李亞萍 周孟祺 李穩(wěn) 程惠敏 謝先芝

摘要：水稻光敏色素基因家族包括3個成員：PHYA、PHYB和PHYC。已有研究表明，phyB在調(diào)節(jié)水稻幼苗去黃化、葉角、花期以及非生物脅迫反應(yīng)中具有重要作用，但是phyB對水稻苗期株高和生物量的影響仍未有報道。本研究比較了野生型和phyB突變體（phyB1和phyB2）在不同培養(yǎng)條件下苗期的株高、鮮重和干重，結(jié)果表明，在營養(yǎng)液和基質(zhì)培養(yǎng)條件下，phyB突變體的株高均顯著低于野生型，鮮重和干重與野生型差異并不明顯，據(jù)此推測，phyB調(diào)控水稻苗期株高，但對生物量的影響不明顯。利用基因芯片技術(shù)，比較了野生型和phyB突變體苗期地上部分的基因表達(dá)圖譜，篩選到受phyB上調(diào)的基因115個，受phyB下調(diào)的基因95個;差異基因的GO富集分析結(jié)果表明，富集的基因主要參與水稻生長等生物學(xué)功能，因此推測通過調(diào)控這類基因的表達(dá)而影響苗期生長。本研究首次揭示了phyB對水稻苗期株高和生物量的影響，并進(jìn)一步討論了phyB在選育機(jī)插秧水稻品種中的潛在應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：水稻;光敏色素B;苗期;生物量;株高

中圖分類號：S511文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0013-06

光不僅為植物的光合作用提供能量，而且作為一種信號影響植物的生長發(fā)育。光敏色素（phytochrome）是植物體內(nèi)的一種重要光受體，主要感受紅光和遠(yuǎn)紅光，在植物從種子萌發(fā)到成熟的整個生長發(fā)育過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[1，2]。水稻光敏色素基因家族包括3個成員：PHYA、PHYB和PHYC[3，4]。Takano等的研究表明水稻phyB通過感受紅光可以調(diào)節(jié)水稻幼苗去黃化、葉角、花期以及育性等[5]。而且，phyB還影響水稻的耐寒性和耐旱性[6，7]。

除了對形態(tài)建成和脅迫反應(yīng)的調(diào)控，水稻光敏色素也參與調(diào)控碳代謝。有報道表明，水稻phyAphyBphyC三突變體白天的糖含量，特別是新葉中的還原糖、葡萄糖、果糖和半乳糖含量顯著高于野生型;黑暗條件下，水稻phyAphyBphyC三突變體中的淀粉含量高于野生型，表明光敏色素影響黑暗中淀粉的利用[8]。此外，光敏色素還影響三羧酸循環(huán)組分的含量[8，9]。在其它植物中的研究也表明，光敏色素介導(dǎo)的光信號與碳代謝及植物生長可塑性密切相關(guān)[10]。植物碳代謝主要包括光合作用驅(qū)動的糖類合成代謝及呼吸作用介導(dǎo)的糖類分解代謝。碳代謝所產(chǎn)生的淀粉是植物體內(nèi)碳的主要儲存形式，是構(gòu)成植物生物量的基本組分之一[11]。據(jù)此推測光敏色素影響水稻的生物量。

為了解析PHYB基因?qū)λ久缙谥旮吆蜕锪康挠绊懀狙芯勘容^了野生型和phyB突變體水稻在不同生長條件下的干重、鮮重和株高等特性，并利用基因芯片技術(shù)分析了phyB突變體的基因表達(dá)譜，以進(jìn)一步討論phyB突變體苗期的這種生長發(fā)育和代謝特征在水稻機(jī)插秧品種改良中的潛在應(yīng)用價值。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用水稻材料共3個，分別是日本晴（WT）及其phyB1和phyB2突變體。phyB1和phyB2突變體為日本晴經(jīng)γ-射線輻射誘變獲得，具體遺傳背景見文獻(xiàn)[5]。

1.2營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下水稻株高、干重和鮮重的測量

將野生型、phyB1和phyB2突變體種子用70%乙醇表面消毒1min、5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20min后，無菌水沖洗4～5次;置于28℃誘導(dǎo)萌發(fā)3d，然后播種于96孔板（底部去掉），轉(zhuǎn)移至Yoshida溶液中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光溫條件是光期14h、28℃、7900lx，暗期10h、24℃。分別在Yoshida溶液中培養(yǎng)10、15、20、25d時測量水稻株高，并以野生型水稻的株高為100%，計(jì)算phyB1和phyB2突變體的相對高度。每兩天更換一次溶液。每個材料測量至少20株。

每5株作為1組測量整株鮮重，然后在105℃殺青30min，80℃烘6d至恒重。利用分析天平稱量干、鮮重。

1.3基質(zhì)培養(yǎng)條件下水稻株高、干重和鮮重的測量

將野生型、phyB1和phyB2突變體種子消毒后在28℃誘導(dǎo)萌發(fā)4d。挑選萌發(fā)一致的種子播種到基質(zhì)（濟(jì)南魯青育苗基質(zhì)）中，在濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)農(nóng)場（36°40′N，117°00′E）的網(wǎng)室中培養(yǎng)（2017年6—7月，自然生長條件）。分別于培養(yǎng)10、15、20、25d時測量水稻株高，并以野生型水稻的株高為100%，計(jì)算phyB1和phyB2突變體的相對高度。每個材料測量至少30株。

干重和鮮重的測量如上所述。

1.4基因芯片分析

對營養(yǎng)基質(zhì)中生長至三葉期的野生型、phyB1和phyB2突變體地上部分進(jìn)行取材，利用RNeasyPlantMiniKit（QIAGEN）提取RNA，然后利用22KOligo-microarray（AgilentTechnologies，USA）進(jìn)行基因芯片分析，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。選擇在野生型和phyB突變體中表達(dá)水平差異2倍的基因作為差異表達(dá)基因，并利用AgriGOv2.0在線軟件對差異基因進(jìn)行GO富集分析。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

采用MicrosoftExcel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與做圖。

2結(jié)果與分析

2.1營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下野生型和phyB突變體的株高、鮮重和干重

在營養(yǎng)液中生長不同時間后，野生型的株高均顯著高于phyB1和phyB2突變體，且各時期phyB突變體相對于野生型的株高基本不變，均在73%～80%之間（圖1）。表明，PHYB基因功能缺失導(dǎo)致株高降低。

有研究表明，光敏色素介導(dǎo)的光信號與碳代謝和植物生長可塑性密切相關(guān)[10]。因此，我們進(jìn)一步比較了野生型和phyB突變體的干重和鮮重。在萌發(fā)后10d時，phyB突變體的鮮重顯著高于野生型，干重僅phyB2差異顯著;在萌發(fā)后15d和20d時，野生型和phyB突變體的鮮重和干重均無顯著差異;但在萌發(fā)后25d時，phyB1和phyB2突變體苗期的鮮重和干重均顯著低于野生型（圖2），這可能是由于營養(yǎng)液培養(yǎng)后期材料密度太大，導(dǎo)致生長不正常。上述結(jié)果表明，PHYB基因功能缺失在苗期不影響水稻的生物量。

2.2基質(zhì)培養(yǎng)的野生型和phyB突變體的株高、鮮重和干重

為了模擬大田生長情況，我們比較了野生型、phyB1和phyB2突變體在營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)不同時期的株高、鮮重和干重。在萌發(fā)后不同天數(shù)，野生型的株高均高于phyB1和phyB2突變體，但是隨著發(fā)育進(jìn)程，株高的差別逐漸縮?。▓D3）。如在營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)15d時，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的75.3%和74.2%;在營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)20d時，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的82.9%和82.0%;在營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)25d時，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的97.3%和95.7%。

我們進(jìn)一步比較了野生型和phyB突變體的鮮重和干重。在營養(yǎng)基質(zhì)中生長10d時，phyB1突變體的鮮重和干重均顯著高于野生型;但生長15d時，phyB1突變體的鮮重和干重均顯著低于野生型;生長20d和25d時，除25d時phyB1的干重顯著高于野生型外，野生型和phyB突變體的鮮重和干重?zé)o顯著差異（圖4）。表明，在自然光照下，PHYB基因功能缺失在苗期不影響水稻的生物量。

2.3phyB調(diào)控的基因表達(dá)圖譜

上述結(jié)果表明，野生型和phyB突變體之間苗期株高存在明顯差異。此外，野生型和phyB突變體葉角和葉綠素含量也顯著不同[5，13]。為了揭示phyB調(diào)控水稻苗期生長發(fā)育的分子機(jī)制，我們比較了野生型和phyB突變體之間的基因表達(dá)圖譜。結(jié)果顯示，野生型和phyB突變體之間的差異表達(dá)基因210個，其中受phyB上調(diào)（即在WT中表達(dá)水平高于phyB突變體的2倍以上）的差異表達(dá)基因115個，受phyB下調(diào)（即在WT中表達(dá)水平低于phyB突變體的2倍以上）的差異表達(dá)基因95個。利用AgriGOv2.0在線軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明，受phyB上調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與生長（GO：0040007：growth）、外部刺激應(yīng)答（GO：0009605：responsetoexternalstimulus）和蛋白磷酸化（GO：0006468：proteinphosphorylation）等生物學(xué)過程（圖5）;受phyB下調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與生長（GO：0040007：growth）、系統(tǒng)發(fā)育（GO：0048731：systemdevelopment）和生殖過程（GO：0022414：reproductiveprocess）等生物學(xué)功能（圖6）。不管在上調(diào)基因還是下調(diào)基因中，富集的基因均與水稻生長生物學(xué)過程（GO：0040007：growth）有關(guān)，推測phyB通過調(diào)控這類基因的表達(dá)而影響水稻苗期株高。

3討論與結(jié)論

本研究比較了野生型和phyB突變體苗期株高和生物量（干重和鮮重），結(jié)果顯示，在兩種培養(yǎng)條件下，phyB突變體的株高均顯著低于野生型，這表明phyB影響水稻苗期株高。利用基因芯片篩選到受phyB上調(diào)的差異表達(dá)基因115個，受phyB下調(diào)的差異表達(dá)基因95個;差異基因GO富集分析結(jié)果表明，最富集的一類基因主要參與生長生物學(xué)過程，這可能與phyB突變體水稻株高、葉角等苗期生長發(fā)育特征有關(guān)。

在營養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)中（自然光照條件下），phyB突變體的相對株高大于營養(yǎng)培養(yǎng)條件下的相對株高。考慮到Y(jié)oshida溶液中含有水稻生長所需要的各種營養(yǎng)元素，我們推測，在不同培養(yǎng)條件下株高上的差異主要是由于光照強(qiáng)度或者光質(zhì)導(dǎo)致的。PHYB編碼光敏色素蛋白質(zhì)，主要感受紅光，因此環(huán)境中的光質(zhì)必定會影響光敏色素突變體的生長發(fā)育。此外，植物體內(nèi)的其他光受體如主要感受藍(lán)光的隱花色素和向光素，以及主要感受紫外光的受體UVR8也能調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。因此有一種可能性是自然光中具有更廣的光譜，誘發(fā)了其他光受體的作用，彌補(bǔ)了phyB缺失所引起的株高損失。值得注意的是，在兩種生長條件下，phyB突變體和野生型之間的鮮重和干重差異不顯著，推測phyB不影響水稻苗期的生物量。

水稻是我國播種面積最大、總產(chǎn)量最多的糧食作物，是我國65%左右人口的主食，在糧食生產(chǎn)和消費(fèi)中處于主導(dǎo)地位。傳統(tǒng)水稻種植通常經(jīng)過播種、育秧、插秧等多個步驟，用工多，耗時長。近幾年隨著農(nóng)村勞動力外出務(wù)工的增多，我國水稻生產(chǎn)用工矛盾越來越突出。機(jī)插秧是用插秧機(jī)高效插秧代替原始手插的高產(chǎn)栽培技術(shù)，徹底解除了人工插秧的繁重勞動。然而機(jī)插秧對秧苗高度和秧苗質(zhì)量要求很高，其中秧齡彈性是研究的核心，只有具有較大秧齡彈性范圍，才能使機(jī)插水稻的推廣和應(yīng)用具有更強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性。如果水稻品種秧苗期株高較低，可以提高秧齡彈性，有利于機(jī)插秧的推廣。然而目前水稻矮化品種在整個水稻生育期都表現(xiàn)矮化，導(dǎo)致生物量和產(chǎn)量降低。因此需要培育在秧苗期株高較低，成株期生長勢較強(qiáng)的水稻品種。本研究中基質(zhì)生長試驗(yàn)基本模擬了水稻育苗階段的生長情況，種子萌發(fā)后在基質(zhì)中生長的1個月內(nèi)，phyB突變體的株高低于野生型，而干重和鮮重差別不大，而且在生長后期，phyB突變體株高與野生型株高的差異逐漸縮小。phyB突變體的這種生長特征可能更適合于機(jī)插秧栽培方式。因此PHYB基因可以作為一個培育機(jī)插秧水稻品種的潛在改良位點(diǎn)。

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