莫氏馬尾藻多糖的分離及理化性質(zhì)評價

侯寧寧, 王 晶, 張全斌

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莫氏馬尾藻多糖的分離及理化性質(zhì)評價

侯寧寧1, 2, 王 晶1, 張全斌1

(1. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

以莫氏馬尾藻()為原料, 分別采用熱水和稀酸兩種提取方式提取莫氏馬尾藻多糖, 通過DEAE-Sepharose FF柱層析進行分級純化, 利用化學分析方法并結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)、紅外譜圖、核磁共振譜圖對分離到的莫氏馬尾藻多糖及其分級組分的理化性質(zhì)及基本結(jié)構(gòu)進行分析, 并對其主要組分的抗氧化與抗凝血活性進行研究。研究結(jié)果表明: 莫氏馬尾藻多糖是以巖藻糖為主, 且含有少量硫酸根和糖醛酸的酸性多糖; 莫氏馬尾藻多糖清除自由基能力較強, 具有良好的抗氧化活性; 同時, 該多糖可以通過抑制內(nèi)源性凝血途徑起到抗凝血作用, 具有一定的開發(fā)前景。

莫氏馬尾藻多糖; 巖藻糖; 抗氧化; 抗凝血

莫氏馬尾藻(), 隸屬于褐藻門、圓子綱、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬。藻體高達1.5 m, 黃褐色。莫氏馬尾藻主要分布于香港、廣東、海南和廣西沿海等海域, 生長于低潮帶或潮下帶巖石上[1]。莫氏馬尾藻具有生長快和生物量大的特點, 是在海洋環(huán)境生態(tài)修復上具有顯著優(yōu)勢的一種大型海藻。截止目前, 國內(nèi)外對莫氏馬尾藻的研究還僅限于對其繁殖生物學及其多酚成分的抗氧化和抗腫瘤細胞增殖作用等方面[2-3]。對于莫氏馬尾藻中多糖等其他活性成分的分離、理化性質(zhì)及活性評價尚未見報道。

研究表明, 馬尾藻屬藻類含有豐富的膳食纖維、褐藻淀粉、礦物質(zhì)和維生素以及優(yōu)質(zhì)的高度不飽和脂肪酸和合理的必需氨基酸組成, 脂肪含量較低, 可作為保健食品和藥物的優(yōu)質(zhì)原料[4]。

馬尾藻屬藻類含以巖藻糖為主要組成單糖的硫酸化多糖, 但是不同藻類中多糖的理化特性和生物活性有很大差別。目前已有南海亨氏馬尾藻()、半葉馬尾藻()等多糖抗腫瘤活性的研究, 表明亨氏馬尾藻多糖對小鼠艾氏腹水瘤和腹水型肉瘤180有較明顯的抑制作用[5]。

本文以莫氏馬尾藻為研究材料, 對其多糖的分離、理化性質(zhì)和抗氧化、抗凝血活性進行評價, 以期為莫氏馬尾藻多糖的研究和應用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

莫氏馬尾藻(Setch)采集自中國廣東硇洲島, 由廣東海洋大學謝恩義教授鑒定并提供。原料經(jīng)自來水洗滌, 除去泥沙, 干燥, 然后粉碎成藻粉保存?zhèn)溆谩?/p>

單糖標準品: D-甘露糖(Man), L-鼠李糖(Rha), D-葡萄糖醛酸(GlcA), D-葡萄糖(Glc), D-半乳糖(Gal), D-木糖(Xyl), L-巖藻糖(Fuc), 2-脫氧核糖均購自Sigma公司。Folin 酚試劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。不同分子量右旋糖酐(dextran)購自中國藥品生物制品檢定所?；罨糠帜蠲笗r間(APTT)測定試劑盒, 凝血酶原時間(PT)測定試劑盒, 凝血酶時間(TT)測定試劑盒均購自南京建成有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器(上海東亞壓力容器制造有限公司); L2S可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司); 高效液相色譜儀(日本島津LC-20AT); 恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(無錫市星海王生化設備有限公司); SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水多用真空泵(鄭州英峪領(lǐng)科儀器設備有限公司); 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司); BSA124S電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司); L-550臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 莫氏馬尾藻多糖的提取

莫氏馬尾藻采用乙醇加熱回流方法脫脂, 去除色素和小分子脂溶性物質(zhì), 固形物干燥后分別采用熱水提取和稀酸提取兩種方式提取莫氏馬尾藻多糖。

(1) 熱水提取: 料液比1︰30, 加壓提取, 溫度120℃, 提取時間4 h, 提取液進行硅藻土過濾、濃縮, 濃縮液中加入CaCl2溶液至濃度為0.2 mol/L, 離心去除褐藻膠沉淀, 上清液透析, 醇沉, 得到粗多糖SMP。

(2) 稀酸提取: 采用0.1 mol/L的稀鹽酸進行攪拌提取, 料液比1︰15, 提取時間2 h, 提取液用氫氧化鈉中和至pH5~7, 后續(xù)處理過程同熱水提取, 得到酸提粗多糖SMP-A。

1.2.2 多糖分級純化

粗多糖SMP和SMP-A分別通過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析進行分級純化, 采用0~ 2 mol/L NaCl溶液梯度洗脫方式對獲取的粗多糖進行分級純化, 苯酚-硫酸法檢測多糖濃度, 繪制濃度曲線, 收集分級組分, 減壓濃縮后透析, 冷凍干燥, 得到純化多糖組分。

1.2.3 低分子質(zhì)量多糖樣品制備及分級純化

將粗多糖樣品SMP采取自由基方式降解, 采用過氧化氫與抗壞血酸降解, 并對獲取的降解組分采用DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子柱層析進行分級。

1.2.4 理化性質(zhì)分析

可溶性總糖: 苯酚-硫酸法[6]; 巖藻糖含量: 半胱氨酸鹽酸鹽法[7]; 硫酸根含量: 明膠-氯化鋇法[8]; 糖醛酸含量: 咔唑比色法[9]; 多酚含量: 沒食子酸-福林酚法[10]; 單糖組成分析: 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法[11]; 分子質(zhì)量分布分析: 高效凝膠色譜法, 色譜條件: 流動相為0.1 mol/L的Na2SO4溶液, 色譜柱為TSK Gel G3000 PWxl 柱, RI檢測器。紅外光譜測定: 采用溴化鉀壓片法, 在Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀上進行測定。核磁分析: 將多糖(50 mg)與氘代水混合, 冷凍, 重復上述步驟兩次, 再以氘代水溶解樣品, 進行核磁共振波譜分析。

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 超氧陰離子自由基(O2.)清除能力采用鄰苯三酚比色法[12]

于10 mL比色管中依次加入4.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2), 不同濃度的待測多糖溶液1 mL, 蒸餾水 2.4 mL, 混勻, 25℃下保溫10 min后加入 0. 1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚, 計時, 搖勻, 準確反應3 min后, 加入10 mol/L HCl溶液0.1 mL, 終止反應, 以雙蒸水為對照, 在325 nm下測定吸光值。

清除率計算公式為

清除率(%)=[1–(i–j)/0]×100

其中,0為用水代替多糖時測得的吸光值:i為不同多糖濃度下測得的吸光值;j為用水代替鄰苯三酚時不同多糖濃度下測得的本底吸光值。

1.2.5.2 羥基自由基清除能力(.OH)采用硫酸亞鐵-水楊酸法[12]

在10 mL的試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL、不同濃度的多糖溶液1 mL和6 mmol/L的H2O2溶液1 mL, 搖勻, 靜置10 min, 再加入6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL, 搖勻, 靜置30 min后, 以雙蒸水為對照, 于510 nm處測其吸光值。清除率計算公式為

清除率(%)=[1–(i–j)/0]×100

其中,0為用水代替多糖時測得的吸光值;i為不同多糖濃度下測得的吸光值;j為用水代替水楊酸時不同多糖濃度下測得的本底吸光值。

1.2.5.3 DPPH采用DPPH標準品-乙醇法測定

1 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液加入到不同濃度的樣品溶液中(3 mL, 樣品用50%乙醇溶解), 劇烈搖動, 室溫放置20 min, 最后在517 nm測定。對照組, 采用50%乙醇替代樣品液。

清除率(%)=(1–樣/對照)×100

1.2.5.4 還原力的測定采用鐵氰化鉀-三氯化鐵法

1.25 mL 鐵氰化鉀(1%)加入到不同濃度的樣品溶液中(1 mL), 然后50℃水浴20 min, 加入三氯乙酸(2.5 mL)停止反應, 最后加入三氯化鐵(1.5 mL), 振勻, 于700 nm測定吸光度。

1.2.6 抗凝血能力測定

活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)的測定嚴格按照試劑盒的說明書進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)分析

2.1.1 莫氏馬尾藻粗多糖

通過熱水提取及稀酸提取, 分別獲取粗多糖SMP與SMP-A。水提及酸提粗多糖的差別主要在巖藻糖及硫酸根的含量上, 酸提多糖巖藻糖和硫酸根含量明顯高于水提多糖, 從單糖組成分析, 二者單糖種類一樣, 但是各單糖的含量則有所差異。水提多糖和酸提多糖的多酚含量均低于1%(分別為0.93%和0.66%), 見表1。

表1 莫氏馬尾藻粗多糖及分級組分的化學組分分析

注: -表示未檢出

2.1.2 粗多糖的分級純化

通過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱, 采用0~2 mol/L NaCl溶液梯度洗脫方式對獲取的粗多糖進行分級純化, 水洗后的洗脫曲線圖1所示。除上樣后的水洗部分分別得到水洗組分(分別為SMP-W、SMP-A-W)外, 從圖中可以看出, 二者的洗脫曲線類似, 均呈現(xiàn)一個主要的洗脫峰, 對應洗脫濃度為0.5 mol/L (分別為SMP-0.5 mol/L、SMP-A-0.5 mol/L),對主洗脫峰后的洗脫液收集后得到1.2 mol/L洗脫組分(分別為SMP-1.2 mol/L、SMP-A-1.2 mol/L), 對每一組分進行透析除鹽、冷凍干燥, 最后樣品分級的總回收率在70%左右; 其中0.5 mol/L洗脫組分含量最多, 為主要組分, 也是后期活性測定的主要組分。并對各分級組分進行相應的組成成分分析, 結(jié)果見表1。

圖1 SMP與SMP-A洗脫曲線

根據(jù)所得數(shù)據(jù)分析可知, 0.5 mol/L洗脫組分是以巖藻糖為主, 單糖組成較復雜的硫酸化雜多糖, 含有少量的硫酸根。其中, SMP-A-0.5 mol/L的巖藻糖含量及半乳糖含量要高于SMP-0.5 mol/L, 這與其粗多糖的分析結(jié)果一致。SMP-A-W硫酸根和糖醛酸含量都很低, 基本為有巖藻糖和半乳糖組成的中性多糖, 而水提多糖SMP的水洗組分SMP-W組成更為復雜。1.2 mol/L洗脫組分均具有更高的硫酸根含量, 這也符合陰離子交換洗脫的規(guī)律。

2.1.3 水提粗多糖的降解

由于SMP分子質(zhì)量超過800 kD, 為了評價分子質(zhì)量大小對多糖SMP抗凝血活性的影響, 本研究采用自由基降解方法對SMP進行降解, 制備了重均分子質(zhì)量為10 kD的水提多糖降解產(chǎn)物SMP-D, 并采用同樣的陰離子交換方式進行分級處理, 獲取其主要的分級組分SMP-D-0.5 mol/L, 二者的化學組分分析結(jié)果如表2所示。降解后多糖的分子質(zhì)量明顯降低, 其他單糖組成等指標沒有明顯變化。

表2 SMP降解產(chǎn)物及其分級組分理化性質(zhì)分析

2.2 紅外和核磁共振波譜分析

對獲取的莫氏馬尾藻多糖及其主要分級組分(0.5 mol/L洗脫組分)以及低分子量莫氏馬尾藻多糖進行FT-IR分析, 紅外譜圖如圖2所示。由紅外譜圖可知, 莫氏馬尾藻粗多糖及其0.5 mol/L分級組分具有相似的官能團吸收峰; 其中SMP-0.5 mol/L與SMP-D-0.5 mol/L的IR譜圖基本一致, 表明氧化降解沒有破壞多糖的結(jié)構(gòu)骨架。對譜峰分析結(jié)果為: 821 cm–1為C-2位硫酸根取代峰; 1 200 cm–1左右處為O=S=O; 1 417和1 602 cm–1為糖醛酸中C=O伸縮振動; 3 352 cm–1為糖殘基中O-H的伸縮振動; 1 027 cm–1是糖苷鍵的C-O-C伸縮振動。表明其為典型的硫酸化多糖。

圖2 莫氏馬尾藻多糖的紅外譜圖

由于粗多糖結(jié)構(gòu)復雜, 其核磁共振譜圖難以辨析, 因此需要對多糖進行一定處理方可進行相關(guān)譜圖分析。作為莫氏馬尾藻多糖的主要分級組分, 多糖SMP-D-0.5 mol/L分子質(zhì)量相對較低、且多糖理化指標具有一定的代表性, 因此以組分SMP-D-0.5 mol/L為基礎, 對多糖的結(jié)構(gòu)進行初步研究。圖3所示為SMP-D-0.5 mol/L的13C-NMR譜圖。由于SMP-D- 0.5 mol/L為多種單糖組成的雜多糖, 無論是90×10–6~105×10–6的異頭碳區(qū)域, 還是60×10–6~90×10–6的C2- C5信號區(qū)域, 都非常復雜, 單憑一維碳譜難以辨識每個信號歸屬。176×10-6區(qū)域的信號說明該多糖含有一定的糖醛酸, 而15×10–6~17×10–6的巖藻糖C-6甲基信號非常明顯。結(jié)合紅外譜圖及核磁共振譜圖, 并參考相應的理化數(shù)據(jù)可知, 莫氏馬尾藻多糖是以巖藻糖為主, 硫酸根主要在C2的含有少量糖醛酸的結(jié)構(gòu)復雜的多糖。

圖3 SMP-D-0.5 mol/L碳核磁共振譜圖

2.3 活性測定

通過理化性質(zhì)分析, 粗多糖SMP、SMP-A及其0.5 mol/L分級組分(即SMP-0.5 mol/L、SMP-A-0.5 mol/L)的總糖含量較高, 而兩種粗多糖對應的水洗組分及1.2 mol/L組分總糖含量較低, 且回收得率較高, 因此在活性測定方面選取總糖含量及得率相對較高粗多糖SMP、SMP-A及其0.5 mol/L分級組分(SMP-0.5 mol/L、SMP-A-0.5 mol/L)進行相關(guān)活性測定。

2.3.1 抗氧化活性

以抗壞血酸Vc作為陽性對照, 分別測定樣品SMP、SMP-A、SMP-0.5 mol/L及SMP-A-0.5 mol/L的抗氧化能力。莫氏馬尾藻多糖清除超氧陰離子自由基的結(jié)果見圖4, 可以看出, 莫氏馬尾藻多糖清除超氧陰離子自由基的能力較Vc弱, 但是隨著濃度增加, 其清除能力逐漸增強, 在濃度達到0.4 g/L時趨于穩(wěn)定, 且清除率均達到50%以上; 且在相同濃度下, 其清除能力大小為Vc>SMP-A-0.5 mol/L>SMP- 0.5 mol/L>SMP>SMP-A。

圖4 莫氏馬尾藻多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

莫氏馬尾藻多糖對羥自由基的清除作用見圖5。由圖5可知, 水提粗多糖SMP及其分級組分SMP- 0.5 mol/L對羥基自由基的清除能力較Vc強, 而酸提粗多糖SMP-A及其分級組分SMP-A-0.5 mol/L的清除能力則較Vc要弱; 但是都具有濃度依賴性。且在一濃度下, 其清除能力大小為SMP>SMP-0.5 mol/L> Vc>SMP-A>SMP-A-0.5 mol/L。

莫氏馬尾藻多糖組分對DPPH的清除作用見圖6(數(shù)據(jù)SD值小于0.01, 無法在圖中顯示)。四種多糖對DPPH自由基的清除能力均弱于Vc, 且在濃度達到5 g/L時, 四種多糖的清除能力仍小于50%。但是, 對于DPPH自由基的清除能力均有濃度依賴性。且在相同濃度下, 其清除能力大小為Vc>SMP>SMP- 0.5 mol/L>SMP-A>SMP-A-0.5 mol/L。

圖5 莫氏馬尾藻多糖對羥基自由基的清除作用

圖6 莫氏馬尾藻多糖的對DPPH自由基的清除作用

還原能力實驗主要用于測定樣品對三價鐵和鐵氰化物的還原能力, 作為抗氧化能力的一個重要指標; 且在700 nm的吸光度越大, 代表還原能力越強。由圖7可知, 四種多糖的還原能力均隨著濃度增大而逐漸增強, 但是卻弱于維生素C(在該濃度范圍下, Vc的吸光度已超出范圍; 且數(shù)據(jù)SD值小于0.01, 無法在圖中顯示)。在相同濃度下, 其清除能力大小為SMP>SMP-0.5 mol/L>SMP-A>SMP-A-0.5 mol/L。

圖7 莫氏馬尾藻多糖的還原能力

通過對四種多糖在清除自由基能力方面的測定發(fā)現(xiàn), 四種多糖均具有一定的抗氧化能力, 且隨著濃度增加逐漸增強, 這與王晶、金維華等[13-15]對于海藻多糖抗氧化能力的研究結(jié)果一致。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn), 水提莫氏馬尾藻多糖及其分級組分的清除自由基及還原能力較酸提多糖及其分級組分要強。

2.3.2 抗凝血活性

以生理鹽水為陰性對照, 肝素鈉(HP)為陽性對照, 測定了幾種多糖及降解后的低分子量多糖的抗凝血活性。同時, 對其他褐藻多糖的研究表明分子質(zhì)量對多糖抗凝血活性有一定影響, 因此為評價分子質(zhì)量大小對多糖SMP抗凝血活性的影響, 利用氧化降解方法制備粗多糖SMP的降解物SMP-D, 并對其抗凝血活性進行測定。

通過實驗發(fā)現(xiàn), 各種多糖的APTT及TT測試中與濃度呈現(xiàn)一定的正相關(guān)(譜圖較多, 未放入), 但是PT實驗中凝血時間長短與濃度則沒有相關(guān)性。故對每一種多糖選取了0.5 g/L的濃度進行比較其抗凝血能力強弱。結(jié)果如圖8-10所示。

圖8 不同莫氏馬尾藻多糖的活化部分凝血酶時間(**. P< 0.01, *. P<0.05)

由圖8可知, 在樣品濃度為0.15g/L時, 樣品的凝血時間均短于肝素鈉, 即抗凝效果要弱于肝素鈉。但是與生理鹽水組相比較, 除了低分子量多糖及其分級組分外, 其余四種多糖的凝血時間均大于生理鹽水組, 其中SMP、SMP-A及SMP-A-0.5 mol/L與生理鹽水對照組相比差異性顯著, 說明未降解的四種多糖組分具有一定的延長活化部分凝血酶時間的作用。由圖9 可知, 與生理鹽水相比, 六種多糖組分在凝血酶時間的測定時, 未顯現(xiàn)出明顯差別, 只有細微的區(qū)別。由圖10 可知, 六種多糖組分在凝血酶原時間的測定時, 與生理鹽水組相比, 沒有較明顯差別, 即對于延長凝血酶原時間無效。

圖9 不同莫氏馬尾藻多糖的凝血酶時間(**. P<0.01, *. P<0.05)

圖10 不同莫氏馬尾藻多糖的凝血酶原時間(**. P<0.01, *. P<0.05)

通過上述實驗數(shù)據(jù)分析可知, 大分子質(zhì)量的莫氏馬尾藻多糖對于延長活化部分凝血酶時間(APTT)具有良好的作用, 但是對于凝血酶原時間(PT)則無效。而低分子質(zhì)量的多糖及其分級組分在三種實驗中均沒有表現(xiàn)出效果, 說明抗凝血作用與分子質(zhì)量大小相關(guān), 分子質(zhì)量太小, 影響抗凝血活性, 這與于廣利等的研究結(jié)果一致[16-18]。

APTT時間的延長說明樣品抑制了內(nèi)源性凝血系統(tǒng), TT時間的延長說明樣品抑制了凝血酶活性或纖維蛋白的聚合作用, 而PT時間延長則說明樣品抑制外源性凝血系統(tǒng)。在本實驗中, 樣品可顯著延長APTT, 但是對于PT則沒有效果, 說明莫氏馬尾藻多糖的抗凝血作用主要是通過抑制內(nèi)源性凝血系統(tǒng)起作用的, 這與劉雪蓮等對于海藻多糖的抗凝血活性研究結(jié)果一致[19-21]。

3 結(jié)論

通過熱水提取和稀酸提取獲得的莫氏馬尾藻粗多糖, 并對其進行分級純化。結(jié)果表明, 莫氏馬尾藻多糖是以巖藻糖為主, 含有糖醛酸及多種單糖的結(jié)構(gòu)較復雜的硫酸化多糖。

莫氏馬尾藻多糖具有良好的抗氧化和抗凝血活性。其抗氧化能力與濃度呈現(xiàn)正相關(guān), 且水提多糖的抗氧化能力要強于酸提多糖?？鼓饕峭ㄟ^抑制內(nèi)源性凝血途徑起抗凝血作用的, 并且與分子量呈正相關(guān)。本文研究結(jié)果表明莫氏馬尾藻多糖可以作為良好的抗氧化和抗凝血劑, 具有較好的藥用開發(fā)前景。

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(本文編輯: 康亦兼)

Isolation and Characterization of polysaccharides from

HOU Ning-ning1, 2, WANG Jing1, ZHANG Quan-bin1

(1. Key Laboratory of Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Polysaccharides were extracted fromby hot water and diluted acid. Subsequently, they were fractionated by an anion exchange column chromatography. The physicochemical properties and structural features of the polysaccharides were elucidated based on HPLC, FT-IR, NMR, and other chemical analyses. Moreover, the antioxidant and anticoagulation activities were examined in vitro. The results showed that the polysaccharides fromwere a type of sulfated polysaccharides, composed mainly of fucose, with some uronic acid. The in vitro antioxidation experiment indicated that thepolysaccharides had good antioxidant activity and a strong ability to scavenge free radicals. Additionally, the anticoagulant assay indicated that the polysaccharides could inhibit the intrinsic pathways.The results that are presented in this study demonstrate the potential use of polysaccharides as antioxidants and anticoagulants.

; polysaccharides; fucose; antioxidant activity; anticoagulant activity

Feb. 18, 2017

侯寧寧(1991-), 女, 山東壽光人, 研究方向: 海藻化學及海洋藥物, 電話: 0532-82898708, Email: houningning14@mails.ucas.ac.cn; 張全斌,

, 博士生導師, 研究員, 研究方向: 海藻化學與海洋藥物, 電話: 0532-82898708, Email: qbzhang@qdio.ac.cn

A

1000-3096(2017)09-0102-08

10.11759/hykx20170218001

2017-02-18;

2017-04-25

山東省重點研發(fā)計劃(海洋醫(yī)用食品)(2016YYSP002); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201405040)

[The Key Research and Development Project of Shandong province, No.2016YYSP002; Marine Scientific Research in the Public Interest, No.201405040]