骨髓間充質干細胞局部移植對兔腹主動脈成形術后再狹窄和平滑肌細胞增殖的影響

王慶元 吳向軍 張曉燕 崔家玉

(濱州醫(yī)學院附屬濱州市人民醫(yī)院心內科，山東 濱州 256600)

骨髓間充質干細胞局部移植對兔腹主動脈成形術后再狹窄和平滑肌細胞增殖的影響

王慶元 吳向軍 張曉燕 崔家玉

(濱州醫(yī)學院附屬濱州市人民醫(yī)院心內科，山東 濱州 256600)

目的 探討兔腹主動脈血管成形術后，骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植對兔腹主動脈再狹窄和平滑肌細胞增殖的影響及機制。方法 將60只新西蘭大白兔隨機分為對照組、損傷組、移植組各20只。所有動物均穿刺股動脈，對照組不進行球囊擴張損傷腹主動脈，損傷組和移植組送入球囊擴張損傷腹主動脈，損傷組注射等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，移植組用經4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)熒光標記的BMSCs以1×107/kg的細胞數(shù)經血管注射到損傷血管的局部。術后4 w取腹主動脈行免疫組織化學染色檢測平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)、增殖細胞核抗原(PCNA)在血管內膜上的表達情況，測定PCNA陽性細胞核數(shù)量，計算PCNA增殖指數(shù)。HE染色行血管形態(tài)計量分析包括內膜中膜厚度、內膜中膜面積，衡量血管狹窄情況。結果 損傷組新生血管內膜層α-SM-actin表達明顯強于對照組(P<0.05)，移植組新生血管內膜α-SM-actin表達，與損傷組比較明顯增強(P<0.05)。對照組血管內膜無PCNA陽性表達，損傷組PCNA陽性細胞數(shù)較對照組明顯增多(P<0.05)。移植組PCNA陽性細胞數(shù)較損傷組明顯減少(P<0.05)。損傷組腹主動脈明顯狹窄，內膜厚度、內膜面積、中膜厚度、中膜面積、血管狹窄程度等指標明顯高于移植組和對照組(P<0.05)，移植組腹主動脈有所狹窄，但血管形態(tài)學指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 兔腹主動脈球囊損傷后導致血管平滑肌細胞增殖及動脈管腔狹窄。BMSCs血管局部移植可抑制血管平滑肌細胞的增殖，減輕動動脈粥樣硬化及狹窄程度。

骨髓間充質干細胞；腹主動脈；平滑肌細胞；增殖；再狹窄

血管再狹窄是冠狀動脈介入治療的主要和嚴重的并發(fā)癥，目前其發(fā)病機制尚不明確，研究表明，血管內膜損傷后，平滑肌細胞的遷移、增殖和細胞外基質的分泌是再狹窄發(fā)生的主要機制〔1〕。另外，炎性細胞的浸潤造成血管的炎癥反應，使血管內皮損傷、血管僵硬度增加、血管平滑肌細胞增殖在血管再狹窄過程中也起了十分重要的作用〔2〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一種來源于中胚層的多能干細胞，具有多項分化潛能，可向內皮細胞分化，參與損傷血管內膜的修復，在抑制血管平滑肌細胞增殖，減輕再狹窄過程中可能起到一定作用，但具體機制不明。本研究通過血管局部移植BMSCs，探討對兔腹主動脈再狹窄和平滑肌細胞增殖的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 健康8～12月齡新西蘭大白兔60只，雌雄不拘，體重2.5～3.50 kg，由山東大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。小鼠抗兔平滑肌肌動蛋白(2-Sm-actin)抗體購自美國Neomarker公司，小鼠抗兔增殖細胞核抗原(PCNA)購自美國Zymed公司，小鼠抗兔CD34、CD90抗體購自中杉金橋公司，4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)購自邁新生物技術開發(fā)有限公司，雙目光學顯微鏡、石蠟切片機(LX-75)及計算機圖像分析系統(tǒng)來自德國Leica公司。

1.2 動物分組損傷模型的建立 實驗動物隨機分為對照組、損傷組、移植組，每組20只。動物術前8 h禁食，不禁水，稱體重量。常規(guī)建立耳緣靜脈輸液通路，以3%戊巴比妥1 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉實驗動物，麻醉后動物背位固定于手術臺，雙側腹股溝區(qū)用10%硫化鈉脫毛。常規(guī)消毒鋪巾后，Seldinger技術穿刺股動脈并留置鞘管，經鞘管注入普通肝素200 U抗凝，沿鞘管送入球囊導管至主動脈弓處，肝素生理鹽水充盈球囊10～12 atm(1 atm =760 mmHg)，后自近心端緩慢回拉球囊，同時降低球囊內壓力，保持球囊回撤維持一定阻力，上述過程持續(xù)約1 min，每次球囊擴張持續(xù)時間約30 s，間隔20 s后回縮球囊后再次送入球囊導管，反復3次，撤出球囊導管，同時拔除動脈鞘管，壓迫止血15～20 min后，繃帶加壓包扎固定，4～6 h后解除繃帶包扎。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定、標記和移植 在無菌條件下通過骨髓穿刺兔股骨抽取骨髓液，將采集到的骨髓液離心后用10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，原代培養(yǎng)3 d后開始更換培養(yǎng)液，BMSCs增殖到90%時傳代，第3代BMSCs備用。取第3代BMSCs與用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD34、CD90抗體在37℃的培養(yǎng)箱中孵育30 min，用1%的多聚甲醛固定，行流式細胞儀檢測。移植前將DAPI加入細胞懸液中，同樣在37℃的培養(yǎng)箱中孵育30 min，將培養(yǎng)的BMSCs進行標記，放入PBS沖洗瓶中去除細胞表面非特異結合的DAPI。移植組從球囊導管交換導絲側孔按1×107/kg的細胞數(shù)將標記好的BMSCs注入損傷血管處，同時抽取1 ml生理鹽水將導管內的BMSCs沖入兔主動脈內，保留30 min后撤出球囊，損傷組注入等量的PBS液，對照組只進行股動脈穿刺和留置鞘管，不進行球囊損傷。

1.4 移植的BMSCs向血管內膜歸巢的檢測 術后1 w取材，熒光顯微鏡下觀察到血管內膜上有DAPI標記的BMSCs即為歸巢的BMSCs。

1.5 免疫組織化學檢測和組織形態(tài)學分析 術后4 w取材血管組織，行α-SM-actin和PCNA免疫組織化學染色。在石蠟切片血管環(huán)上，首先滴加小鼠抗兔PCNA，α-SM-actin(1∶200倍稀釋)，陰性對照滴加PBS緩沖液，4℃孵育過夜，再用山羊抗兔37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，觀察各組血管內膜PCNA，α-SM-actin表達情況。對石蠟切片進行HE染色，用計算機圖像處理系統(tǒng)測量內膜厚度(IT)、內膜面積(IA)、中膜厚度(MT)、中膜面積(MA)，計算血管狹窄程度。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗及t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)、鑒定及歸巢 流式細胞儀檢測結果提示BMSCs CD90的表達率為96.73%，CD34為0.21%。術后1 w，熒光顯微鏡下可觀察到細胞核呈藍色熒光的BMSCs 歸巢到受損傷的血管內膜處(圖1)。

圖1 BMSCs的歸巢

2.2 各組主動脈HE染色觀察結果 對照組血管壁厚度均一，腔面有單層內皮細胞，細胞呈紫藍色；血管內膜光滑，未見平滑肌細胞，中膜平滑肌細胞呈梭型，管腔無明顯狹窄。損傷組顯微鏡下于損傷處內膜可見大量平滑肌細胞增生，排列方向亂而不規(guī)則，增生內膜厚度極不均勻，腔面不規(guī)整，中膜明顯變厚，管腔明顯狹窄。移植組顯微鏡下亦可見新生內膜形成，內膜和中膜變厚，中膜可見平滑肌細胞增生，管腔亦變狹窄，平滑肌細胞有中膜遷移至內膜下，但平滑肌細胞增生及血管狹窄程度均明顯輕于損傷組。見圖2。

2.3 各組α-SM-actin免疫組織化學染色結果 光鏡下觀察對照組血管內膜則無α-SM-actin陽性表達，血管中膜可見α-SM-actin陽性表達增強，染色呈棕黃色。損傷組新生血管內膜層有α-SM-actin陽性強表達，明顯強于對照組〔(0.189±0.035)vs(0.011±0.003),P<0.05〕。移植組新生血管內膜中可見α-SM-actin陽性表達，與損傷組比較明顯增強〔(0.451±0.035)vs(0.189±0.035),P<0.05〕。見圖3。

2.4 各組間PCNA免疫組織化學染色及陽性細胞數(shù)比較 光鏡下觀察對照組血管內膜無PCNA陽性表達，損傷組新生血管內膜中可見PCNA陽性強表達，并向管腔面聚集，PCNA陽性細胞數(shù)較對照組明顯增多〔(21.40±3.75)個 vs(6.25±1.35)個,P<0.05〕。移植組血管內膜亦可見PCNA陽性表達，但PCNA陽性細胞數(shù)較損傷組明顯減少〔(11.32±3.15)個 vs(21.40±3.75)個,P<0.05〕。見圖4。

2.5 各組兔4 w后內膜中膜厚度面積及狹窄程度比較 見表1。損傷組IT、MT、IA、MA及狹窄程度均明顯高于對照組和移植組(均P<0.05)，移植組上述指標高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

圖2 各組兔腹主動脈染色結果(HE，×200)

圖3 各組兔腹主動脈α-SM-actin免疫組織 化學染色結果(DAB，×400)

圖4 各組兔腹主動脈PCNA免疫組織化學 染色結果(DAB，×400)

指標對照組損傷組移植組IT(mm)0.48±0.061.59±0.311)2)0.59±0.09MT(mm)1.56±0.172.38±0.521)2)1.79±0.27IA(mm2)1.01±0.134.39±1.131)2)1.23±0.46MA(mm2)2.75±0.776.74±1.461)2)3.12±1.17IT/MT(%)41.05±7.7772.35±9.771)2)47.13±6.81IA/MA(%)39.95±5.9975.08±7.261)2)43.14±5.33狹窄(%)21.05±8.5482.08±11.841)2)30.35±10.37

與對照組比較：1)P<0.05；與移植組比較：2)P<0.05

3 討 論

血管損傷后的血管內膜的異常增生在血管再狹窄過程中起了重要的作用，如在動脈粥樣硬化及再狹窄的過程中，血管平滑肌的遷移、異常增殖和大量細胞外基質的分泌是起重要環(huán)節(jié)。因此，修復內膜，有效抑制血管平滑肌的增殖可減輕血管內狹窄的程度。

BMSCs 主要來源于胚胎時期的中胚層，不僅易于體外擴增，還具有多種分化能力，在誘導劑的體外誘導下，BMSCs 可向內皮細胞分化，修復受損傷的內膜〔3〕。在BMSCs 與平滑肌細胞共培養(yǎng)的實驗中發(fā)現(xiàn)〔4〕，平滑肌細胞的遷移、增殖能力明顯下降，說明BMSCs在一定程度上抑制了平滑肌細胞的增殖。Wu等〔5〕建立大鼠心肌梗死模型，將BMSCs 注射到大鼠梗死相關血管內，2 w后病理組織學研究顯示，梗死血管的血栓負荷明顯減輕，血管出現(xiàn)再通趨勢，同時冠狀動脈的狹窄程度有所減輕。劉志江等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷兔頸總動脈后移植BMSCs 于血管損傷處，4 w后行勁總動脈血管造影顯示，移植組血管狹窄程度較對照組明顯減輕，由此得出BMSCs移植減輕血管再狹窄的結論。Foteinos等〔7〕將BMSCs移植到ApoE基因敲除的小鼠的動脈粥樣硬化區(qū)域，發(fā)現(xiàn)BMSCs減輕了了動脈粥樣硬化的程度，延緩了狹窄的發(fā)生。本研究在兔腹主動脈損傷后行BMSCs移植發(fā)現(xiàn)移植組可見細胞核呈藍色熒光的BMSCs 歸巢到血管損傷內膜處，而損傷組和對照組均無上述現(xiàn)象，說明BMSCs具有向損傷的血管內膜歸巢的能力。經BMSCs移植能抑制損傷血管內膜的異常增生，減輕血管損傷后再狹窄。

當動脈損傷時，內膜細胞增生，管腔喪失代償性擴張能力，成為血管再狹窄的一個重要原因。Shi等〔8〕的研究發(fā)現(xiàn)，血管內膜平滑肌細胞增殖能力增強、合成和分泌細胞外基質增加是導致?lián)p傷血管內膜瘢痕形成、彈性回縮的重要因素，平滑肌細胞由正常的收縮表型轉化成增殖能力異常提高的合成表型，因此，有效抑制上述過程有助于減輕再狹窄的發(fā)生。

研究證實〔9〕，球囊損傷動脈后早期，血管內膜上出現(xiàn)的平滑肌細胞異常增殖，成合成表型，免疫組織化學顯示α肌動蛋白(α-actin)表達減弱。在我們的實驗中，光鏡下觀察到移植組新生血管內膜中可見α-SM-actin陽性表達，與損傷組比較明顯增強。這是由于球囊損傷后，血管內膜平滑肌細胞發(fā)生了表型轉化，大多數(shù)處于合成表型，增值能力明顯提高，而BMSCs移植后，損傷血管內膜平滑肌細胞由收縮表型向合成表型的轉化能力下降，合成型平滑肌細胞明顯減少，平滑肌細胞異常增值能力受到抑制，血管再狹窄的程度較損傷組明顯減輕。

PCNA是一種核蛋白，其相對分子質量為36 000，PCNA在平滑肌細胞增殖過程中合成活躍〔10,11〕，表達呈周期依賴性，其表達能力在G1開始增加，高峰出現(xiàn)在S期，G2、M期開始下降。PCNA是評價平滑肌細胞增殖狀態(tài)的可靠指標，其表達水平與平滑肌細胞的增殖活躍程度成正比。本研究結果顯示，BMSCs移植抑制了平滑肌細胞的增殖，從而減輕動脈再狹窄進程。

綜上所述，兔腹主動脈損傷后局部移植BMSCs，能歸巢到受損傷的血管內膜處，促進了血管內膜平滑肌細胞向收縮表型的轉化，抑制了平滑肌細胞的過度增殖，減輕了血管再狹窄，為動脈粥樣硬化及狹窄的防治提供新的途徑。

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〔2015-09-07修回〕

(編輯 曹夢園)

吳向軍(1977-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事心臟介入研究。

王慶元(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管病學診斷與治療研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)04-0814-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.013