諾如病毒實驗室診斷現狀與展望

何濤君，陸學東，龐曉莉，湯一葦

諾如病毒實驗室診斷現狀與展望

何濤君，陸學東，龐曉莉，湯一葦

諾如病毒是引起非細菌性急性胃腸炎的主要病因，常常引起嚴重的公共衛(wèi)生與食品安全問題。諾如病毒基因組的多樣性及其它們不斷的進化和變異為臨床診斷及疫苗研制帶來了挑戰(zhàn)。本文就諾如病毒實驗室診斷方法的研究進展作一綜述，包括從傳統(tǒng)經典的核酸檢測到應用納米、芯片等高新技術的多重核酸定量檢測和高通量測序平臺，以及體外成功培養(yǎng)的報道等等。這些新技術的成功運用將推動諾如病毒實驗室診斷的新發(fā)展，以滿足臨床診療及疫苗研制的新需求。

諾如病毒；實驗室診斷；多重核酸定量檢測；高通量測序；病毒體外細胞培養(yǎng)

諾如病毒是一組小圓形（直徑30～38 nm）、無包膜的單股正鏈RNA病毒，屬杯狀病毒科諾如病毒屬。諾如病毒可分為7個基因組（GI～GVII組），40個基因型。GI、GII、GIV組主要引起人類感染，其中GI組有9個基因型，GII有22個基因型，而GIV僅有2個基因型[1-2]。在全球暴發(fā)流行的諾如病毒性胃腸炎中，85%以上是由感染不同的GII.4突變株所致，這也是造成散發(fā)性胃腸炎的最主要病因[3-7]。 2014年新發(fā)現的GII.17已超越GII.4成為2014—2015年中國冬季腹瀉暴發(fā)流行的主流株[8]。GII.17也相繼在非洲、亞洲、北美洲及南美洲有不同的散發(fā)性流行報道，其突變率明顯高于2012年流行的GII.4 悉尼株[9-11]。一種基因的重組型（GII.16_GII.4 Sydney）最先在2015年底出現，繼而在北美洲、歐洲及亞洲都有報道[12-14]。最新的一種基因重組型（GII.P16_GII.2的嵌合型）最早出現在2016年底，由德國人報道，并很快在北美洲及亞洲成為引起暴發(fā)性胃腸炎流行的主流株[15-17，43]。

諾如病毒感染是引起散發(fā)性和全球暴發(fā)流行性胃腸炎的最主要病因[18]。自1996年以來，諾如病毒引起了至少6個地區(qū)近50%～70%世界范圍內胃腸炎的暴發(fā)流行[2]。隨著輪狀病毒疫苗在許多國家的預防接種，諾如病毒已迅速成為兒童及成人散發(fā)性胃腸炎的首要病因[18-20]。諾如病毒感染可導致易感人群患病率、住院率大大增加，甚至導致嬰幼兒、老人及免疫缺陷患者死亡。因此，快速準確地鑒定病原對治療患者，預防和控制院內感染及阻斷社區(qū)暴發(fā)流行至關重要。自1972年Dr. Kapikian通過免疫電子顯微鏡首次發(fā)現并報道諾如病毒后的40年里，其實驗室診斷經歷了顯著的變革和發(fā)展[21]。目前，PCR技術是實驗室檢測諾如病毒的最為敏感的方法，簡單快速的免疫學檢測方法由于敏感性低而應用受限，新型納米技術為床旁檢測提供了快速可靠的方法……總之，諾如病毒的實驗室診斷技術的發(fā)展將以簡化方法、降低成本、提高效益、結果精準為目標。

1 諾如病毒的表型及免疫學檢測方法

電子顯微鏡下僅需少量樣本并簡單處理后，就可直觀地從外形上將諾如病毒與多數病毒區(qū)分開來。但電子顯微鏡下區(qū)分小圓病毒的敏感性差，例如諾如病毒、札幌病毒及星狀病毒的外形和大小極其相似，單純電子顯微鏡觀察尚無法區(qū)分三者。一項前瞻性研究對2486份糞便樣本分析發(fā)現，有403份諾如病毒反轉錄PCR（RT-PCR）陽性的樣本在電子顯微鏡下被漏檢[22]。電子顯微鏡因保養(yǎng)維護成本及技術要求高，而對病毒的檢出靈敏度低、特異性差，故不適用于臨床。

自2003年以來，許多針對抗原的檢測方法因其快速、低廉、操作程序簡單而被廣泛應用于諾如病毒抗原的檢測[23]。常見的方法包括：傳統(tǒng)的96微孔板的酶免疫測定（EIA）法、快速膜基免疫層析法以及生物素發(fā)光EIA法。目前，可應用的諾如病毒抗原檢測方法仍然有限，其原因是缺乏可用于捕獲及檢測高變異諾如病毒的保守性抗原的特異性抗體。由于諾如病毒抗原具有高度多樣性，對該檢測方法的敏感度相對較低，但還是比電子顯微鏡的觀察更為敏感。目前，正在開發(fā)的諾如病毒多種抗原檢測的商品化試劑盒，大多僅具有體外診斷的歐洲CE標識，尚無法在美國使用。僅有一種出自德國拜發(fā)公司的第三代諾如病毒EIA檢測試劑盒獲得了美國FDA的初步鑒定，該方法可在病毒暴發(fā)流行期檢測多個樣本，但因其敏感度和特異性有限，目前仍然難以用于病毒胃腸炎的常規(guī)臨床診斷[24]。對檢測諾如病毒抗原的商業(yè)化EIA和免疫層析試劑盒進行的研究評估顯示，這兩種方法的靈敏度均低于RT-PCR對諾如病毒GI和GII的檢測結果[25]。

2 以核酸為基礎的諾如病毒檢測

自1990年以來，以核酸為基礎的RT-PCR技術是諾如病毒實驗室診斷的金標準[1，26]。該方法極其靈敏，能快速準確的檢出臨床樣本中的病毒[22]。但是臨床上解釋諾如病毒核酸陽性結果較為復雜，因為存在無癥狀病毒攜帶者，特別是接受了器官或骨髓移植的患者[27-29]。因此無法評估這類患者在病毒感染傳播中的作用以及是否需要對其作為感染源危險人群實施控制和監(jiān)測。以核酸為基礎的檢測主要用于流行病學病因的檢測以及醫(yī)院內感染的的鑒別和感控的隨訪。

2.1 常規(guī)RT-PCR技術（cRT-PCR） cRT-PCR是指在核酸的擴增過程中，其擴增產物可以累積，并在進行檢測或分析前隨著熱循環(huán)的完成或終止時達到平臺。這類PCR產物通常采用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行長度判別，從而檢測擴增的PCR產物。Jiang等[30]于1992年首次采用cRTPCR技術鑒定并報道了諾如病毒感染。cRT-PCR主要的缺陷在于步驟繁雜、勞動強度大且耗時長；產量低、變異率高；擴增產物須要置于開放體系中操作，污染風險高。由于設計了型特異性引物，使得cRT-PCR已廣泛應用于確定諾如病毒進化的分子流行病學調查。對PCR擴增產物測序已廣泛應用于研究諾如病毒株的基因變異，及暴發(fā)流行的調查研究。

2.2 等溫擴增技術 核酸序列依賴性擴增（nucleic acid sequence-based ampli fi cation, NASBA） 技術和環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal ampli fi cation,LAMP）技術均屬于等溫擴增法，可用于檢測糞便樣本中的諾如病毒。該方法的優(yōu)點為單一溫度條件下的擴增，無需熱循環(huán)儀，類似實時PCR，且敏感性極高。NASBA技術可用于檢測諾如病毒RNA，但其特異性還沒有達到臨床診斷的要求，由于在相對較低的溫度條件下（-40℃）擴增病毒RNA時，其特異性會隨之降低。LAMP技術的優(yōu)勢在于檢測速度快、操作簡便，反應在單管中進行，且反應時間少于1 h。通常溫度要求在60～65℃，無需大型設備，只需簡單的加熱器或水浴即可。結果的判讀只需直觀的觀察渾濁度或采用濁度閱讀器，也可添加金屬熒光指示劑來提高濁度的可讀性。LAMP技術已應用于檢測GI和GII型諾如病毒，可提供與實時熒光定量反 轉 錄PCR（real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR）相當的檢測結果。近來商業(yè)化的諾如病毒GI和GII型LAMP試劑盒已被日本Eiken Chemical公司開發(fā)，其敏感性高于實驗室開發(fā)的LAMP技術[31]。未來LAMP技術將作為可選擇性、快速準確的檢出諾如病毒的方法之一。

2.3 qRT-PCR技術 該技術的原理是通過非特異性熒光染料偶聯到目標特異性探針上，實時檢測特異性的核酸生成，且每一輪PCR循環(huán)后均可檢測擴增產物。諾如病毒開放性讀碼框ORF1/2連接區(qū)是其最保守的基因區(qū)，該區(qū)域的靶向引物可用于實時檢測諾如病毒不同基因型并具有高度敏感性。針對諾如病毒個體基因組的特異性引物（GI和GII），現已開發(fā)出具有高敏感性且能分型諾如病毒的多重qRT-PCR技術，能廣譜地檢測許多基因型的諾如病毒，包括新近報道的GII.17型突變株[1，8，11，32]。盡管如此，基于保守區(qū)設計的引物和探針不能確保對突變株檢測的均一敏感性。由于存在不可預測的單核苷酸的多態(tài)性[33]，因此，設計的引物和探針應當適當進行調整以滿足檢測所需。Pang等[26]設計了針對諾如病毒GI和GII的特異性引物，構建了多重qRT-PCR技術用于區(qū)分并檢測不同基因組的諾如病毒。多重檢測技術將檢測時間縮短了至少50%，并降低了試劑成本，從而提高了檢測效率。目前已開發(fā)的包含引物和探針的LightCyclerq RT-PCR技術檢測GIV型諾如病毒，已在全球特別是北美的臨床型和研究型實驗室得到了廣泛應用[29，34-36]。近來出現了許多諾如病毒實時定量檢測的商業(yè)化試劑盒，經應用證實只有少數有較為可靠和滿意的檢測結果：RIDAGENE（德國）針對諾如病毒I和II型的qRT-PCR技術能廣譜測定各型的諾如病毒感染情況，并具有很好的敏感性和特異性[25]。

在對諾如病毒的前期研究中，我們采用Pang等[22，26]構建的qRT-PCR技術分型檢測腫瘤患者糞便中的諾如病毒感染情況，并與目前FDA認證的Luminex多重檢測技術進行了平行對比，一致率達到100%。所有標本我們都進行了重復性實驗，同時做了組內及組間的對比實驗，其組間的變異CV=2.42%，組內的變異 CV=0.83%，提示了Pang等構建的熒光定量PCR技術在組內及組間具有非常高的精密度和準確度。在對患腫瘤的免疫缺陷病人檢測中，我們發(fā)現諾如GII型的感染率及病毒載量明顯高于GI型。在對臨床資料的多因素分析中，我們發(fā)現感染GII的患者呈現出更為嚴重的臨床癥狀。

2.4 多重PCR檢測技術 基于固相或懸浮芯片的多重PCR檢測技術，為臨床多種病原的快速篩查帶來了便利。目前采用的寡核苷酸芯片技術以固相載體為支持的膜芯片，雖檢測信息量大，但受表面張力、空間效應等影響重復性不好，無法定量檢測。Luminex公司開發(fā)的多指標同步分析功能的芯片技術也稱為液態(tài)芯片或懸浮芯片，可實現對一份微量樣品同時進行多達100種不同分析指標的檢測，具有快速、操作簡單、靈敏度高、重復性好、高通量等優(yōu)點。Zhang等[36]回顧了兩個商業(yè)化的多重檢測技術平臺，Luminex公司（美國德克薩斯州，奧斯汀）開發(fā)的胃腸道病菌檢測系統(tǒng)（GPP）和BioFire公司（美國猶他州，鹽湖城）開發(fā)的薄膜陣列式胃腸檢測系統(tǒng)（GI Panel）都可以用于檢測GI和GII型諾如病毒，據報道上述兩種方法比傳統(tǒng)的多重檢測方法的靈敏度更高。這些全封閉的自動化系統(tǒng)，在鑒別散發(fā)性或暴發(fā)流行性胃腸炎的多種復雜病原體方面展現了巨大的潛能：處理樣本僅需2～5 min，上機時間少于1 h[37]。這些將有助于臨床醫(yī)生作出迅速的判斷和臨床干預，已期達到有效控制感染傳播的目的。2.5 基因分析檢測 基因分型有助于更好的理解諾如病毒的基因進化、分類和分子流行病學特征，多應用于研究機構和公共健康實驗室。人類諾如病毒可分為不同的基因組、基因型及突變株。因其基因組的高度多變性，基因分型多需要結合RTPCR擴增后的產物進一步測序鑒定。根據基因組A～E區(qū)的5個不同區(qū)域可以對諾如病毒基因分型。最新研究發(fā)現基于C～E區(qū)設計的外殼蛋白基因引物用于分型有獨特之處，因為病毒的外殼蛋白直接反映了宿主-受體相互作用、免疫應答及相關的基因突變信息[3，5]。就目前的認識而言，諾如病毒基因分型的金標準是VP1外殼全基因測序。但由于臨床樣本中的病毒攜帶量較低，擴增并測序部分病毒外殼序列進行分型比全外殼序列更具有可操作性。Hasing等[38]報道基于開放性讀碼框ORF1/2連接區(qū)設計的引物可以更好的鑒定發(fā)生了抗原漂移的諾如病毒。目前，與諾如病毒胃腸炎相關的至少有40種基因型，可歸為兩大基因組（GI和GII）。

2.6 高通量測序 下一代基因測序（即高通量測序）技術已從研究領域逐步進入應用和診斷領域。因其具有高準確性、高通量、高靈敏度和低運行成本等突出優(yōu)勢而被廣泛應用于基因組學的研究。諾如病毒的基因組全長7500 bp，相對較小，采用全基因測序將是研究諾如病毒的新方法。最新的基因測序擴增子文庫給研究者提供了快速擴增諾如病毒基因組不同區(qū)域的基因信息，采用此方法，成千上萬個擴增子可同時生成并用于檢測[39-42]。高通量測序可使研究者在單個實驗中同時分析感興趣的全部基因信息。隨著測序技術的發(fā)展，高通量測序可從臨床樣本中鑒定諾如病毒的常見株及突變株。并可追蹤諾如病毒的基因進化和發(fā)現新突變株，潛在的預測諾如病毒胃腸炎的暴發(fā)流行。目前高通量測序多應用于研究型實驗室，隨著標準化試劑和監(jiān)測系統(tǒng)的研發(fā)，該技術將會在不久的將來被診斷型實驗室所采用。

3 結論及展望

當前用于檢測諾如病毒的方法都存在一些優(yōu)缺點，沒有一種方法堪稱為完美無缺。每個實驗室應結合自身的需求和目的（診斷或研究），實驗室背景（參考性或地方診斷性實驗室），儀器及專業(yè)性技術的需求等來選擇合適的檢測方法。諾如病毒的免疫學方法檢測主要用于監(jiān)測可疑的諾如病毒性胃腸炎的暴發(fā)流行，由于其靈敏度低而不推薦用于常規(guī)的診斷實驗室。qRT-PCR技術是檢測糞便、食物及環(huán)境中諾如病毒的最佳方法。盡管如此，由于諾如病毒的基因型多樣性和持續(xù)的基因進化，當僅采用單對特異性引物擴增時，容易出現假陰性結果。設計能靶向諾如病毒不同基因組區(qū)域的多元引物集簇的方法可以提高病毒的檢出率。此外，還可以利用已知諾如病毒家族成員序列變異的簡并引物進行擴增檢測。一些新技術如以LAMP技術，納米技術為基礎的多重檢測平臺和高通量測序系統(tǒng)已發(fā)展成為研究機構檢測諾如病毒的主要方法，期待在不久的將來把這些新技術、新方法運用到診斷實驗室中去，以滿足服務臨床，精準診療的新需求。

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Laboratory diagnosis of norovirus: present and future

HE Tao-jun*, LU Xue-dong, PANG Xiao-li, TANG Yi-wei
Laboratory Department, Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Shenzhen 518033, China

Norovirus is recognized as the primary cause of nonbacterial acute gastroenteritis and often causes serious public health and food safety concern. Fast evolution and continuous drifting of norovirus genome have posed challenges for clinical diagnosis and vaccine development. This review updates the research of laboratory diagnosis of norovirus, from classic nucleic detection to recent application of nanotechnology and chip, such as a multiplex RT-qPCR detection and high-throughput sequencing. A very recent breakthrough in cell culture of norovirus in vitro is also introduced. The latest advance of technology improves the laboratory diagnosis of norovirus, thus meeting the requirement of clinical diagnosis and vaccine development.

norovirus; laboratory diagnosis; multiplex RT-qPCR; high-throughput sequencing; in vitro cell culture

R373

A

1007-8134(2017)05-0265-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.005

美國NIH科研基金（P30 CA008748）

518033 深圳，中山大學附屬第八醫(yī)院檢驗醫(yī)學部（何濤君、陸學東）；T6G 2J6 加拿大埃德蒙頓，阿爾博塔省立公共衛(wèi)生實驗室（龐曉莉）；阿爾博塔大學醫(yī)學院醫(yī)學實驗和病理學系（龐曉莉）；10021 紐約，美國紀念斯隆-凱特琳癌癥中心（湯一葦）

何濤君，E-mail： htjjocelyn@126.com

*Corresponding author, E-mail: htjjocelyn@126.com

（2017-09-17收稿 2017-10-09修回）

（本文編輯 趙雅琳）