牙鲆17β-HSD1基因克隆及其表達(dá)調(diào)控的初步研究

梁冬冬, 范兆飛, 鄒玉霞, 譚訓(xùn)剛, 吳志昊, 焦 爽, 李 軍, 尤 鋒

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牙鲆基因克隆及其表達(dá)調(diào)控的初步研究

梁冬冬1, 2, 3, 范兆飛1, 2, 3, 鄒玉霞1, 2, 譚訓(xùn)剛1, 2, 吳志昊1, 2, 焦 爽1, 2, 李 軍1, 2, 尤 鋒1, 2

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

17β-羥類固醇脫氫酶1(17β-HSD1)的主要作用是將雌酮(El)轉(zhuǎn)化為發(fā)揮功能的雌二醇(E2)。作者從牙鲆()性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列, 對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證, 并分析了該基因在高溫、外源性激素處理?xiàng)l件下性腺分化期性腺組織中的差異表達(dá)以及cAMP和轉(zhuǎn)錄因子(NR5a2和NR0b1)在精巢原代細(xì)胞中對(duì)該基因表達(dá)的作用。結(jié)果顯示, 牙鲆基因的ORF為873bp, 編碼290個(gè)氨基酸, 與其他魚(yú)類的有很高的相似性。半定量RT-PCR結(jié)果表明, 該基因在卵巢中高表達(dá), 精巢有少量表達(dá), 并且在雌性個(gè)體的鰓、頭腎、腎、脾、胃和腸中也有表達(dá)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示, 該基因在卵巢或精巢分化的關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)量較高; 在精巢原代培養(yǎng)細(xì)胞中, 外源信號(hào)分子cAMP及轉(zhuǎn)錄因子NR5a2可以顯著下調(diào)基因的表達(dá)(< 0.05), 且呈現(xiàn)劑量效應(yīng), 轉(zhuǎn)錄因子NR0b1對(duì)該基因的調(diào)控也與劑量有關(guān)。作者推測(cè)牙鲆基因在性腺分化中起一定的作用, 其表達(dá)受到調(diào)控因子的作用, 這些結(jié)果將有助于增加對(duì)魚(yú)類性腺分化和發(fā)育的認(rèn)識(shí)。

牙鲆(); 17β-羥類固醇脫氫酶1; ORF克隆; 表達(dá); 調(diào)控

性類固醇激素在魚(yú)類性腺分化過(guò)程中非常重要。17β-羥類固醇脫氫酶1(17β-HSD1)作為性激素合成途徑中關(guān)鍵酶之一, 在很多物種中的主要作用是將雌酮(El)轉(zhuǎn)化為雌二醇(E2)[1]。在關(guān)于人的研究中較為深入, 其在卵巢或胎盤(pán)等產(chǎn)類固醇激素的組織中高表達(dá)[2], 該基因在乳腺癌患者中表達(dá)上調(diào), 導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)多的E2, 進(jìn)而刺激腫瘤內(nèi)的細(xì)胞增殖[3]。在魚(yú)類研究中有一些報(bào)道, 如鯰魚(yú)()的主要在卵巢中表達(dá); 有些魚(yú)類也有關(guān)于其催化雄激素合成的報(bào)道, 如在尼羅羅非魚(yú)()中就可以將雄烯二酮轉(zhuǎn)化成睪酮(T), 盡管效率不高[4-5]。因而, 17β-HSD1參與了E2和T的合成, 在硬骨魚(yú)類的性腺分化和配子形成中起非常重要的作用。在除性腺外的其他組織中也表達(dá)并發(fā)揮作用, 如該基因在斑馬魚(yú)()的皮膚、肌肉和眼等其他組織中有少量表達(dá)[6]。

促性腺激素可通過(guò)環(huán)腺苷單核苷酸(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)途徑激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子, 進(jìn)而調(diào)控性類固醇激素合成酶基因的表達(dá)[7]。核受體超家族的NR5a2與共轉(zhuǎn)錄因子(如類固醇受體共調(diào)控因子1、劑量敏感性逆轉(zhuǎn)因子(NR0b1: 核受體超家族的成員)等)相互作用也能調(diào)節(jié)性類固醇激素合成酶基因的表達(dá)[8], 如在NR0b1缺陷小鼠()精巢的Leydig細(xì)胞中, 芳香化酶基因表達(dá)上調(diào)4倍[9]。研究顯示, NR5a2和NR0b1兩者的相互作用也可以調(diào)控性類固醇急性調(diào)節(jié)基因()、3β-羥類固醇脫氫酶基因()等性激素合成途徑上游基因的表達(dá)[10-11]。但在魚(yú)類中, 關(guān)于NR5a2和NR0b1調(diào)控基因表達(dá)的報(bào)道還幾乎未見(jiàn)到。

牙鲆()是中國(guó)、日本和韓國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)種, 其雌性個(gè)體生長(zhǎng)速度大于雄性個(gè)體[12], 因此, 研究牙鲆性別決定和性腺分化機(jī)制, 從而控制其性別具有很重要的實(shí)踐價(jià)值。牙鲆性別由遺傳和環(huán)境因素共同決定[13]: 在性腺分化期, 高溫或外源睪酮處理牙鲆可使其發(fā)育為雄性個(gè)體, 而雌二醇處理可使其發(fā)育為雌性個(gè)體[12, 14]。及其轉(zhuǎn)錄因子Foxl2、Dmrt1和Sox9等參與性激素合成途徑的下游激素的合成或調(diào)控, 進(jìn)而影響牙鲆性腺分化[15-17]?；蛟贓2合成途徑中是不可或缺的, 但在牙鲆中尚未見(jiàn)到關(guān)于該基因的報(bào)道。作者通過(guò)牙鲆性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得并驗(yàn)證的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列, 擬分析其在雌雄成體組織和性腺分化期性腺中的表達(dá)以及在cAMP孵育和過(guò)表達(dá)NR5a2或NR0b1的精巢原代細(xì)胞中的表達(dá), 為進(jìn)一步豐富對(duì)牙鲆性腺分化和發(fā)育分子生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

成體牙鲆(全長(zhǎng)300 mm ± 20 mm)購(gòu)于山東省青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng), 暫養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓的3 m3充氣海水魚(yú)缸內(nèi), 暫養(yǎng)時(shí)間約30 d, 每天投喂2次商用適口餌料, 并換水2次。分別取3條雄魚(yú)和3條雌魚(yú)的性腺(精巢、卵巢)、腦、心臟、鰓、肝臟、腎、頭腎、脾、肌肉、胃、腸、眼等12種組織, 一部分置于加有200 μL Trizol的1.5 mL離心管中, 凍存于液氮, 以備RNA提取。另一部分性腺樣品固定于多聚甲醛中用于切片、蘇木精-伊紅(HE)染色以及鏡檢鑒定其性別和發(fā)育時(shí)期[18]。

雌核發(fā)育牙鲆幼魚(yú)(遺傳型為雌性)參照本實(shí)驗(yàn)室已建立的誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)和培育獲得[19]。設(shè)置對(duì)照組、28℃(HT組)、雌二醇(E2組)和睪酮(T組)處理實(shí)驗(yàn)組, 隨機(jī)挑選全長(zhǎng)12~15 mm的250尾雌核發(fā)育幼魚(yú)分別飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的90 L塑料缸中, 每組2個(gè)重復(fù), 整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間約120 d。每天換水2~3次, 光周期維持在14L: 10D。對(duì)照組、T組和E2組養(yǎng)殖溫度為20~22℃; HT組的海水溫度用加熱棒控制, 且由18℃緩慢上升到28℃, 每天升高2℃, 最終維持在28℃± 0.5℃[20]。HT組和對(duì)照組投喂普通餌料; T組和E2組采用投喂餌料方式進(jìn)行外源性激素處理, 幼魚(yú)每天分別投喂含有5×10–6mg/kg T或E2(Sigma, 美國(guó))的餌料2~6次[18, 21]。T和E2分別溶解在無(wú)水乙醇中, 均勻噴灑于餌料上, 黑暗條件下風(fēng)干。所有處理的持續(xù)時(shí)期是從幼魚(yú)全長(zhǎng)15 mm到120 mm, 之后進(jìn)行常規(guī)培育。分別在幼魚(yú)全長(zhǎng)30、40、60、80、110 mm時(shí), 每組隨機(jī)選取10尾幼魚(yú), 立即冷凍于液氮。然后取其性腺, 并每5尾幼魚(yú)的樣品混樣進(jìn)行RNA提取。每組各取全長(zhǎng)150 mm左右的牙鲆20尾, 通過(guò)性腺的形態(tài)觀察和冷凍切片與HE染色進(jìn)行性別鑒定。

1.2 總RNA提取及模板cDNA的合成

用Trizol(Ambion, 美國(guó))法提取牙鲆成魚(yú)組織和各實(shí)驗(yàn)組魚(yú)苗性腺樣品的總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000(Thermo, 美國(guó))分別檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript?one-step gDNA removal and cDNA synthesis superMix Kit(全式金, 北京)操作步驟將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成模板cDNA。

1.3 17β-HSD1基因ORF序列的驗(yàn)證

在牙鲆性腺轉(zhuǎn)錄組中, 經(jīng)NCBI在線比對(duì)篩選獲得含基因ORF在內(nèi)的1312bp cDNA序列。用Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增873bp ORF的引物-oF: 5′-ATGGACAAGAGGGTGGTGCT G-3′和-oR: 5′-TTAGTTTTCCTCGGCTGA GAA-3′, 對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。RT-PCR 25 μL反應(yīng)體系(含1 μL模板, 10 μmol/L)參考2×Pfu MasterMix(康為世紀(jì), 北京)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制, 其反應(yīng)條件如下: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化, 并經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR檢測(cè), 將陽(yáng)性克隆菌液送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線比對(duì)進(jìn)行確定。

1.4 多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)cDNA序列, 用BioEdit翻譯基因的氨基酸序列, 用DNAman軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì), 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)采用軟件BioEdit和MEGA5.1的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)結(jié)合GenBank 上各物種的該基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)聚類分析而完成的。各物種17β-HSD1氨基酸序列的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)序列號(hào)如下: 斑馬魚(yú)(NM_205584)、尼羅羅非魚(yú)(NM_ 001279795)、青鳉(, XM_004071297)、日本鰻鱺(, AY498620)、鯰魚(yú)(KM034751)、小鼠(NM_010475)、大鼠(, NM_ 012851)、牛(, NM_001102365)和人(, NM_000413)。

1.5 半定量RT-PCR

通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)了基因在牙鲆雌雄個(gè)體12種組織中的表達(dá)。用Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)用于組織表達(dá)分析的引物序列-qF: 5′-TGAGGCAGATTCTTGAGGTC-3′和-qR: 5′-TTTCGGAAAACAGAGTCGC- 3′。以牙鲆作為內(nèi)參基因, 其引物序列-qF: 5′-ACTACCTCATGAAGATCCTG-3′和-qR: 5′-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3′。RT-PCR 20 μL反應(yīng)體系(含1 μL模板, 10 μmol/L)參考2× GoldStar MasterMix(康為世紀(jì), 北京)操作說(shuō)明書(shū)配制, 其反應(yīng)條件如下: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 30個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR(qPCR)

通過(guò)qPCR方法檢測(cè)了在牙鲆性腺分化期性腺組織中的表達(dá)。根據(jù)ORF序列用Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)定量分析引物qRT--F: 5′-CTCTTGGGCACCATCCAGAC CA-3′和qRT--R: 5′-TCTCTTCAACAGGTC GATACC-3′。以牙鲆作為內(nèi)參基因[22], 其引物序列qRT--F: 5′-GGAATCCACGAGACCAC CTACA-3′和qRT--R: 5′-CTGCTTGCTGATCC ACATCTGC-3′。qPCR 20 μL反應(yīng)體系(含0.5 μL模板, 10μmol/L)參考TransStart?Top Green qPCR SuperMix(全式金, 北京)操作說(shuō)明書(shū)配制, 其反應(yīng)條件如下: 94℃預(yù)變性30 s; 94℃變性5 s, 55℃退火20 s, 72℃延伸20 s, 40個(gè)循環(huán)。用Applied Biosystems QuantStudio 6熒光定量PCR儀(Life technologies)進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。基因的相對(duì)表達(dá)量用2–ΔΔCt方法計(jì)算分析。數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPSS軟件(IBM SPSS, Armonk, New York)中的單因素方差分析Dunnett’s檢驗(yàn)來(lái)對(duì)組內(nèi)基因表達(dá)的顯著性進(jìn)行分析(<0.05)。

1.7 cAMP孵育精巢原代細(xì)胞

利用體外培養(yǎng)的牙鲆精巢原代細(xì)胞, 進(jìn)行了cAMP(索萊寶, 北京)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控研究。按照本實(shí)驗(yàn)室已有的方法進(jìn)行牙鲆精巢組織的分離和細(xì)胞培養(yǎng)[23], 待精巢原代細(xì)胞數(shù)目達(dá)到2.6 × 105時(shí), 用胰酶消化液消化, 混勻, 等體積地鋪到6孔板(NEST, 中國(guó))中, 設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞長(zhǎng)到90%時(shí), 分別用含0、75、150和300 μmol/L cAMP[24]的完全培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行孵育。72 h后, 收集精巢細(xì)胞用于RNA提取, 通過(guò)qPCR檢測(cè)的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。RNA提取方法同1.2, qPCR所需引物和反應(yīng)條件以及數(shù)據(jù)分析同1.6。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在1.7中培養(yǎng)的牙鲆精巢原代細(xì)胞同樣用于分析轉(zhuǎn)錄因子NR5a2和NR0b1對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-或pcDNA3.1-的構(gòu)建方法參考已有研究[25]。待6孔板的細(xì)胞密度達(dá)到90%以上, 根據(jù)Lipofectamine 2000(Life, 美國(guó))轉(zhuǎn)染試劑的操作方法, 將0、1、2、3 μg pcDNA3.1-或pcDNA3.1-表達(dá)質(zhì)粒分別進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染, 48h后, 收集細(xì)胞用于RNA提取, 通過(guò)qPCR檢測(cè)的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。RNA提取方法同1.2, qPCR所需引物和反應(yīng)條件以及數(shù)據(jù)分析同1.6。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆17β-HSD1蛋白分子序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的cDNA序列, 對(duì)其ORF區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證, 其ORF為873bp, 編碼290個(gè)氨基酸。將其氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他脊椎動(dòng)物同源基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。多序列比對(duì)結(jié)果顯示牙鲆17β-HSD1氨基酸序列與其他物種的同源序列相似度均達(dá)到83%以上(圖1), 進(jìn)化樹(shù)也顯示了該基因與尼羅羅非魚(yú)和青鳉的同源基因聚為一簇(圖2)。

2.2 17β-HSD1在牙鲆雌雄個(gè)體不同組織的差異表達(dá)

牙鲆在雌雄成魚(yú)12種組織中的表達(dá)如圖3所示。由圖3可知在精巢、卵巢都有表達(dá), 但呈現(xiàn)雌雄二態(tài)性, 卵巢表達(dá)量比精巢高。該基因也在雌性個(gè)體的鰓、腎、頭腎、脾、胃和腸等組織中表達(dá), 但在雄性個(gè)體除了精巢外的其他組織中均沒(méi)有表達(dá)。

圖1 牙鲆與其他脊椎動(dòng)物的17β-HSD1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖2 脊椎動(dòng)物17β-HSD1氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析

數(shù)值為1 000次迭加后分枝的可信度, 分枝的長(zhǎng)度代表氨基酸的差異

Values of the tree represent bootstrap scores of 1000 trials and indicate the credibility of each branch; branch lengths are proportional to the number of amino acid changes

圖3 牙鲆17β-HSD1基因在雌雄個(gè)體各組織中表達(dá)譜

2.3 17β-HSD1在牙鲆性腺分化期的性腺組織中的表達(dá)

性別鑒定結(jié)果表明, 雌核發(fā)育對(duì)照組中雌性比率為75%, E2組雌性比率為100%, 而HT和T組雄性比率為100%。在對(duì)照組和各處理組中的差異表達(dá)如圖4所示。對(duì)照組中,在卵巢分化期的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。E2組中,在卵巢分化時(shí)(全長(zhǎng)30、40 mm)的表達(dá)維持穩(wěn)定, 而卵巢分化完成后(全長(zhǎng)>40mm)則呈上升趨勢(shì), 隨后呈下降趨勢(shì), 但在性腺分化完成后維持在較高水平。卵巢分化時(shí)該基因在E2組中的表達(dá)水平低于對(duì)照組, 但在卵巢分化完成后高于對(duì)照組。T組中,在精巢分化時(shí)(全長(zhǎng)60 mm)呈現(xiàn)高表達(dá), 但在分化前后卻都維持較低水平的表達(dá)。HT組中的表達(dá)與T組類似, 但整體水平要低于T組。

圖4 牙鲆17β-HSD1基因在性腺分化期的表達(dá)

Control. 對(duì)照組; HT. 高溫處理組; T. 睪酮處理組; E2. 雌二醇處理組。數(shù)據(jù)為3個(gè)樣品均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, 不同字母(a, b, c, d)表示各處理組內(nèi)不同時(shí)期之間的顯著性(<0.05)

Data are the mean ± S.E.M. of three independent samples. Different lowercase letters (a, b, c, d) indicate significant differences between pairs of groups (< 0.05). Control. control group; HT. high temperature treatment group; T. testosterone treatment group; E2. 17β-estradiol treatment group

2.4 信號(hào)分子cAMP對(duì)17β-HSD1基因表達(dá)的調(diào)控

在cAMP孵育的牙鲆精巢原代細(xì)胞表達(dá)水平見(jiàn)圖5, 不同濃度的cAMP均可以顯著抑制精巢原代細(xì)胞中的表達(dá)(< 0.05), 但隨著濃度的升高抑制效果減弱。

圖5 不同濃度的cAMP在牙鲆精巢原代細(xì)胞中對(duì)17β- HSD1基因表達(dá)的調(diào)控

對(duì)照組. 0 μmol/L cAMP; 數(shù)據(jù)為3個(gè)樣品均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; *.處理組與對(duì)照組相比較有顯著性(< 0.05)

Control. 0 μmol/L cAMP; Data are the mean ± S.E.M. of three inde-pendent samples; *. indicates the significant difference (< 0.05)

2.5 轉(zhuǎn)錄因子NR5a2和NR0b1對(duì)17β- HSD1基因的調(diào)控作用

在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子NR5a2和NR0b1的牙鲆精巢原代細(xì)胞中的差異表達(dá)見(jiàn)圖6。細(xì)胞轉(zhuǎn)染低濃度(1 g)pcDNA3.1-質(zhì)粒對(duì)精巢原代細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)作用, 而較高濃度(2和3μg)pcDNA3.1-質(zhì)粒可以顯著抑制其表達(dá), 且隨著濃度的升高抑制效果增強(qiáng)(圖6 A)(< 0.05)。轉(zhuǎn)染低濃度(1μg)pcDNA3.1-質(zhì)?？娠@著抑制精巢原代細(xì)胞中的表達(dá), 而較高濃度(2 μg) pcDNA3.1-質(zhì)?？娠@著上調(diào)基因表達(dá)(圖6 B)(< 0.05)。

圖6 轉(zhuǎn)錄因子NR5a2 (A)和NR0b1 (B)在牙鲆精巢原代細(xì)胞中對(duì)17β-HSD1基因表達(dá)的調(diào)控

對(duì)照組. 0 μg pcDNA3.1-or pcDNA3.1-質(zhì)粒; 數(shù)據(jù)為3樣品均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; *. 處理組與對(duì)照組相比較有顯著性(<0.05)

Control. 0 μg pcDNA3.1-or pcDNA3.1-plasmid; Data are the mean ± S.E.M. of three independent samples; *. indicates the significant difference (< 0.05)

3 討論

牙鲆基因與其他硬骨魚(yú)類的同源基因有很高的相似性, 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明其氨基酸序列與尼羅羅非魚(yú)和青鳉聚為一簇, 進(jìn)一步驗(yàn)證了從牙鲆中克隆的序列是。半定量RT-PCR結(jié)果顯示, 牙鲆主要在卵巢中表達(dá), 在精巢中表達(dá)較弱, 與斑馬魚(yú)和鯰魚(yú)的結(jié)果類似[1, 6]。因?yàn)橹饕饔檬菍l轉(zhuǎn)化為發(fā)揮功能的E2[1], 故牙鲆在成體性腺中表達(dá), 可能參與其中性類固醇激素的合成。該基因也在牙鲆雌性個(gè)體的鰓、頭腎、腎、脾、胃和腸中表達(dá), 在雌魚(yú)鰓中的表達(dá)量相對(duì)較高, 這是因?yàn)樵谟补囚~(yú)類的鰓中也能合成11-酮基睪酮所致[26]。至于雌魚(yú)其他幾種組織中也表達(dá), 是因?yàn)檫@些組織中也有11-酮基睪酮或者E2合成, 還是該基因可能參與其他代謝途徑激素合成尚不得而知。有意思的是, 該基因在牙鲆雄魚(yú)除精巢以外的組織均不表達(dá), 在其他魚(yú)類中還未見(jiàn)到類似的報(bào)道, 其緣由仍需進(jìn)一步研究。

性激素在硬骨魚(yú)類性腺分化和配子發(fā)育中起重要作用[27], 而性激素合成是在類固醇激素合成酶的催化作用下完成的。17β-HSDs是一類重要類固醇激素合成酶, 主要參與E2和T的合成[28],則是17β-HSDs家族成員之一。報(bào)道顯示, 尼羅羅非魚(yú)不參與早期性腺分化性類固醇激素的合成, 但在配子發(fā)生中的作用是必需的[5]。而在鯰魚(yú)中, 該基因卻在性腺分化期的早期表達(dá), 顯示早期性腺分化和發(fā)育中該合成酶也起一定作用[1]。雌核發(fā)育牙鲆在遺傳學(xué)上的性別是雌性的, 其性別表型形成會(huì)受到性腺發(fā)育期的外源因素如水溫和性激素的影響, 高溫和外源雄激素處理可以產(chǎn)生雄性表型, 而外源雌激素處理則可以產(chǎn)生雌性表型, 故是研究魚(yú)類性腺分化的理想材料之一[20]。本研究對(duì)照組中, 牙鲆在分化前的性腺表達(dá)量相對(duì)較高, 說(shuō)明該基因可能在卵巢分化前起作用。E2組,的表達(dá)量在卵巢分化完成后顯著升高, 且最后維持較高水平, 提示該基因可能參與其后卵巢的發(fā)育。HT組,的表達(dá)在精巢分化時(shí)顯著上調(diào), 暗示該基因可能參與精巢的分化; 精巢分化完成后該基因表達(dá)量下調(diào), 推測(cè)它可能不參與精巢后期的發(fā)育過(guò)程。該基因在T組表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與HT組非常類似, 在精巢分化期均有高表達(dá), 進(jìn)一步表明該基因參與精巢的分化。但HT組的表達(dá)水平比T組較低, 其原因還不得而知。性腺分化完成后在E2組的表達(dá)水平較對(duì)照組的高, 作者推測(cè)E2可能通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸上調(diào)該基因的表達(dá), 但還需進(jìn)一步研究。

促性腺激素可以通過(guò)cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑磷酸化相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控性類固醇激素合成相關(guān)基因如、和等的表達(dá)[29-32]。但關(guān)于cAMP和轉(zhuǎn)錄因子等對(duì)表達(dá)調(diào)控的報(bào)道還很少。為探究此調(diào)控作用, 作者用cAMP孵育牙鲆精巢原代細(xì)胞, 結(jié)果顯示cAMP可以顯著抑制的表達(dá), 作用效果存在劑量效應(yīng)。聯(lián)丁?；鵦AMP可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[24], 直接影響該基因啟動(dòng)子區(qū)TATA框結(jié)合位點(diǎn)來(lái)抑制該基因表達(dá)。cAMP對(duì)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制很復(fù)雜, 仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。NR5a2和NR0b1是類固醇激素合成中重要的轉(zhuǎn)錄因子[32], 調(diào)控較多的類固醇激素合成酶基因的表達(dá)。人的NR5a2可以調(diào)控類固醇激素合成酶基因的表達(dá)[31], 高濃度NR5a2可能與啟動(dòng)子區(qū)作用位點(diǎn)結(jié)合來(lái)抑制其在精巢原代細(xì)胞中的表達(dá)。在小鼠中, NR0b1抑制的表達(dá), 從而降低雌二醇的產(chǎn)生[9]。本研究中, NR0b1在牙鲆精巢原代細(xì)胞中也能調(diào)控的表達(dá)來(lái)參與雌二醇的合成, 且是劑量依賴性的調(diào)控。

綜上所述,基因主要在牙鲆卵巢和精巢中表達(dá), 且在精巢分化和卵巢分化前期表達(dá)上調(diào)對(duì)性腺分化有一定作用?；蛟诰苍?xì)胞的表達(dá)受到信號(hào)分子cAMP和轉(zhuǎn)錄因子NR5a2和NR0b1的調(diào)控。由此可以推測(cè)基因在牙鲆性腺分化和發(fā)育的性類固醇激素合成中起重要的作用。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Molecular characterization, expression, and regulation ofin the olive flounder

LIANG Dong-dong1, 2, 3, FAN Zhao-fei1, 2, 3, ZOU Yu-xia1, 2, TAN Xun-gang1, 2, WU Zhi-hao1, 2, JIAO Shuang1, 2, LI Jun1, 2, YOU Feng1, 2

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China. 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China. 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

17β-Hydroxysteroid dehydrogenase 1 (17β-HSD1) is an important enzyme as it is involved in the synthesis of both 17β-estradiol and testosterone. In this study,open reading frame sequence was obtained from the olive floundergonadal transcriptome data and verified. Phylogenetic tree analysis showed that flounder 17β-HSD1 was clustered with 17β-HSD1 proteins from fish species such asand. Semiquantitative RT-PCR results indicated the expression of 17β-HSD1 in the ovary was higher than that in the testis, and it was also expressed in the female gill, head kidney, kidney, spleen, stomach, and intestine. Real-time quantitative PCR analysis revealed upregulated expression patterns ofduring the key phases of ovarian and testicular differentiation.expression was significantly downregulated in the cultured primary testis cells treated with 75, 150, and 300 μmol/L cAMP (< 0.05). Moreover, transfecting the cultured primary testis cells with 2 and 3 μg NR5a2 and 1 μg NR0b1 significantly downregulated its expression, whereas it was significantly upregulated upon treatment with 2 μg NR0b1 (< 0.05), and all these regulations were dose-dependent. This study indicates thatis involved in flounder gonadal differentiation, and its expression is respectively regulated by cAMP, NR5a2, and NR0b1. These results may provide useful information for the study of fish gonadal differentiation.

;; ORF clone; expression; regulation

Mar. 3, 2017

梁冬冬(1990-), 男, 山東聊城人, 碩士研究生, 主要從事海水魚(yú)類分子細(xì)胞生物學(xué)研究, E-mail: 867171624@qq.com; 尤鋒,

, 研究員, E-mail: youfeng@qdio.ac.cn

Q75

A

1000-3096(2017)09-0065-09

10.11759//hykx 20170303001

2017-03-03;

2017-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41276171、31502156); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASKJ02); 鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系課題(NYCYTX-50-G03); 國(guó)家水產(chǎn)種質(zhì)資源共享服務(wù)平臺(tái)(2017DKA30470)

[National Natural Science Foundation of China, No. 41276171, 31502156; Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, No. 2015ASKJ02; The National Flatfish Industry System Construction Programme, No. NYCYTX-50-G03; The National Infrastructure of Fishery Germplasm Resource , No.2017DKA30470]