胞的分裂和分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用[38]。就目前而言，仍需要通過基因敲除動物模型來進一步研究lncRNA Mrhl 對精子發(fā)生的調(diào)控作用。

3.lnc RNA Hongr ES2、 lnc RNA NLC1-C與雄性生殖

臨床上男性不育的常見原因之一是精子的成熟阻滯(maturation arrest，MA)。Hongr ES2 是 一 種來自于大鼠的5和9號染色體的轉(zhuǎn)錄物嵌合形成且表 達 于 附 睪長度為1588nt的特 異lncRNA。其表達起始于第一輪精子發(fā)生剛剛完成時，隨后逐漸增高，到第450天左右時趨于穩(wěn)定，時空特異性的表達對在精子成熟中起到了重要作用?；A(chǔ)實驗中檢測出Hongr ES2剪切后產(chǎn)生的mil-HongrES2下調(diào)CES7基因表達其表達產(chǎn)物在精子獲能(capacitation)過程中具有重要作用[39]。有趣的現(xiàn)象是，細胞核中mil-Hongr ES2的含量很少，而其前體Hongr ES的含量卻很多，表明核內(nèi)可能存在一種未知的剪切抑制機制。進一步的實驗表明，mil-Hongr ES2的過量表達也會引起細胞內(nèi)酪氨酸的廣泛磷酸化，而后者是與精子獲能相關(guān)的信號級聯(lián)激活的標志。因此，Hongr ES2可以調(diào)控精子的成熟過程[38]此外，通過整體酪氨酸磷酸化水平分析表明 mil-Hongr ES2 的過度表達會導致精子獲能的弱化，這表明對于附睪中正常的精子成熟過程而言，內(nèi)源性低水平表達的 Hongr ES2 具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[40]。

NLC1-C(narcolepsy candidate-region 1 genes)是一種僅在精原細胞和早期精母細胞表達的基因間 lncRNA，主要表達于細胞質(zhì)，其在精子的成熟阻滯(maturation arrest，MA)患者中的表達量降低，但在細胞核中的表達上調(diào)。微陣列分析技術(shù)可見健康對照者與 MA 患者的睪丸 lncRNA 表達譜之間存在明顯差異。NLC1-C 在細胞質(zhì)的過表達能夠促進細胞增殖，若被敲除則細胞增殖受到抑制并加速凋亡。體外細胞試驗表明，NLC1-C 能夠與位于核仁素的 RBD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合共同抑制 mi R-320a 和 mi R-383 的轉(zhuǎn)錄，而 mi R-320a 和 mi R-383 在加工成熟后則能直接抑制 NLC1-C 的作用以此調(diào)節(jié)細胞的存活。由此細胞核內(nèi) NLC1-C 的高表達可以加強對 miR-320a 和 miR-383 的轉(zhuǎn)錄抑制，進而導致精原細胞和初級精母細胞的過度增殖和成熟阻滯[41]。

4.lncRNA可能多通過微調(diào)的方式調(diào)控全局基因表達

伴隨高通量測序技術(shù)發(fā)展，構(gòu)成真核生物基因組中的大量“暗物質(zhì)”近幾年在睪丸組織中呈現(xiàn)高度特異性lncRNA表達，提示lncRNA的功能機制在精子發(fā)生基礎(chǔ)生命學過程具有一定意義。2016年高冠軍以模式生物果蠅為代表(基因組強凈化的遺傳學模式生物)，在果蠅活體上的研究，很大程度上填充了功能性非編碼 RNA在其活體水平所缺乏的遺傳學證據(jù)。具體采用優(yōu)化后的CRISPR技術(shù)進行了長鏈lncRNA活體功能研究，研究結(jié)果表明，通過對突變體雄性果蠅測試(精子發(fā)生發(fā)育、活力等)進行實驗分析，發(fā)現(xiàn)1/3的lncRNA基因的缺失會導致精子發(fā)育異常。一部分測試的lncRNAs敲除果蠅均可通過易位轉(zhuǎn)基因得以完全或部分修復，說明這些lncRNAs主要以反式(trans)發(fā)揮作用?；虮磉_譜顯示，大部分功能性lncRNAs在精子發(fā)生中調(diào)控全局基因的表達。進化分析表明，與編碼基因相比，lncRNAs演化更快，且具有更大功能重要性的lncRNAs處于不斷的進化選擇之下(具有較高的序列保守性)。另外，lncRNA可能多通過微調(diào)(fine-tune)的方式調(diào)控全局基因表達，這一點與蛋白編碼基因的開關(guān)調(diào)控作用相區(qū)別，對雄性生殖細胞分化的發(fā)育產(chǎn)生積極意義[42]。

三、結(jié)論與展望

綜上所述，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)與精子發(fā)生緊密相關(guān)，并參與雄性生殖細胞增殖、分化的調(diào)控過程，與miRNA不同的是，大部分LncRNA物種間保守性差，這些LncRNA存在未知的功能需要進一步的探索，一個可能的解釋是不保守LncRNA間存在共同的功能域驗證。lncRNA：

1.在作用方式上具有多樣性，以信號分子、誘餌分子、引導分子、支架分子，幾種方式參與基因的表達調(diào)控，行使其生物學功能;

2.作為新發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳調(diào)節(jié)形式，與生殖過程相關(guān)的LncRNA可能通過如組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)等機制參與精子的發(fā)生和成熟等生殖生物學事件;

3.通過多種方式在不同水平調(diào)控基因表達(如：本文中表述的近年來研究的較多的幾種lncRNA NEAT1、Mrhl,Hongr ES2、 NLC1-C)在精子發(fā)生這一精密調(diào)控的過程中構(gòu)建了一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些功能和表達的基礎(chǔ)研究為我們了解男性生育力提供了一定程度創(chuàng)新的視野。另外，lncRNA可能多通過微調(diào)的方式調(diào)控全局基因表達，這一點與蛋白編碼基因的開關(guān)調(diào)控作用相區(qū)別，進而對雄性生殖細胞分化的發(fā)育產(chǎn)生積極意義。

總之，由于相應(yīng)實驗技術(shù)等限制，對這一領(lǐng)域需要進一步深入的研究探討，特別是與生殖過程相關(guān)的LncRNA的發(fā)現(xiàn)并進一步詮釋它們的功能顯得更加重要。相信隨著實驗技術(shù)的不斷發(fā)展(生物信息學技術(shù)、新一代測序技術(shù)的發(fā)展等、ontology 數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì) RNA 結(jié)合模型的應(yīng)用)以及對不同lncRNA功能的進一步理解，lncRNA很有可能在雄性生殖系統(tǒng)疾病的診斷治療中成為新的生物標記物或治療靶點，進而為男性不育合適的治療方式提供潛在工具。

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