左乙拉西坦治療癲癇模型大鼠癇性發(fā)作的療效及可能機制

周艷輝 劉春苗 林 珍 王 琦 余 丹

(?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 ?？?570208)

左乙拉西坦治療癲癇模型大鼠癇性發(fā)作的療效及可能機制

周艷輝 劉春苗 林 珍1王 琦1余 丹

(?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 ?？?570208)

目的 探討左乙拉西坦治療癲癇模型大鼠癇性發(fā)作的療效及作用機制。方法 將40只健康成年的Wistar大鼠按性別體重均衡隨機分為空白對照組，模型組，甘珀酸組和左乙拉西坦組，每組10只。除空白對照組外，其余每組大鼠采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇大鼠模型，造模前甘珀酸組大鼠提前30 min給予甘珀酸20 mg/kg腹腔注射，左乙拉西坦組提前60 min給予左乙拉西坦0.3 g/kg灌胃，模型組大鼠給予等量的生理鹽水。造模成功后持續(xù)監(jiān)測腦電圖，觀察并記錄各組大鼠首次癇性發(fā)作的時間以及造模后2、12、24 h發(fā)作時的行為表現(xiàn)次數(shù)，觀察結(jié)束后取斷頭取腦，應(yīng)用RT-PCR和Western印跡檢測海馬組織縫隙連接蛋白(Cx)43 mRNA和Cx43蛋白表達的變化。結(jié)果 與模型組比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠腦電壓均顯著下降(P<0.01)；甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠腦電頻率A和B均呈遞增趨勢，其中甘珀酸組大鼠腦電頻率A和左乙拉西坦組大鼠腦電頻率B變化顯著(P<0.05)；與模型組比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期均明顯延長(P<0.01)，且隨著時間點的后延，各組大鼠癇性發(fā)作次數(shù)均逐漸減少，但與模型組比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組減少均顯著(P<0.05或P<0.01)。與空白對照組大鼠比較，其余各組大鼠海馬組織Cx43蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠海馬組織Cx43蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。與空白對照組大鼠比較，其余各組大鼠海馬組織Cx43 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組大鼠比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠海馬組織Cx43 mRNA表達水平均顯著下降(P<0.01)。結(jié)論 左乙拉西坦能有效控制癲癇大鼠的癇性發(fā)作，其機制可能與抑制大鼠海馬組織Cx43的表達有關(guān)。

左乙拉西坦；癲癇；海馬組織

癲癇是人體的大腦神經(jīng)元因突發(fā)性異常放電而導(dǎo)致的大腦功能短暫性障礙，屬慢性疾病，是人體發(fā)作性意識喪失的常見原因之一。部分癲癇患者伴有一定程度的認知功能障礙，但具體病因目前尚不清楚〔1〕。該病的治療臨床上主要以西藥為主，但傳統(tǒng)的抗癲癇藥物副作用較大，本身易致患者出現(xiàn)認知功能損害〔2〕。甘珀酸具有廣泛的縫隙連接阻斷功能，是一種已知的有效抗癲癇藥物；左乙拉西坦(LEV)屬于吡咯烷酮類的新型抗癲癇藥物。國內(nèi)外研究表明，本品具有廣譜、起效迅速、改善患者認知功能等特點，其作用不通過阻斷離子通道或調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)而實現(xiàn)，但具體作用機制尚不明確〔3〕。本文通過動物實驗進一步觀察LEV對癲癇大鼠癇性發(fā)作的療效，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar大鼠，SPF級，雌雄兼用，體重180～220 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，質(zhì)量合格證編號：SCXK(陜)2015-0001-0001467；SPF級飼料(購于北京維通利華實驗動物技術(shù)公司)喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進行相關(guān)實驗，實驗場所：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

1.2 試劑與藥品 氯化鋰-匹羅卡品及甘珀酸，購于美國sigma-aldrich公司；二喹啉甲酸，購于比利時UCB Pharma S.A.公司。異氰硫酸熒光素(FITC)標(biāo)記兔抗大鼠縫隙連接蛋白(Cx)43多克隆抗體，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)，PCR試劑盒、RT-PCR試劑盒(Qiagen公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司)。

1.3 主要儀器 ME-175E-W腦電圖機(日本光電公司)，NT9216型腦電分析系統(tǒng)(北京新拓儀器研究所)。

1.4 實驗分組及癲癇大鼠模型制備 將40只健康成年的Wistar大鼠按性別、體重均衡隨機分為空白對照組，模型組，甘珀酸組和LEV組，每組10只。參照文獻〔4〕并結(jié)合預(yù)實驗，除空白對照組外(在各給藥時間點給予等量的生理鹽水)，其余各組大鼠先給予腹腔注射氯化鋰120 mg/kg，間隔18～20 h后給予東莨菪堿1.5 mg/kg腹腔注射，30 min后再給予匹羅卡品80 mg/kg腹腔注射。在腹腔注射匹羅卡品前模型組不做特殊處理，甘珀酸組大鼠提前30 min給予腹腔注射甘珀酸20 mg/kg，LEV組大鼠提前60 min給予灌胃LEV 0.3 g/kg。模型成功與否的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Racine分級〔5〕，如果出現(xiàn)Ⅲ級及以上發(fā)作，即可視為模型成功；未達到Ⅲ級大鼠繼續(xù)注射氯化鋰-匹羅卡品直至次數(shù)達到5次，5次后仍未達到標(biāo)準(zhǔn)的，視為造模不成功〔6〕，其中0級為無癲癇發(fā)作；Ⅰ級為面部陣攣、閉眼、須動、哈欠；Ⅱ級為在Ⅰ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性點頭、頸部肌肉抽動；Ⅲ級為在Ⅱ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢或后肢單側(cè)肢體抽動；Ⅳ級為在Ⅲ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)多肢抽動、痙攣并伴后肢站立；Ⅴ級為在Ⅳ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)全面性強直陣攣發(fā)作或跌倒。出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)并持續(xù)發(fā)作1 h，給予地西泮腹腔注射止痙(10 mg/kg)。造模后各組大鼠均符合癲癇模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)，造模成功。部分大鼠有追加注射氯化鋰-匹羅卡品，各組追加動物數(shù)及追加次數(shù)：模型組2只大鼠分別追加1次和2次，甘珀酸組3只大鼠各追加1次，LEV組2只大鼠各追加2次。

1.5 檢測方法及觀察指標(biāo)

1.5.1 腦電圖及行為學(xué)觀察〔7〕觀察并記錄各組大鼠首次癇性發(fā)作的時間，造模后2、12、24 h發(fā)作時的行為表現(xiàn)次數(shù)；同時，各組大鼠于造模成功后70 min開始監(jiān)測清醒狀態(tài)下10 min內(nèi)的腦電圖情況。測定前將大鼠固定在固定器(自制)中，以單極導(dǎo)聯(lián)法在腦中線區(qū)兩耳之間(頂中線區(qū)和Pz區(qū))插入一針電極至皮層下，連接F3導(dǎo)電極線，左耳電極夾在左耳上，大鼠尾部以針電極接地。定標(biāo)：50 μV/5 mm，時間常數(shù)：0.3 s，走紙速度：30 mm/s，濾波：30 Hz，增益：×1.0。腦電圖監(jiān)測采用NT9216型腦電分析系統(tǒng)中的平均參數(shù)功能，采用電壓高低反映波幅的大小，以頻率A分析δ、θ、α波，以頻率B分析β波。

1.5.2 Western印跡法檢測大鼠海馬組織Cx43表達〔8〕觀察24 h后將大鼠斷頭開顱取腦(在冰袋上進行)，稱取海馬組織100 mg，放入加有10 ml蛋白酶抑制劑的1 000 ml蛋白裂解液中低溫4℃下充分勻漿，高速離心后可得胞膜蛋白及胞質(zhì)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用BCA法測算Cx43蛋白濃度。變性后取100 mg進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，分離后取蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含有5%牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉30 min，然后用含有1%BSA的PBS液按照1∶500比例稀釋兔抗Cx43，4℃孵育過夜。羊抗兔IgG(1∶500)與ABC復(fù)合物在室溫下反應(yīng)1 h，然后用Vigor-12C圖像掃描儀測灰度值。

1.5.3 RT-PCR法檢測大鼠海馬組織Cx43 mRNA表達〔9〕所有的操作均按照試劑盒說明的步驟進行，先稱取4 mg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；取2 μl cDNA配成25 μl體系進行PCR擴增，反應(yīng)程序條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、30 s；72 ℃、10 min，4℃放置。PCR結(jié)束后每管加入6×上樣緩沖液4 ml，充分混勻，取5 ml PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果用Quantity one軟件分析灰度比值。Cx43上游引物：5'-TTA AGG AGA ACC-3'，下游引物：5'-CCC TCG TTG TTC-3'；β-actin上游引物：5'-GAA ATG ACC AT-3'，下游引物：5'-GCT TAA CAG GCC TA-3'。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 腦電圖及行為學(xué)觀察 通過監(jiān)測腦電圖可知，空白對照組大鼠腦電電壓在13～30 mV之間，腦電頻率由較少、基本無節(jié)律的α波、較多散發(fā)的β波和雜亂的θ波共同組成。與空白對照組比較，其余各組大鼠腦電電壓顯著升高(P<0.05)，腦電頻率A呈減慢趨勢(P<0.05)，腦電頻率B亦呈減慢趨勢(P<0.05)；與模型組比較，甘珀酸組和LEV組大鼠腦電電壓均顯著下降(P<0.01)，腦電頻率A和B均呈遞增趨勢，其中甘珀酸組大鼠腦電頻率A和LEV組大鼠腦電頻率B變化顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦電電壓、腦電頻率A、 腦電頻率B的比較

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2 各組癲癇發(fā)作潛伏期及行為表現(xiàn)次數(shù)比較 除空白對照組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)癲癇；與模型組比較，甘珀酸組和LEV組的大鼠癲癇發(fā)作潛伏期明顯延長(P<0.01)。發(fā)作后2、12、24 h，隨著時間點的后延，各組大鼠癇性發(fā)作次數(shù)均逐漸減少；與模型組比較，甘珀酸組和LEV組均顯著性減少(P<0.05或P<0.01)；與甘珀酸組比較，LEV組減少更顯著，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠癇性發(fā)作潛伏期、行為表現(xiàn)次數(shù)比較±s,n=10)

2.3 大鼠海馬組織Cx43 mRNA及蛋白表達 與空白對照組大鼠比較，其余各組大鼠海馬組織Cx43 mRNA蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組大鼠相比，甘珀酸組和LEV組大鼠海馬組織Cx43 mRNA及蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)，但兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織Cx43蛋白、 Cx43 mRNA表達情況

3 討 論

LEV屬于吡咯烷類衍生物，口服給藥具有不受食物影響，吸收迅速完全，生物利用度高，血漿蛋白結(jié)合率低，不經(jīng)過肝臟代謝直接以原型由腎臟排泄〔10〕。關(guān)于LEV抗癲癇的作用機制文獻報道較多，大量研究表明〔11〕，該藥與其他抗癲癇藥物作用機制不同，主要通過結(jié)合中樞神經(jīng)內(nèi)突觸囊泡蛋白(SV2A)調(diào)節(jié)突觸內(nèi)囊泡的胞外分泌功能和突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。有研究指出〔12〕，癲癇患者腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞Cx 43表達呈上調(diào)趨勢，且上調(diào)程度與致癇時間長短呈正相關(guān)。采用熒光標(biāo)記的膠原纖維酸性蛋白(GFAP)及采用抗體標(biāo)記的健康人海馬組織研究表明，癲癇患者星形膠質(zhì)細胞耦聯(lián)的損害呈擴大趨勢，星形膠質(zhì)細胞表達增加，表明星形膠質(zhì)細胞的上調(diào)會加重全面性癲癇發(fā)作〔13〕；而海人酸所致癲癇模型大鼠的大腦皮質(zhì)與海馬均呈陽性，并與致癇時間呈顯著正相關(guān)，由此可知，星形膠質(zhì)細胞參與了癲癇的發(fā)生及發(fā)展過程。也有學(xué)者提出，LEV抗癲癇作用機制可能與GABA受體敏感性有關(guān)；LEV可以通過有效阻斷電壓依賴性鈉離子通道，降低癲癇樣放電產(chǎn)生的電位數(shù)目，縮短放電持續(xù)時間，對鈣離子通道有輕微的阻滯作用〔14〕。

有研究表明，甘珀酸能夠通過阻斷縫隙連接的電擴布網(wǎng)絡(luò)而治療癲癇。甘珀酸通過直接與Cx結(jié)合，使之結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而使通道關(guān)閉，對Cx產(chǎn)生阻斷作用。藥理學(xué)研究表明，甘珀酸可縮短癲癇大鼠癇性發(fā)作的持續(xù)時間，降低癇性放電幅度，具有較明確的抗癲癇作用。本研究選用甘珀酸干預(yù)癲癇大鼠有效，與上述結(jié)果相一致〔15〕。

本研究結(jié)果表明LEV能顯著降低癲癇大鼠腦電電壓、增加腦電頻率、延長癇性發(fā)作潛伏期、減少癇性發(fā)作次數(shù)、抑制海馬組織Cx43蛋白和mRNA表達，提示LEV對癲癇大鼠癇性發(fā)作有良好的預(yù)防和控制作用。因Cx43是神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞間的主要縫隙連接蛋白之一，其表達增多可造成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞間電耦聯(lián)活動增強進而誘發(fā)癲癇，故推測LEV控制癲癇機制可能與降低海馬組織Cx43蛋白和mRNA表達水平有關(guān)。

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〔2016-02-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

周艷輝(1980-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病臨床研究。

R749

A

1005-9202(2017)04-0836-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.022

1 ?？谑腥嗣襻t(yī)院老年病科