西瓜細胞工程技術研究進展

馬紹鋆

（安徽省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，合肥，230031）

西瓜細胞工程技術研究進展

馬紹鋆

（安徽省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，合肥，230031）

西瓜是世界重要的經(jīng)濟作物之一，利用細胞工程技術可解決西瓜生產(chǎn)中的突出問題。本文系統(tǒng)總結了國內外關于西瓜細胞工程技術的研究進展，并對今后的研究方向進行了展望，以期為西瓜細胞工程技術研究、品種改良和種質創(chuàng)新提供參考。

西瓜；細胞工程；細胞遺傳學

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Mansfeld，2n= 2x=22]屬于葫蘆科西瓜屬，是世界重要的經(jīng)濟作物之一，也是我國種植面積最大的主要瓜類作物，生產(chǎn)優(yōu)質高產(chǎn)西瓜是農(nóng)民增產(chǎn)增收的重要渠道。西瓜的品質和產(chǎn)量受到遺傳基礎狹窄和病蟲害等因素的影響，因此利用細胞工程技術培育優(yōu)質高產(chǎn)、具有綜合抗性的西瓜新品種具有重要意義。本文系統(tǒng)總結了國內外關于西瓜細胞工程技術的研究進展，并對今后的研究方向進行了展望，以期為西瓜細胞工程技術研究、品種改良和種質創(chuàng)新提供參考。

1 細胞遺傳學基礎

1.1 染色體核型分析

染色體核型分析是細胞遺傳學的基礎，可應用于西瓜遺傳分析、進化與品種間親緣關系研究，同時也為西瓜親本選配和新品種遺傳育種研究提供重要依據(jù)。一般依據(jù)染色體長度、臂比、縊痕、隨體和核型不對稱系數(shù)等進行[1]。

西瓜的染色體小，形態(tài)上不易識別，有絲分裂中期形態(tài)分化太少且細胞分裂時核膜消失較晚，染色體粘連等因素，導致染色體不易分散[2]，故一般選擇形態(tài)端正、分散良好的前中期染色體分裂相進行核型分析。研究發(fā)現(xiàn)，西瓜根尖細胞分裂相受胚根長短的影響，以胚根長為1.0～1.5 cm的根尖細胞中期分裂相最多，鐵明礬-蘇木精染色觀察效果最佳[3]。

目前關于西瓜染色體各種參數(shù)的報道不一致，Trivedi等[4]認為，西瓜中期染色體長度變化在1.24～2.88 μm，絕大部分為亞中著絲點（sm）染色體，無次縊痕，據(jù)郭德棟等[5]報道，Щелеина等發(fā)現(xiàn)染色體長度變化在1.5～4.0 μm，有1對隨體（SAT）染色體，而Φypca研究發(fā)現(xiàn)染色體長度變化在1.8～2.7 μm，大都為中部著絲點（m）染色體，只有1對染色體不等臂。吳國江[2]建立了標準西瓜粗線期染色體核型，認為西瓜粗線期染色體的染色粒呈近中分布類型，異染色區(qū)定位于著絲點附近，并對金夏西瓜品種進行核型分析，發(fā)現(xiàn)其為2n=2x=22=20 m+2 sm核型，染色體長度變化在1.98～3.31 μm，除第2對染色體為次中部著絲點染色體外，均為中部著絲點染色體。趙虎基等[6]通過對12個西瓜品種染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，著絲點區(qū)和隨體未發(fā)生變異，籽用西瓜品種和飼用西瓜均為1A類型（2n=2x=22=20 m+2 sm或22 m），與李琦等[7]的報道是一致的，而久比利、三單四和紅優(yōu)二號3個西瓜品種屬2A類型（2n=2x=22= 20 m+2 sm或18 m+4 sm）且1A類型比2A類型對稱性高，說明2A類型比1A類型進化程度高。此外，張志忠等[8]采用玻璃針法，成功分離得到西瓜第一單染色體并進行擴增，建立了西瓜第一單染色體DNA文庫，為西瓜的基因定位和克隆奠定基礎。

1.2 染色體原位雜交

分子細胞遺傳學隨著染色體研究技術的創(chuàng)新而得到快速發(fā)展，出現(xiàn)了熒光原位雜交 （FISH）技術、基因組原位雜交（GISH）技術，為更精準分辨染色體提供了一條途徑。FISH特點是敏感快捷，能同時顯示多種顏色等，因此能同時進行多個探針的定位以及次序確定，可應用于準確鑒定植物染色體，染色體識別、易位系鑒定、構建物理圖譜、基因組進化研究、轉基因的細胞學鑒定、外源染色質檢測等。李琦等[7]應用FISH技術成功將45S rDNA和5S rDNA定位在西瓜中期染色體上，雜交結果顯示西瓜45S rDNA雜交信號有2對，較強的1對位于2號染色體短臂末端，較弱的1對位于4號染色體短臂中部；5S rDNA雜交信號有1對，位于7號染色體短臂近著絲粒處。趙泓等[9]以rDNA為探針，利用FISH技術通過對22份西瓜染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，三大生態(tài)類型（東亞類型、美洲類型和egusi類型）的17份西瓜栽培變種含有1對5S rDNA位點和2對45S rDNA位點。其中2對45S rDNA位點分別位于2對染色體長臂非常接近末端的地方，信號亮度無明顯差異；5S rDNA位點位于其中1對45S rDNA位點內側。4份栽培種中的野生變種含有5S rDNA位點和45S rDNA位點各2對，它們分別位于4對染色體的末端或近末端。而1份野生種具有的2對45S rDNA在信號亮度上無明顯差異，但其中1對靠近著絲粒的5S rDNA的拷貝數(shù)明顯少于另外1對靠近端部的5S rDNA，上述結果強有力地支持了現(xiàn)有的西瓜分類。

GISH可應用于異源多倍體品種染色體結構的分析和植物基因組結構特征分析，能反映重復序列的信號分布特征，分析物種間親緣關系，其特點是操作簡單，更準確直觀。常珂瑋等[10]通過對缺須西瓜、熱迷西瓜、藥西瓜和諾丹西瓜有絲分裂中期染色體進行比較基因組原位雜交分析，揭示了西瓜屬物種間的親緣關系，同時對諾丹西瓜（2n=24）的歸屬問題進行了分析，發(fā)現(xiàn)西瓜（2n=22）與諾丹西瓜之間只在隨體上存在共享的同源重復序列，而甜瓜（2n=24）與諾丹西瓜之間共享的保守重復序列幾乎遍布諾丹西瓜的所有染色體，表明諾丹西瓜和甜瓜之間具有非常近的親緣關系。

2 組織培養(yǎng)

2.1 外植體培養(yǎng)

通過西瓜外植體培養(yǎng)獲得再生植株是離體培養(yǎng)中研究較多、較成熟的技術，在降低種苗成本、確保純度的同時也為重要性狀遺傳轉化提供基礎?；蛐?、外植體類型、激素的種類和濃度、苗齡等因素影響西瓜再生體系的建立。

在離體培養(yǎng)中，西瓜未成熟子葉不定芽分化頻率可達100%，通常認為子葉是比較理想的外植體[11]。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎在黑暗條件下發(fā)芽可以提高子葉的器官再生能力[12]，子葉的末端具有最高的再生頻率[13]，再生不定芽最適培養(yǎng)條件為 MS+1～2 mg/L 6-BA[12，14，15]。 目前已經(jīng)建立了完善的子葉[16]、下胚軸[17]和頂芽[18]等外植體的再生體系，以達到穩(wěn)定基因型的目的。有報道認為，西瓜不定芽誘導頻率由高到低依次為莖尖[19]、帶完整子葉的頂芽[20]、子葉的末端[13]、不成熟的子葉[14]、0.5～1.0 cm 胚軸[14]、3～5 mm的果實切片[21]。此外，未受精胚珠和未授粉子房離體培養(yǎng)也有相關報道。研究發(fā)現(xiàn)，從授粉后結實14～28 d的西瓜以不成熟種子的子葉為外植體也可得到胚狀體，但再生頻率很低，因而通過體細胞胚得到再生植株不切實際[11]。而張莉[22]初步建立了西瓜體細胞胚誘導體系，認為在MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，誘導率達到54.7%，同時發(fā)現(xiàn)2%的蔗糖濃度適合西瓜體細胞胚萌發(fā)。閆靜[23]建立了伊選類型和京欣類型西瓜愈傷組織的誘導體系，在MS+IAA 0.1 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基中，兩類西瓜愈傷組織不定芽分化頻率最高。劉麗鋒[24]研究發(fā)現(xiàn)，鐵鹽對西瓜組培苗黃化的影響最大，將Fe-EDTA濃度加倍，組培苗生長健壯，能持續(xù)繼代。此外，西瓜在離體培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生玻璃化苗，有報道認為，降低培養(yǎng)濕度可有效減少玻璃化苗的發(fā)生[25]。

2.2 花藥和小孢子培養(yǎng)

西瓜花藥培養(yǎng)受多種因素的影響，包括基因型差異、小孢子的發(fā)育階段、花蕾的預處理方式、供體植株的生理狀態(tài)、基本培養(yǎng)基成分等因素[26]，其中培養(yǎng)基的組成是影響誘導胚狀體形成愈傷組織和植株再生的關鍵因素。

西瓜花藥培養(yǎng)始于20世紀70年代初，通過對瓊酥和周至紅2個西瓜品種進行花藥培養(yǎng)，獲得了單倍體植株，但其愈傷組織的誘導率僅為0.5%，不利于育種上利用。薛光榮等[27]通過花藥培養(yǎng)獲得的花粉植株經(jīng)過加倍得到了1個高產(chǎn)、抗病的西瓜優(yōu)良品種。袁萬良等[28]通過改良培養(yǎng)基，解決了愈傷組織褐變死亡的問題，將愈傷組織誘導率從0.5%提高到94.4%，并且快速誘導出了綠色愈傷組織，為獲得西瓜單倍體植株奠定了基礎。魏瑛等[29]通過對西農(nóng)8號和京欣l號2個西瓜品種花藥進行愈傷組織誘導，獲得了57.7%～62.9%的誘導率。李娟[30]認為在4℃處理2 d條件下，西瓜花藥愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+KT 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 2.0 mg/L，誘導率為57.84%。西瓜花藥培養(yǎng)技術雖有較多優(yōu)勢，但由于花藥愈傷組織誘導率低以及分化頻率極低等問題的存在，目前仍未能廣泛應用于西瓜遺傳育種中。

小孢子培養(yǎng)排除了藥壁組織二倍體體細胞的干擾，是獲得單倍體的重要途徑之一，可為快速配制雜交種提供材料，也是分子標記和基因圖譜的理想材料?；ǚ鄣陌l(fā)育時期是決定花藥培養(yǎng)能否形成花粉愈傷組織或花粉植株的至關因素之一。王玉英等[31]認為大多數(shù)植物在單核靠邊期進行花藥培養(yǎng)效果是最佳的。李娟[30]研究發(fā)現(xiàn)，西瓜花藥培養(yǎng)的最佳時期是單核靠邊期到雙核期，其機理有待進一步研究，此外不同基因型西瓜在游離小孢子培養(yǎng)過程中對溫度的敏感性不同，同時早上采集花蕾其花粉活力較強，高溫熱激36℃處理4 d的效果較好，在1/2 NLN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，小孢子能膨大分裂形成細胞團和愈傷組織。

2.3 原生質體培養(yǎng)

原生質體為遺傳操作提供了理想受體，通過該技術可獲得體細胞雜交種，目前采用電融合技術成功地進行了西瓜和甜瓜原生質體的融合，通過Southern分子印記雜交技術，檢驗出了原生質體異融合愈傷組織，該方法可以克服遠緣雜交不育和縮短育種年限[32]，同時也為創(chuàng)造新材料和新種質開辟新途徑。李仁敬等[33]通過化學融合，以西瓜子葉原生質體獲得愈傷組織，并發(fā)現(xiàn)原生質體的分裂頻率與基因型有關。王靜[34]建立了西瓜葉片原生質體制備的最佳條件，為2.7%纖維素酶+0.78%離析酶R-10溶于0.4 mol/L甘露醇中，轉速800 r/min，酶解時間120 min，西瓜葉片原生質體產(chǎn)率最高，制備效果最好。

3 基因轉化

抗性育種對于培育生產(chǎn)優(yōu)質高產(chǎn)西瓜品種具有重要意義，通過轉基因技術可以為抗性育種提供支持。西瓜轉基因主要以子葉為外植體，遺傳轉化方法除農(nóng)桿菌介導法是技術較成熟、機理較明確的途徑外，花粉管通道法[35]、基因槍介導法[36]、DNA浸胚法[37]、胚囊子房注射法[38]、PEG法、電激法等也有應用。

目前已成功將卡那霉素抗性篩選基因（NPTⅡ）和標記基因 （GUS）[15]、ACC合成酶基因及其反義基因[39]、西瓜花葉病毒1號的外殼蛋白基因（WMV-1 CP基因）[40]、西瓜花葉病毒2號的外殼蛋白基因（WMV-2 CP基因）[41]、西瓜花葉病毒（WMV）外殼蛋白基因、西葫蘆黃化花葉病毒（ZYMV）復制酶基因、黃瓜花葉病毒（CMV）復制酶基因[42]、NPR1基因、幾丁質酶基因、幾丁質酶-葡聚糖酶雙價基因[43]、酵母腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因[44]、酵母HALI基因[45]、八氫番茄紅素合成酶基因[46]、GGPS基因、編碼CGMMV-CP的cDNA基因等成功轉入西瓜基因組中獲得轉基因再生植株。與西瓜有近緣關系物種的總DNA也有應用，如瓠瓜DNA、黑籽南瓜DNA等。宋道軍等[47]利用離子束處理將銀杏耐輻射異常球菌基因組DNA成功導入西瓜，該方法實現(xiàn)了超遠緣分子雜交，為西瓜遺傳育種拓展了新方法。此外，體細胞突變體篩選也可作為西瓜抗性種質創(chuàng)新的重要途徑。

4 問題與展望

隨著細胞工程技術的發(fā)展，細胞遺傳學、組織培養(yǎng)及基因轉化等在西瓜遺傳育種中得到了廣泛應用，但以下問題有待于進一步研究。

①西瓜遺傳基礎狹窄利用離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生體細胞無性系變異的特性，應加強體細胞無性系變異的篩選研究，重視抗性突變體篩選、抗病種質資源匱乏以及抗病性遺傳規(guī)律復雜等問題。

②獲得高頻、高質、同步性好的體細胞胚是人工種子生產(chǎn)的關鍵。通過細胞工程技術生產(chǎn)三倍體無籽西瓜人工種子，可以降低種苗成本。

③西瓜花藥培養(yǎng)單倍體的誘導率低，重復性差，有待于進一步提高。

④西瓜細胞工程研究體系的培養(yǎng)效率不高，后代群體不夠大，不利于在遺傳育種中的應用。

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Advances on Cell Engineering Technology Application in Watermelon

MA Shaojun
(Horticulture Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031)

Watermelon is one of the most important cash crop in the worldwide.Research on cell engineering technology is actually an effective way to solve a series of problems in watermelon production.This paper systematically summarized the research achievements of cell engineering technology in watermelon,and also suggested some future directions which could provide valuable references for the research of cell engineering technology,cultivar improvement and germplasm innovation.

Watermelon;Cell engineering;Cell genetics

S651

A

1001-3547（2017）14-0038-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.14.015

安徽省農(nóng)業(yè)科學院院長青年創(chuàng)新基金項目（16B0305）；國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術體系合肥綜合試驗站（CARS-26-31）

馬紹鋆（1978-），男，碩士，農(nóng)藝師，從事蔬菜及西甜瓜遺傳育種與育苗研究，電話：13615694065，E-mail：msj863@126.com

2017-04-24