Nr4a1拮抗劑抑制肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制

毛小亮 童繼春 朱 征 殷亞俊 王燁銘 石亮榮

(常州市第二人民醫(yī)院胸心外科,江蘇 常州 213000)

Nr4a1拮抗劑抑制肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制

毛小亮 童繼春 朱 征 殷亞俊 王燁銘 石亮榮1

(常州市第二人民醫(yī)院胸心外科,江蘇 常州 213000)

目的 觀察Nr4a1拮抗劑在αVβ6-ERK-ETS1通路中抑制肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。方法 培養(yǎng)傳代肺癌A549細(xì)胞系，分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，兩組均采用生長因子誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，實(shí)驗(yàn)組采用Nr4a1拮抗劑阻斷αVβ6-ERK-ETS1通路，對照組不采用拮抗劑，采用流式細(xì)胞術(shù)及Western印跡檢測信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 形態(tài)學(xué)上，實(shí)驗(yàn)組組細(xì)胞呈梭形或類似于成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而對照組部分細(xì)胞呈圓形或卵圓形。Western印跡及流式細(xì)胞檢測均發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、γ-catenin及αvβ6 表達(dá)均較處理前顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Nβ-cateinin、Vimentin表達(dá)則有不同程度升高(P<0.05)。結(jié)論 Nr4a1拮抗劑能夠通過αVβ6-ERK-ETS1通路抑制肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

Nr4al拮抗劑；αVβ6-ERK-ETS1通路；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移主要的機(jī)制之一，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細(xì)胞過程中，表面的相關(guān)標(biāo)識蛋白如E-cadherin、Occludin、Z01和Cytokeratin表達(dá)逐漸下調(diào)，而N-cadherin、Vimentin和Fibronectin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)識蛋白表達(dá)上調(diào)〔1〕。

αVβ6-ERK-ETS1通路是細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)重要通路，參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，但具體機(jī)制尚不明確。Nr4a1是早期反應(yīng)基因家族中的一員，可以接受細(xì)胞外信號，對不同靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。目前，大量體內(nèi)體外研究證實(shí)Nr4a1與各種實(shí)體腫瘤的轉(zhuǎn)移也存在密切的關(guān)系〔2～4〕。因此，Nr4a1是否通過αVβ6-erk-ets1通路誘發(fā)肺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)通過檢測肺癌A549細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探討Nr4a1促進(jìn)轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細(xì)胞系，RPMI 1640培養(yǎng)液，αVβ6單克隆抗體，Nr4a1拮抗劑，抗ERK 單抗、E-cadherin抗體、Vimentin抗體、p-ERK抗體、α-catenin抗體、Fat-1抗體、γ-catenin抗體、Nβ-cateinin抗體、P38抗體、JNK抗體、PI3K抗體、AKT抗體等,轉(zhuǎn)錄因子活性檢測試劑盒、流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 肺癌A549細(xì)胞系的傳代及培養(yǎng) 取出存有肺癌A549細(xì)胞的凍存管，放于37℃溫水中，用鑷子夾住輕輕搖動使其迅速融化。1 000～2 000 r/min離心3～5 min，無菌條件下打開凍存管，移去上清液，加入1 ml預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞吹散開，然后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中。加入4 ml的RPMI 1640培養(yǎng)液及10%的胎牛血清。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液。后加入1 ml消化液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5～8 min后把培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的胞質(zhì)回縮、胞間質(zhì)增大后終止消化。加入5 ml預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打后，吸取一半的細(xì)胞懸液，以1∶2傳代接種到新的25 cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液至5～10 ml，加10%～20%的胎牛血清。倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)，分別加入制備細(xì)胞懸液待用。實(shí)驗(yàn)組采用Nr4a1多克隆抗體及生長因子(終濃度是10 ng/ml TGF-β1,25 ng/ml EGF)分別加入培養(yǎng)基中，對照組只加入生長因子。

1.2.2 制備細(xì)胞蛋白 將細(xì)胞懸液加入15 ml離心管中，2 500 r/min離心5 min。棄上清，加入4 ml PBS并輕輕吹打洗滌，再次2 500 r/min離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。用槍洗干上清后，加100 μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min。4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于1.5 ml離心管中并置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 取生長較好的實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞，胰酶消化，1 ml PBS清洗后移入15 ml BD管中。800 r/min離心5 min，去上清，PBS吹洗，再次離心棄上清，重復(fù)2次，用0.1 ml冰PBS重懸，移到1.5 ml EP管中。分別按照1∶100加入1 U上皮標(biāo)志標(biāo)志物E-cadherin、γ-catenin抗體和間質(zhì)標(biāo)志物Nβ-cateinin、Vimentin單克隆抗體，室溫孵育1 h，1 000 r/min離心5 min，去上清，PBS吹洗細(xì)胞，再次離心棄上清，重復(fù)3次，最后重懸于0.5 ml PBS中。按照1∶100分別加入熒光二抗，移入流式管，錫紙包裹避光，上流式細(xì)胞儀測定實(shí)驗(yàn)組和對照組肺癌細(xì)胞表面上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.2.4 Western印跡檢測 分別收集實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞制備的備用蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入5倍SDS 上樣緩沖液至終濃度為1倍。沸水中煮5 min使蛋白變性。上樣，電泳4 h，電壓為40 V，轉(zhuǎn)膜，脫色后晾干備用。上搖床5%脫脂牛奶封閉1 h，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫下孵育1～2 h后，用TBST脫色洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min。重復(fù)上述步驟加入二抗，ECL法化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件，兩個樣本間的比較采用t檢驗(yàn)，多個樣本及組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Nr4a1拮抗劑處理前后肺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈梭形或類似于成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而對照組部分細(xì)胞呈圓形或卵圓形(圖1)。生長因子可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2.2 Western印跡檢測調(diào)控EMT過程信號通路中相關(guān)蛋白及其磷酸化水平 如圖2，對照組(7.2 mmol/L,1.2 mmol/L)較實(shí)驗(yàn)組ERK(12.5 mmol/L)及p-ERK(1.6 mmol/L)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而AKT(實(shí)驗(yàn)組1.8 mmol/L，對照組1.2 mmol/L)、PI3K(實(shí)驗(yàn)組13.2 mmol/L，對照組14.8 mmol/L)及MAPK信號通路中其他分子JNK(實(shí)驗(yàn)組8.9 mmol/L，對照組9.0 mmol/L)、p-JNK(實(shí)驗(yàn)組3.8 mmol/L，對照組4.0 mmol/L)、p-P38(實(shí)驗(yàn)組4.3 mmol/L，對照組4.5 mmol/L)、p-AKT(實(shí)驗(yàn)組6.8 mmol/L，對照組6.5 mmol/L)P38、JNK等無顯著差異(P>0.05)。內(nèi)參GAPDH水平為10 mmol/L。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖2 兩組中調(diào)控EMT過程信號通路中 相關(guān)蛋白及其磷酸化水平

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞EMT過程重要分子表達(dá)差異性 流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞E-cadherin、γ-catenin及αvβ6 均較處理前表達(dá)顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Nβ-cateinin、Vimentin表達(dá)不同程度升高(P<0.05)。

3 討 論

目前，EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系已經(jīng)得到明確，也為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)〔5,6〕。實(shí)體腫瘤癌細(xì)胞來源于上皮細(xì)胞，具有極性，通過各種連接方式緊密黏附在一起，無法自由移動；而間質(zhì)細(xì)胞無極性，可以自由移動。因此，癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移時，可以通過重新啟動上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換“程序”轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細(xì)胞，獲得具有自由遷移運(yùn)動能力，釋放相關(guān)酶，在細(xì)胞間穿行，穿越基底膜，進(jìn)入脈管系統(tǒng)，侵襲到遠(yuǎn)處組織〔7〕。

整合素是一種連接細(xì)胞和細(xì)胞外環(huán)境的跨膜受體，可以通過跨膜作用將外界刺激相關(guān)信息傳入細(xì)胞。 因此，整合素參與了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞形態(tài)變化以及運(yùn)動等生理作用。而αvβ6是唯一僅存于惡性上皮源性腫瘤表面的整合素，可以作為一種抗惡性上皮性腫瘤的靶目標(biāo)〔8〕。Ets1是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族中一類轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合基因上游特異蛋白質(zhì)，活化后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至胞核，特異性識別和結(jié)合基因啟動子,啟動和調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、增殖凋亡等過程中發(fā)揮重要作用〔9〕。胞外信號調(diào)控激酶(ERK)是真核生物中廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(MAPK)中的一種，通過整合素進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。

研究發(fā)現(xiàn)αvβ6與ERK2之間存在直接連接，結(jié)合位點(diǎn)位于746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，因此腫瘤細(xì)胞可以將細(xì)胞外信號通過αvβ6-ERK2跨膜載體傳遞給細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子啟動相關(guān)基因表達(dá)(如Nr4a1基因)〔10〕。Nr4a1是早期反應(yīng)基因家族中的一員，廣泛表達(dá)于各種組織，包括胸腺、肌肉、肺、肝等，接受細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)后可以迅速表達(dá)，因細(xì)胞類型和刺激信號的不同對不同靶點(diǎn)特異性識別和結(jié)合調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞的存活與凋亡、代謝性疾病、血管重塑、類固醇合成、腫瘤發(fā)生以及炎性反應(yīng)等。目前研究證實(shí)Nr4a1與肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移也存在密切的關(guān)系〔11〕。本研究中肺癌細(xì)胞經(jīng)過Nr4a1拮抗劑處理后，細(xì)胞中αvβ6、ERK2 及p-ERK2蛋白的表達(dá)水平一致降低，而對照組中表達(dá)水平?jīng)]有變化，因此本研究中Nr4a1基因通過αvβ6-ERK2通路發(fā)揮作用。

至于αvβ6-ERK2通路傳遞的細(xì)胞外信號如何調(diào)控核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子并影響下游Nr4a1基因，既往研究證實(shí)αvβ6-ERK2通路傳遞的細(xì)胞外信號激活了Ets1轉(zhuǎn)錄因子，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而特異性識別相關(guān)基因啟動子，啟動相關(guān)基因的表達(dá)〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Nr4a1拮抗劑處理后，間質(zhì)表型標(biāo)志分子的表達(dá)減低以及上皮表型標(biāo)志分子表達(dá)升高，表明肺癌A549細(xì)胞出現(xiàn)了“間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化”的過程，Nr4a1拮抗劑抑制了肺癌A549細(xì)胞EMT過程。因此，我們推測當(dāng)細(xì)胞外信號(如機(jī)體免疫能力差、化療耐藥、干細(xì)胞比例升高等)通過αvβ6-ERK2通路傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，通過Ets1轉(zhuǎn)錄因子啟動相關(guān)基因啟動子，誘導(dǎo)Nr4a1快速表達(dá)相關(guān)蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。

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〔2016-04-15修回〕

(編輯 徐 杰)

Inhibition of epithelial mesenchymal transition of lung cancer cells via αVβ6-ERK-ETS1 beta pathway by Nr4a1 antibody

MAO Xiao-Liang,TONG Ji-Chun,ZHU Zheng,etal.

Department of Cardiothoracic Surgery,the Second People's Hospital of Changzhou,Changzhou 213000,Jiangsu,China

Objective To observe the effect of Nr4a1 antibody on the epithelial mesenchymal transition(EMT) of lung cancer cells in the αVβ6-ERK-ETS1 pathway.Methods Human lung cancer cell line A549 was cultured,and then divided into experimental and control groups. Growth factors were used for inducing epithelial mesenchymal transition process in two groups. Nr4a1 polyclonal antibody was added to blockade of αVβ6-ERK-ETS1 pathway in the experimental group while the control group was not. The flow cytometry technique and Western blot were used to detect signal pathway related protein expression,and compared between groups.Results The cells of experimental group were fusiform or similar to the morphology of fiber cells,while the control group cells were round or oval. The epithelial cell markers including E-cadherin,gamma catenin andαVβ6 were decreased significantly in control group cell,and stromal cells labeled compounds Nβ-cateinin,vimentin expression were increased (P<0.05). Conclusions The Nr4a1 polyclonal antibody could inhibit EMT of lung cancer cells by inhibiting the αVβ6-ERK-ETS1 pathway.

Nr4al polyclonal antibody;αVβ6-ERK-ETS1 pathway;Epithelial mesenchymal transition

國家自然科學(xué)基金(81171653)

童繼春(1965-)，男，主任醫(yī)師，主要從事胸腔鏡研究。

毛小亮(1973-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事胸腔鏡研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0809-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.011

1 蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院