基于可開啟微流控芯片的循環(huán)腫瘤細胞捕獲及單個細胞的提取

方義++覃璐曼++劉侃++張南剛

摘要：介紹了一種可開啟微流控芯片?；诩毎奈锢沓叽缣匦栽撔酒蓪ν庵苎h(huán)腫瘤細胞（circulatetumorcells，CTCs）進行分選富集及單個細胞的提取?？砷_啟微流控芯片的結(jié)構簡單，簡化了制作流程。該文以前列腺癌細胞PC3為目標靶細胞，結(jié)合顯微切割原理，實現(xiàn)了對該細胞分選富集、轉(zhuǎn)印及單個細胞的提取，從而提高了CTCs檢測的純度。本文主要研究了可開啟細胞捕獲芯片的制作及單個細胞提取的方法。結(jié)果表明該芯片可以高效捕獲到循環(huán)腫瘤細胞并且能從捕獲到的細胞中任意提取單個目標細胞，從而為后續(xù)探討腫瘤細胞的生物學機制和轉(zhuǎn)移機制提供了很好的基礎與平臺。

關鍵詞：循環(huán)腫瘤細胞；可開啟微流控芯片；單細胞；轉(zhuǎn)印

中圖分類號：TP311 文獻標識碼：A 文章編號：1009-3044（2017）03-0229-03

Circulating Tumor Cell Capture and Single Cell Extraction Based on an Openable Microfluidic Chips

FANG Yi，QIN Lu-man，LIU Kan，ZHANG Nan-gang

（Wuhan Textile University，Wuhan 430073，China）

Abstract： An openable microfluidic chip is introduced，which is based on the physical size of the cells， for enriching the peripheral blood circulating cells （CTCs） and extract singlecell. The chip has simple structure and simplifies the production process. In this study， the prostate cancer cellsis used as the target cell， combined with the principle of micro-cutting， achieved the cell sorting enrichment， transfer and single cell extraction， thereby enhancing the CTCs detection purity. In this paper， we mainly study the fabrication of cell-capture chip and the method of single cell extraction. The results showed that the chip could efficiently capture the circulating tumor cells and could extract a single target cell from the captured cells， thus providing a good foundation and platform for the follow-up study of the biological mechanism and metastasis mechanism of tumor cells

Key words： circulating tumor cell；openable microfluidic chip； single cell； transfer

腫瘤是目前危害人類生命健康最嚴重的疾病之一。近20 年來，我國癌癥發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢[1]。目前現(xiàn)代醫(yī)學的治療方法可以預防原發(fā)腫瘤細胞的生長，但是越來越多生物學和臨床研究結(jié)果表明腫瘤患者致死的主要原因是由于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移而并非原發(fā)病灶。腫瘤轉(zhuǎn)移疾病所引起的死亡占實體瘤所致死亡的90%左右，因此腫瘤轉(zhuǎn)移的早期準確檢測就顯得尤為重要[2]。循環(huán)腫瘤細胞（CTC）是指脫離原發(fā)腫瘤病灶，侵襲并進入淋巴管、血液等循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤癌癥患者外周血中的循環(huán)腫瘤細胞，常用作腫瘤轉(zhuǎn)移的可靠生物標志物檢測和預后監(jiān)測[3-4]。但是CTC在外周血中的含量極低，約109個細胞中才會發(fā)現(xiàn)1至10個，因此CTC的檢測及分離在技術實現(xiàn)上非常具有挑戰(zhàn)性[5]。就目前而言，主要面臨的兩大挑戰(zhàn)：捕獲效率和純度。

CTC檢測常用的方法主要有兩種[6-7]，一種是基于細胞的生物化學特性也就是特定抗原抗體[8]之間的反應，另一種則是基于細胞的物理特性，如細胞間的物理特性差異，如尺寸[9]、形變[10]、密度[11]、磁性[12]等。前者應用免疫學基本原理對癌細胞進行相應的處理，這種方法需要專業(yè)技術人員操作并且成本高、通量小，如常用的流式細胞儀（flowcytometry，F(xiàn)C）、CellSearch檢測系統(tǒng)等。由于循環(huán)腫瘤細胞的特異性，因此對于分選富集的細胞而言有漏判的嫌疑，不能很好對未被特異性結(jié)合的細胞而有可能是腫瘤細胞的進行捕獲及分析，也不能很好的對單個細胞進行操作。后者利用癌細胞與正常細胞在物理特性對癌細胞進分析處理，這種方法原理簡單、成本低、通量大，但是對于分選富集到的細胞同樣存在單細胞分離及分析困難的問題。

針對以上兩點問題，本文采用了一種低成本、高效的可開啟微流控芯片來實現(xiàn)CTC的分選富集，并充分利用石蠟的轉(zhuǎn)印和芯片可開啟對細胞進行提取。

1實驗部分

1.1 微流控芯片的原理

基于細胞尺寸分選系統(tǒng)的基本設計如圖1所示。微流控芯片由高度連續(xù)變化的玻璃上蓋片、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）構成粘合層和含有凸臺的玻璃下蓋片構成。設計的基本思路是：芯片捕獲區(qū)域主要由一個高度連續(xù)變化的區(qū)域構成，當混有CTCs健康人血樣流經(jīng)該區(qū)域時，由于循環(huán)腫瘤細胞相比于正常細胞而言：細胞剛性較大不易變型，尺寸也比正常細胞（如紅細胞，血小板等）要大，因此CTCs會按照不同大小會停留在相應高度的位置，一些比出口小的細胞（如紅細胞、血小板等）和剛性較小的細胞會隨著液體流走，從而實現(xiàn)了細胞的分選富集。

圖1 細胞分離示意圖

1.2 芯片設計與制作

1.2.1 芯片設計

以75mm×25mm光學玻璃片為基片，制作上蓋片長為62mm，上端寬5mm，下端寬15mm，最高處60μm，最低處5μm的楔形溝道（圖2（b））；制作下蓋片長為68mm，上端寬19mm，下端寬9mm的凸臺（圖2（c））；出入口孔徑均為0.6mm，出口溝槽為寬為1mm，深度為0.2mm。

圖2 芯片設計

1.2.2 芯片的制作

首先使用耐刻蝕的膠膜制作出溝道的掩膜與凸臺的掩膜，然后采用濕法刻蝕的方法，制作出楔形溝道與凸臺，再使用JDLGC16_A8精雕機分別使用0.6mm單粒度磨頭、轉(zhuǎn)速7500rpm，吃刀深度0.02mm及1.0mm單粒度磨頭、轉(zhuǎn)速13000rpm，吃刀深度0.02mm在帶有楔形溝道的上蓋片上加工出入口、出口及出口溝道，再將加工好的上下蓋片在超聲清洗機中經(jīng)丙酮、無水乙醇及去離子水依次超聲清洗，通過電暈處理后再在去離子水中合在一起后放在80℃的熱臺上烘干所有水分，這時上蓋片與下蓋片這間已經(jīng)有一定的分子鍵合力。在烘干的過程中，將PDMS樹脂與固化劑按10：1的質(zhì)量比混合，充分攪拌均勻，除去所有的氣泡，待芯片烘干后將PDMS浸入至芯片凸臺周圍直到PDMS完全浸沒整個凸臺周圍，隨后將芯片置于80℃熱臺上30至60分鐘，待固化后去除芯片周圍多余的PDMS，這樣最終就得到了可開啟的微流控芯片。

1.3 芯片操作

前列腺癌細胞（PC3）細胞株的培養(yǎng)液為RPMI1640與胎牛血清以9：1的培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)于50mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱，溫度為37℃，二氧化碳質(zhì)量分數(shù)為5%，加入胰酶進行消化，將洗滌后的PC3細胞用磷酸鹽（PBS）緩沖液按質(zhì)量比1：10進行稀釋，取1ml于試管并加入FDA，使其終濃度為100 μg.ml-1，置于室溫30min，期間用移液槍吹打幾次以確保細胞與FDA染色試劑充分接觸，然后取終濃度為0.4%的PFA與細胞溶液按1：20的比例將染好色的細胞進行固定，最后利用注射器吸取適量細胞溶液，通過保定蘭格微量注射泵以100μl/min的流速注入芯片，圖3為該芯片在通血時的圖片。10min后換用PBS緩沖液沖洗，然后依次通入75%、80%以及100%的乙醇，最后通入液態(tài)的低溫石蠟將所捕獲到的細胞封閉在楔形溝道里。

接下來將捕獲到細胞的芯片放置于顯微鏡中，隨機取點觀察細胞的位置及數(shù)量，再將芯片放置于42℃的水中，用刀片將芯片分開，這里就可以得到完整包含石蠟的下蓋片與上蓋片。對完整包含石蠟的下蓋片進行觀察，可以看到，隨機取到的點中的細胞位置及數(shù)量。

單細胞提取采用以下步驟：

1）石蠟的去除。取微量的環(huán)保脫蠟劑于待取細胞區(qū)域，然后開啟加熱裝置，通過顯微鏡的輔助，可以看到細胞在脫蠟過程中并沒有發(fā)生移動。2）定位。將顯微注射針移動至想要取出的細胞旁，之前需要吸入微量的PBS磷酸緩沖溶液。3）目標細胞的取出。通過微量注射器的抽拉帶動PBS的進出，最后通過PBS的流動將目標吸入注射針中。

圖 3 通血

2 結(jié)果與討論

可開啟微流控芯片的制備見圖4，制作簡單易操作。與傳統(tǒng)PDMS微流控芯片制作方法有所不同的是，CTCs細胞捕獲芯片省去了復雜微流溝道模具的制作直接采用耐腐蝕的膠膜覆蓋保護區(qū)，溝道直接在蓋片上一次制成。傳統(tǒng)方法制作出來的微流控芯片在制作出來后就以成型，是不可逆的過程，即使強行分開也不能保證芯片的完整性，更不能確保捕獲到細胞的原位性，而本文中芯片的優(yōu)點之一就是過程可逆即芯片可開啟，并且在開啟后能夠保證捕獲到的細胞在開啟前后仍然停留在同一個位置，確保了細胞提取的前提。芯片的另一大優(yōu)點在于它高度是連續(xù)變化的溝道，這使得只要細胞形變量的范圍在出口高度與入口高度之間都能一一被捕獲，且細胞近似的成線性分布。芯片溝道的寬度與傳統(tǒng)的微流控芯片相比由μm提升至mm，提高了一個數(shù)量級，這也使得在通量上也得到了提高，意味著可以節(jié)省更多的實驗時間?？梢?，本文采用的制作方法制作出來的芯片具有可開啟、開啟后細胞原位性、高通量及可重復使用四大特點。與傳統(tǒng)的微流控芯片相比，該工藝流程簡單，制作步驟操作易學，能輕松制造出調(diào)試連續(xù)變化的結(jié)構溝道，而對于傳統(tǒng)方法來講這是難以穩(wěn)定實現(xiàn)的，這充分說明該工藝不僅具有形態(tài)多樣的優(yōu)勢，更能實現(xiàn)傳統(tǒng)工藝難以完成的任務，是對傳統(tǒng)工藝的一種有益的補充。

圖4 制作可開啟微流控芯片的工藝流程

制作好的芯片實物見圖5（a）為了測試芯片尺寸是否符合設計標準，本文取標準尺寸聚苯乙烯熒光微球（10μm）作為參照物驗證芯片高度準確性（圖5（b））。通過鈉燈的照射，可以得到薄膜干涉條紋（圖5（c）），此方法的測量精度可達1μm，條紋的彎曲度表示表面的平整度。圖5（c）可以看出明暗條紋間距相等且條紋可近似看作直線，這表明：第一，芯片的楔形結(jié)構深度是由小到大線性遞增；第二，芯片刻蝕出來的表面接近平面。通過微球與干涉條紋的驗證，可以得出芯片是符合當初的設計參數(shù)。

圖5 芯片高度驗證

進樣速度的高低與通量決定了該芯片對細胞的捕獲效率. 為了確保芯片對細胞的捕獲效率不下降， 在盡可能地提高芯片通量的情況下， 本研究對細胞的最佳進樣速度進行了研究， 分別以50，100， 150， 200μl/min的流速往芯片通入PC3腫瘤細胞2ml，通過倒置熒光顯微鏡進行觀察（圖6）。通過對比，采用100μl/min流速是最為適宜的。為了確保芯片的穩(wěn)定性，本研究選用100μl/min的流速對含不同細胞數(shù)的2ml人造血進行了捕獲實驗（圖7）。

圖6 不同流速下的捕獲效率

圖7 不同數(shù)量癌細胞的捕獲效率

為了測試芯片是否能完整地將捕獲到的前列腺細胞完整的轉(zhuǎn)印出來及單個細胞的提取，在芯片操作過程中分別使用顯微鏡觀察并記錄下整個過程中的細胞數(shù)及位置。圖8中a、b、c、d、e和f分別是芯片捕獲到PC3癌細胞熒光圖、使用石蠟封片后細胞數(shù)量及細胞所在位置熒光圖、開啟芯片后細胞數(shù)量及細胞所在位置圖、開啟后芯片明場圖、微量注射針定位到目標細胞和被捕獲到微量注射中的細胞圖（明場與熒光）。通過圖8中的圖a與圖b的對照可以看出細胞在經(jīng)過石蠟包裹時基本沒有改變細胞的數(shù)量和位置；圖b與圖c對照可以看出開啟前后細胞的數(shù)量和位置并沒有改變。這一結(jié)果證明捕獲到基本細胞能被無損地轉(zhuǎn)印出來。通過圖e和圖f可以得出，可以通過對轉(zhuǎn)印層的合理處理，可以提出轉(zhuǎn)印層中任意一個捕獲到的細胞，即單個細胞的提取。

圖8 熒光或明場采樣結(jié)果

3結(jié)論

本文介紹了一種基于細胞物理尺寸分選法的可開啟的楔形捕獲芯片的制作方法，并提出了一種新的單細胞提取方法，最后給出單細胞提取的結(jié)果。上述方法針對CTC檢測捕獲及提取得了較好的結(jié)果，這種方式有得利于對同一種癌細胞特異性進行分析，也適用于疑似癌細胞而未被標記上的細胞做單獨分析，在未來有望與微流控系統(tǒng)結(jié)合開發(fā)出便攜式產(chǎn)品，以推動CTC檢測在實際生活中的應用。

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