運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷致細(xì)胞凋亡的機(jī)制

韋雪亮 黃 玲 岑人軍

(廣西大學(xué)體育學(xué)院體育訓(xùn)練系，廣西 桂林 530004)

運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷致細(xì)胞凋亡的機(jī)制

韋雪亮 黃 玲1岑人軍

(廣西大學(xué)體育學(xué)院體育訓(xùn)練系，廣西 桂林 530004)

目的 探討運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法 選取健康8周齡雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組和力竭運(yùn)動(dòng)組，每組20只。采用一次力竭性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。力竭運(yùn)動(dòng)后24 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC雙染法檢測(cè)細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸測(cè)定骨骼肌細(xì)胞凋亡率。應(yīng)用Western印跡技術(shù)測(cè)定骨骼肌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達(dá)水平。結(jié)果 力竭運(yùn)動(dòng)后24 h，力竭運(yùn)動(dòng)組與安靜對(duì)照組比較，骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.01)，Bax表達(dá)水平升高(P<0.01)。結(jié)論 力竭運(yùn)動(dòng)可以引起骨骼肌細(xì)胞損傷發(fā)生細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為下調(diào)Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

力竭運(yùn)動(dòng)；骨骼??；凋亡；Bcl-2；Bax

力竭運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致骨骼肌的損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)這種損傷不僅表現(xiàn)為機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡、影響骨骼肌正常功能，還可使骨骼肌細(xì)胞凋亡增加〔1〕。但關(guān)于運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷后細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究較少?；诖耍菊n題通過(guò)觀察一次力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2及Bax表達(dá)的影響，探討運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選取健康8周齡雄性SD大鼠40只，平均體重(200±20)g。給大鼠編號(hào)，按照數(shù)字表隨機(jī)分為安靜對(duì)照組和力竭運(yùn)動(dòng)組，每組20只。各組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度20℃～25℃，濕度45%±5%，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，自然晝夜節(jié)律變化光照。

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)前3 d對(duì)全部大鼠進(jìn)行預(yù)適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練，參數(shù)：坡度0°，速度10 m/min，時(shí)間10 min。正式實(shí)驗(yàn)采用一次力竭性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，參數(shù)：坡度-16°，速度16 m/min，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間200 min(中間5 min休息)。在運(yùn)動(dòng)初始，大鼠行為無(wú)異常，跑步速度均勻，步態(tài)穩(wěn)定；隨著時(shí)間推移開(kāi)始出現(xiàn)不能持續(xù)運(yùn)動(dòng)，四肢沉重?zé)o力，漸漸不能支撐軀體，腹部接近跑臺(tái)。當(dāng)運(yùn)動(dòng)至200 min時(shí)，大鼠腹部皮毛濕潤(rùn)，四足腫脹，呼吸不均，精神呆滯，反應(yīng)變慢，基本無(wú)逃避反應(yīng)。此時(shí)，根據(jù)大鼠力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)確定大鼠已經(jīng)力竭。

1.3 標(biāo)本的取材處理與觀察指標(biāo)

1.3.1 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染技術(shù)測(cè)定大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡率 力竭運(yùn)動(dòng)后24 h，選取相應(yīng)組別大鼠，腹腔麻醉，分離、切除肱三頭肌，小心修剪，剔除筋膜、血管、神經(jīng)、脂肪等組織，然后將骨骼肌剪碎，通過(guò)不銹鋼網(wǎng)(100目)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加入RPMI1640培養(yǎng)液，4℃靜置5 min，收集上清液，4℃、3 500 r/min、10 min 離心，棄上清，加入細(xì)胞裂解液3 ml，吹打混勻，再次4℃、3 500 r/min、10 min 離心，再次用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，然后用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，最終制成的骨骼肌單細(xì)胞混懸液濃度為5×105/ml。然后應(yīng)用碧云天AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸測(cè)定骨骼肌細(xì)胞凋亡率。具體操作步驟按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果判斷：正常細(xì)胞Annexin V及PI均低染(Annexin V-，PI-)，分布在左下區(qū)；早期細(xì)胞凋亡Annexin V高染，PI低染(Annexin V+，PI-)，分布在右下區(qū)；晚期凋亡及壞死細(xì)胞Annexin V及PI均高染(Annexin V+，P+)，分布在右上區(qū)。

1.3.2 Western印跡技術(shù)測(cè)定骨骼肌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達(dá) 同樣方法取大鼠肱三頭肌標(biāo)本100 mg，在勻漿器中勻漿，加細(xì)胞裂解液后冰上裂解30 min，然后離心4℃、12 000 r/min、15 min，最后提取蛋白上清液，并進(jìn)行濃度測(cè)定。測(cè)定結(jié)束后，加上樣緩沖液，然后混勻，100℃沸水中變性3 min，最后在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。Western印跡檢測(cè)依照配制分離膠和基層膠，制膠板；加樣；電泳；轉(zhuǎn)膜；封閉，一抗過(guò)夜孵育，二抗孵育，曝光順序進(jìn)行。提取、變性、測(cè)定蛋白濃度按照碧云天Western及IP細(xì)胞裂解液說(shuō)明書進(jìn)行。配置分離膠的濃度為10%。加樣蛋白總量30 μg。電泳前半小時(shí)電壓為110 V，后1 h為75 V。轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h。一抗Bcl-2、Bax選擇CST公司。二抗選擇北京中杉金橋公司。曝光選擇康為高靈敏度發(fā)光劑，具體操作按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果采用gel-pro圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

力竭運(yùn)動(dòng)后24 h，力竭運(yùn)動(dòng)組與安靜對(duì)照組比較骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.01)，Bax表達(dá)水平升高(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、 Bax表達(dá)的影響(n=20)

與安靜對(duì)照組比較：1)P<0.01

圖1 力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達(dá)的影響

3 討 論

運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的概念是指在訓(xùn)練或者運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中，因局部骨骼肌過(guò)于用力或者負(fù)荷較大，超出了機(jī)體正常所能承受的范圍，同時(shí)運(yùn)動(dòng)后的肌肉未得到有效休息及恢復(fù)，從而導(dǎo)致骨骼肌組織發(fā)生損傷。運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷不但包括骨骼肌解剖組織超微結(jié)構(gòu)的異常，而且還可伴有分子、基因、蛋白水平的異常。雖然運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌損傷的機(jī)制目前尚不完全清楚，但可能機(jī)制包括：①機(jī)械損傷假說(shuō)；②自由基損傷學(xué)說(shuō)；③鈣離子超載學(xué)說(shuō)；④急性炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)等。過(guò)去一段時(shí)間研究也大多集中在上述學(xué)說(shuō)〔2～6〕。但近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌損傷還與骨骼肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。宋衛(wèi)紅等〔7〕對(duì)大鼠進(jìn)行重復(fù)3 d 的力竭離心運(yùn)動(dòng),然后采用TUNNEL法檢測(cè)大鼠肱三頭肌細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組,運(yùn)動(dòng)即刻凋亡指數(shù)開(kāi)始升高,24 h 達(dá)到峰值，48 h 凋亡指數(shù)有所下降。趙曉琴〔8〕實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)離心運(yùn)動(dòng)可以引起骨骼肌細(xì)胞凋亡。任文寧〔9〕實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡，并且對(duì)比目魚肌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)程度大于腓腸肌細(xì)胞凋亡。本研究表明一次力竭運(yùn)動(dòng)可以引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化死亡，是機(jī)體不可或缺的生命過(guò)程，是機(jī)體進(jìn)行正常新陳代謝的前提條件。機(jī)體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑除了最常見(jiàn)的線粒體途徑外，還包括死亡受體途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。研究最多的線粒體途徑是指當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)刺激后，使Bax亞族蛋白寡聚化進(jìn)入線粒體，線粒體釋放相應(yīng)化學(xué)物質(zhì)形成凋亡體，從而引起細(xì)胞凋亡。線粒體凋亡途徑的實(shí)現(xiàn)受多種基因調(diào)控，其中最重要的是Bcl-2家族。而Bcl-2家族最常見(jiàn)基因包括〔10〕：①抗細(xì)胞凋亡基因，以Bcl-2為代表，其又被稱為原癌基因。②促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，以Bax為代表，又被稱為抑癌基因。③Bcl-2同源基因，以Bik、Blk、Bad和Bid等為代表，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制除了與Bcl-2蛋白形成異源二聚體，進(jìn)而失去抑制細(xì)胞凋亡活性，還可單獨(dú)形成同源二聚體達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用〔11〕。Bcl-2/Bax異源二聚體在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，兩者比值決定了細(xì)胞凋亡與否：通常來(lái)說(shuō)比值升高可抑制細(xì)胞凋亡，而比值下降則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。鑒于此，本研究應(yīng)用Western印跡法測(cè)定力竭運(yùn)動(dòng)后24 h肱三頭肌組織中Bcl-2及Bax表達(dá)情況，表明一次力竭運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制可能為下調(diào)Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax表達(dá)。李惠翔等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)力竭訓(xùn)練大鼠骨骼肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平顯著下降，而Fas 蛋白表達(dá)水平增加，引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，造成骨骼肌損傷。王冬梅等〔13〕研究運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及相關(guān)凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax表達(dá)水平的影響，一次游泳力竭組大鼠骨骼肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度明顯增加(P<0.01)，Bcl-2基因表達(dá)顯著減少，Bax 基因表達(dá)顯著增加，Bcl-2/Bax 比值顯著減小(P<0.01)。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過(guò)改變線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放、調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達(dá)，調(diào)控骨骼肌細(xì)胞凋亡。劉寧寧等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)能優(yōu)化Bcl-2/Bax的比值，降低骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，有效減少衰老導(dǎo)致的骨骼肌過(guò)度凋亡。因此，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可得出力竭運(yùn)動(dòng)可以引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能為下調(diào)Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)可為制定適當(dāng)合理強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)方案提供科學(xué)依據(jù)，但本研究只是從線粒體途徑研究誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，下一步將從其他凋亡途徑進(jìn)一步探討力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

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〔2016-08-31修回〕

(編輯 袁左鳴)

韋雪亮(1978-)，男，講師，碩士，主要從事體育教學(xué)訓(xùn)練研究。

R685.4

A

1005-9202(2017)04-0829-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.019

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科