RECQL基因沉默對(duì)HCC細(xì)胞株體外增殖的抑制作用

張靜靜 趙妍妍 許雅思 黃?，L 朱魯程 馬勝林 張仕蓉

RECQL基因沉默對(duì)HCC細(xì)胞株體外增殖的抑制作用

張靜靜 趙妍妍 許雅思 黃?，L 朱魯程 馬勝林 張仕蓉

目的 觀察RECQL基因沉默表達(dá)對(duì)人肝細(xì)胞癌 (human hepatocelullar carcinoma,HCC)細(xì)胞株體外增殖的影響,探討RECQL作為肝癌治療潛在靶向基因的可能性。方法 以BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B、SNU-761 HCC細(xì)胞為研究對(duì)象，采用Western blot和免疫組化法觀察解旋酶RECQL蛋白的表達(dá)情況，通過RNA干擾技術(shù)抑制RECQL表達(dá)，測定HCC細(xì)胞和正常肝細(xì)胞（THLE-2細(xì)胞）的存活率和死亡率，并采用Western blot法分析凋亡相關(guān)蛋白的變化，F(xiàn)ACS法檢測細(xì)胞周期分布。 結(jié)果RECQL蛋白在BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B中為陽性表達(dá)，SNU-761中為陰性表達(dá)。RECQL-siRNA在陽性表達(dá)組中抑制HCC細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞存活率降低和死亡率增加（均P＜0．01），但對(duì)陰性表達(dá)組和THLE-2細(xì)胞存活率和死亡率無影響（均P＞0．05）。RECQL-siRNA處理的SK-HEP-1細(xì)胞中，剪切型凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP的表達(dá)變化不大，而G2/M期細(xì)胞的比例明顯增加（P＜0．05或0．01）。結(jié)論RECQL基因沉默表達(dá)可以抑制HCC細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用依賴于RECQL的高表達(dá)，并對(duì)正常肝細(xì)胞無影響，其可能機(jī)制是阻滯細(xì)胞G2/M期，可以作為治療肝癌的潛在靶向基因。

RECQL 人肝細(xì)胞癌 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期

人肝細(xì)胞癌（human hepatocellular carcinoma,HCC）是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，是最常見的肝癌類型[1]。國內(nèi)肝癌患者的5年生存率較低，是繼肺癌之后的第二大腫瘤死因[2]，目前還未鑒定出確實(shí)有效的HCC治療靶向基因。人類RecQ解旋酶家族包括RECQL（也稱為RECQ1或 RECQL1）、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5β5個(gè)成員，其中BLM、WRN和RecQ4的遺傳缺陷分別會(huì)引發(fā)面部紅斑侏儒綜合征、沃納綜合征、先天性血管萎縮皮膚異色病等[3-4]，且RecQ相關(guān)疾病多伴基因組不穩(wěn)定性增加和高風(fēng)險(xiǎn)的癌癥易感性[5-6]。RECQL作為人類中表達(dá)豐度最高的RecQ蛋白，在許多腫瘤中高表達(dá)[7]，參與DNA復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)、端粒維持、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、發(fā)展等。最近研究表明，RECQL的突變易致家族性乳腺癌，因此RECQL現(xiàn)在被認(rèn)為是新的乳腺癌易感基因[4,8-10]。RECQL在肝癌中的研究還相對(duì)較少，本研究通過觀察其在不同HCC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，采用RNA干擾技術(shù)抑制其表達(dá)，探討RECQL對(duì)HCC細(xì)胞增殖、生長、凋亡和周期分布等的影響，為臨床治療RECQL的靶向藥物潛力提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 4種 HCC細(xì)胞 BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B、SNU-761和正常肝細(xì)胞THLE-2均購自中科院上海細(xì)胞庫，采用RPMI-1640培養(yǎng)基（其中含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和2 mM谷氨酰胺，均購自美國Gibco公司），并置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱（型號(hào)3110，美國ThermoFisher公司）中培養(yǎng)。靶向RECQL mRNA的siRNA（21bp）和無關(guān)序列均由上海生工公司合成。所有siRNA序列在3′末端具有突出的3′-dTdT，siRNA靶向的具體序列如下[11-12]：

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)轉(zhuǎn)染序列不同將細(xì)胞分為3組，即空白對(duì)照組：不作任何處理，陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染無關(guān)序列（Scramble siRNA），干擾組：轉(zhuǎn)染RECQL siRNA（RECQL siRNA-KD1～5）。將HCC細(xì)胞和和正常肝細(xì)胞以2× 105個(gè)/孔接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞生長達(dá)到約70%密度時(shí)，按照Lipofectamine ?RRNAiMAX（美國Invitrogen公司）制造商說明分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24h或48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.2 蛋白印跡（Western blot）法 收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷PBS洗滌后加入NP-40裂解液中，提取總蛋白進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，依次孵育一抗和對(duì)應(yīng)二抗，洗膜，用Li-Cor Odyssey V3.0紅外雙色激光掃描成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）檢測蛋白信號(hào)。一抗包括RECQL（美國Santa cruz公司，75kDa，1∶1 000）、GAPDH（美國Proteintech公司，36kDa，1∶5 000），以及凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-PARP（美國Abcam公司，113 kDa，1∶1 000）、cleaved-caspase-3（美國Abcam公司，17 kDa，1∶1 000）。

1.2.3 免疫組化染色 將無菌圓形蓋玻片置于12孔板中，后經(jīng)0.1%明膠處理30min，接種2×104細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，3～5d后進(jìn)行組織化學(xué)染色。PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次×2min；0.1%Triton-X-100通透15min，PBS洗滌3次×2min；3%H2O2孵育15min滅活內(nèi)源過氧化物酶；PBS洗滌后血清封閉1h，依次孵育RECQL一抗和相應(yīng)二抗，并進(jìn)行DAB顯色和蘇木素復(fù)染，最后用中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)中均設(shè)已知陽性對(duì)照和PBS作為一抗的陰性對(duì)照。

1.2.4 鏡檢結(jié)果評(píng)定 2位病理醫(yī)師分別在高倍顯微鏡（型號(hào)DM3000，德國Leica公司）下觀察樣本，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)定RECQL的表達(dá)情況，綜合后作出最終評(píng)定意見[13]。根據(jù)半定量計(jì)分法分別對(duì)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)分。染色強(qiáng)度計(jì)分：無染色或輕度染色（1分，淡黃色）、中度染色（2分，棕黃色）、強(qiáng)染色（3分，黃褐色）；陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：＜5%（1分）、5%～30%（2分）、31%～65%（3分）、＞65%(4分)。兩項(xiàng)計(jì)分之和0分為陰性（-）、1～2分為弱陽性（+）、3～6分為陽性（++）、≥7分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.2.5 細(xì)胞存活率和死亡率檢測 轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞培養(yǎng)至24h或48h，收集上清液和細(xì)胞沉淀用PBS重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色后用Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（型號(hào)IC1000，上海睿鈺公司生產(chǎn)）分析，直接讀取細(xì)胞存活率，并計(jì)算細(xì)胞死亡率。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測 收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜。離心取細(xì)胞沉淀，PBS洗滌，加入用PBS配置的含50μg/ml溴化乙錠（PI）染液4℃避光孵育30min，F(xiàn)ACS上機(jī)檢測G1、S、G2/M各期細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RECQL蛋白在不同HCC細(xì)胞中的表達(dá)情況 見圖1。

由圖1可見，Western blot法結(jié)果顯示在BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B、SNU-761 4種細(xì)胞中均能檢測到RECQL的表達(dá)，但SK-HEP-1中表達(dá)最強(qiáng)、BEL7404次之、Hep3B稍弱，SNU-761則表達(dá)量極弱（圖1a）；免疫組化染色結(jié)果與Western blot法結(jié)果一致，SK-HEP-1評(píng)定為高表達(dá)（+++），SNU-761評(píng)定為低表達(dá)弱染色（+）（圖1b）。根據(jù)以上結(jié)果，將BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B作為RECQL陽性表達(dá)組，SNU-761作為RECQL陰性表達(dá)組。

2.2 不同HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RECQL-siRNA后RECQL mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞存活率和死亡率比較 見圖2、表1。

圖1 RECQL蛋白在不同HCC細(xì)胞中的表達(dá)（A:Western blot法檢測RECQL的表達(dá)；B:免疫組化法檢測RECQL的表達(dá)，×100）

圖2 不同HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后RECQL mRNA表達(dá)水平圖（與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，**P＜0.01）

由圖2、表1可見，在4種HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RECQL-siRNA 24h后，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，干擾組RECQL mRNA表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.01）。在陽性表達(dá)組（BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B細(xì)胞）中干擾RECQL基因的表達(dá)，細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞死亡率則明顯升高（P＜0.05或0.01）；而在陰性表達(dá)組（SNU-761細(xì)胞）中，細(xì)胞存活率和死亡率均未見明顯變化（均P＞0.05）。

2.3 SK-HEP-1細(xì)胞和THLE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后RECQL的蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞存活率、死亡率比較見圖3、表2～3。

表1 不同HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RECQL-siRNA后細(xì)胞存活率和死亡率比較

圖3 SK-HEP-1細(xì)胞和THLE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后RECQL的蛋白表達(dá)水平圖（a：RECQL在兩種細(xì)胞中的本底表達(dá)比較；b：轉(zhuǎn)染siRNA后，RECQL在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況）

由圖3可見，正常肝細(xì)胞THLE-2中RECQL表達(dá)水平與陽性表達(dá)組細(xì)胞SK-HEP-1中相似（圖3a）。通過轉(zhuǎn)染5種不同序列的siRNA，均實(shí)現(xiàn)了不同程度的RECQL蛋白水平抑制表達(dá)（圖3b）。

由表2、3可見，轉(zhuǎn)染siRNA 48h后，HCC細(xì)胞SKHEP-1細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均降低，細(xì)胞死亡率均升高（均P＜0.01）；而正常肝細(xì)胞THLE-2細(xì)胞存活率、死亡率與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 RECQL-siRNA對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和周期分布的影響 見圖4。

由圖4可見，在RECQL陽性表達(dá)組細(xì)胞SK-HEP-中，凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3表達(dá)水平與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比變化不大（圖4a）。干擾組與陰性對(duì)照組相比，G1、S期細(xì)胞比例變化不明顯（P＞0.05），而G2/M期細(xì)胞比例明顯上調(diào)（P＜0.05或0.01，圖4b）。

表2 在SK-HEP-1和THLE-2細(xì)胞中干擾RECQL表達(dá)后細(xì)胞存活率比較（%）

表3 在SK-HEP-1和THLE-2細(xì)胞中干擾RECQL表達(dá)后細(xì)胞死亡率比較（%）

圖4 RECQL-siRNA對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和周期分布的影響（與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

RECQL是人類中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的DNA解旋酶，作為RecQ家族中表達(dá)豐度最高的蛋白，與遺傳性癌癥易感綜合征有關(guān)，通過DNA修復(fù)來維持基因組穩(wěn)定性是它的主要功能。最新研究顯示，RECQL有助于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，部分原因是其能通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移；RECQL的缺失會(huì)造成基因組不穩(wěn)定、抑制癌細(xì)胞增殖[3,14]。

根據(jù)RECQL在4種HCC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，分為RECQL陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組。對(duì)RECQL-siRNA處理的細(xì)胞進(jìn)行觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)照組細(xì)胞密度逐漸增加，而SK-HEP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后生長卻受到嚴(yán)重影響，同樣培養(yǎng)時(shí)間后細(xì)胞密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組；陽性組細(xì)胞（BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B）的細(xì)胞存活率均顯著下降，細(xì)胞死亡率則明顯上升，相反陰性組（SNU-761）的細(xì)胞存活率和死亡率都沒有受到明顯影響。這說明，RECQL-siRNA能夠抑制HCC細(xì)胞的增殖生長，具有作為治療HCC的靶向基因潛力，并且這種抑制作用可能依賴于RECQL的高表達(dá)。據(jù)研究，大多數(shù)HCC細(xì)胞具有不完整的DNA修復(fù)系統(tǒng)[15]，轉(zhuǎn)染siRNA后，RECQL陽性HCC細(xì)胞和陰性HCC細(xì)胞在增殖上的差異，推測是因?yàn)檫@兩類細(xì)胞的DNA修復(fù)、細(xì)胞周期等相關(guān)通路不同：陽性組細(xì)胞相關(guān)通路為RECQL依賴性，且極有可能是通過高表達(dá)RECQL此修復(fù)酶和DNA復(fù)制的良好協(xié)調(diào)來修復(fù)DNA損傷，從而保證細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，而陰性組細(xì)胞則為RECQL非依賴性。因此，在RECQL沉默后，陽性組的細(xì)胞增殖因通路受阻而被抑制，陰性組則不受影響。

目前大多數(shù)化療藥物在治療中不僅殺死癌細(xì)胞，也會(huì)對(duì)正常組織造成不利影響，只有找到只殺傷癌細(xì)胞、對(duì)正常細(xì)胞無影響的靶向基因，才能起到更好的治療作用。那么RECQL-siRNA的增殖抑制作用是只針對(duì)RECQL高表達(dá)的HCC細(xì)胞，還是對(duì)正常肝細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生影響？為了闡明RECQL-siRNA對(duì)正常肝細(xì)胞是否具有殺傷作用，筆者同步檢測RECQL-siRNA對(duì)HCC細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示在RECQL陽性HCC細(xì)胞中，RECQ1-siRNA能夠降低細(xì)胞存活率、增加細(xì)胞死亡率，而其對(duì)正常肝細(xì)胞THLE-2的細(xì)胞存活率和死亡率均無影響，這說明RECQL沉默表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用只對(duì)RECQL高表達(dá)的HCC細(xì)胞有效，而對(duì)正常肝細(xì)胞是沒有抑制作用的。Thangavel[16]曾報(bào)道RECQL在DNA復(fù)制起點(diǎn)位置累積，RECQL的瞬時(shí)缺失會(huì)降低復(fù)制開始的概率，并進(jìn)一步導(dǎo)致復(fù)制起始處DNA序列的減少，如果大多數(shù)復(fù)制起點(diǎn)失活，大量DNA只能通過極少的DNA聚合酶復(fù)合體，這會(huì)形成更大的染色體環(huán)；Popuri等[17]發(fā)現(xiàn)RECQL穩(wěn)定缺失可以影響細(xì)胞增殖并使細(xì)胞對(duì)各種DNA損傷應(yīng)激的靈敏度增強(qiáng)，直接或間接阻斷DNA復(fù)制叉的形成，此外，還會(huì)導(dǎo)致未凝集染色體缺陷累積，暗示RECQL缺失細(xì)胞DNA復(fù)制后進(jìn)入分裂期可能較慢，這也很好地解釋了RECQL沉默表達(dá)可以誘導(dǎo)有絲分裂障礙并殺傷癌細(xì)胞的報(bào)道[15]。本研究中正常肝細(xì)胞耐受RECQL沉默表達(dá)，未引起增殖抑制，推測可能是正常細(xì)胞能夠自動(dòng)修復(fù)RECQL沉默造成的DNA損傷，從而保證細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。Furuichi等[15]對(duì)DNA修復(fù)和周期相關(guān)蛋白（TP53,Rb1, p16/INK4a和p21/WAF1）檢測發(fā)現(xiàn)其在不同的細(xì)胞系中表達(dá)差異較大，特別是p21/WAF1基因，其在很多HCC細(xì)胞中表達(dá)極低甚至不表達(dá)，而正常細(xì)胞中表達(dá)量較高，可能正是周期檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白缺陷，使HCC細(xì)胞不能自動(dòng)修復(fù)DNA損傷造成的有絲分裂障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到影響。

既然轉(zhuǎn)染RECQL-siRNA后，SK-HEP-1細(xì)胞的增殖受到抑制，那么與細(xì)胞增殖生長密切相關(guān)的凋亡和周期是否受到影響呢？RECQL沉默表達(dá)后，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase-3等表達(dá)水平不受太大影響。但Matsushita[11]在上皮性卵巢癌中沉默RECQL表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡；另外，在經(jīng)RECQL-siRNA處理的HCC細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)代表碎片的subG1峰表達(dá)很高[11,15]。與之結(jié)果不同的是本研究檢測到RECQL-siRNA處理組的G2/M期細(xì)胞比例有所升高，而在早期Futami的研究中，RECQL-siRNA增加癌細(xì)胞有絲分裂死亡，并被阻滯于M期[18]。據(jù)報(bào)道，如果轉(zhuǎn)染siRNA后，癌細(xì)胞仍表達(dá)高水平DNA修復(fù)酶RECQL，那么DNA異常細(xì)胞就仍然可以進(jìn)入M期，發(fā)生M期阻滯[11]。所以可能是受RECQL-siRNA表達(dá)效果、轉(zhuǎn)染效率、檢測時(shí)間等因素影響，沒有直接誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而是經(jīng)歷不均勻分裂后停止于M期，誘導(dǎo)有絲分裂災(zāi)難或者細(xì)胞異常分裂。

綜上所述，在體外RECQL-siRNA可以抑制RECQL高表達(dá)的HCC細(xì)胞增殖生長，引起細(xì)胞存活率的降低和死亡率的升高，并對(duì)正常肝細(xì)胞沒有影響，是一種針對(duì)肝癌的潛在分子靶標(biāo)藥物；RECQL沉默表達(dá)不誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡，但引起有絲分裂障礙，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。除了HCC，對(duì)于其它類型的肝癌RECQL-siRNA是否具有同樣的增殖抑制作用、RECQL-siRNA臨床上的抑癌作用是否也依賴于RECQL的高表達(dá)都值得深入研究。今后，將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，深入研究RECQL對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制，并探討RECQL-siRNA作為肝癌治療藥物的可行性，還將進(jìn)行臨床前瞻性研究，進(jìn)一步驗(yàn)證RECQL作為預(yù)測肝癌惡性和進(jìn)展生物標(biāo)志物的潛力。

[1] Yan L,Farmr R W,Yang Y,et al．Epithelial cell adhesion molecule in human hepatocellular carcinoma cell lines:a target of chemoresistence[J]．Bmc Cancer,2016,16(1):1-10．

[2] 陳萬青,鄭榮壽,曾紅梅,等．2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]．中國腫瘤,2015,24(1):1-8．

[3] Lu X S,Parvathaneni,Li X L,et al．Transcriptome guided identification of novel functions of RECQ1 helicase[J]．Methods,2016, 108:111-117．

[4]Sami F,Sharma S．PROBING GENOME MAINTENANCE FUNCTIONS OF HUMAN RECQ1[J]．Computational&Structural Biotechnology Journal,2013,6(7):1-10．

[5]Croteau D L,Popuri V,Opresko P L,et al．Human RecQ helicases in DNA repair,recombination,and replication[J]．Annual Review of Biochemistry,2014,83(1):519-552．

[6] Jr B R．DNA helicases involved in DNA repair and their roles in cancer[J]．Nature Reviews Cancer,2013,13(8):542-558．

[7]Lu X,Parvathaneni S,Hara T,et al．Replication stress induces specific enrichment of RECQ1 at common fragile sites FRA3B and FRA16D[J]．Molecular Cancer,2013,12(1):1-12．

[8]Cybulski C,Jian C Z,Klu W,et al．Germline RECQL mutations are associated with breast cancer susceptibility[J]．Nature Genetics, 2015,47(6):643-646．

[9]Kwong A,Shin V Y,Cheuk I W,et al．Germline RECQL mutations in high risk Chinese breast cancer patients[J]．Breast Cancer Research&Treatment,2016,157(2):211-215．

[10]Sun J,Wang Y,Xia Y,et al．Mutations in RECQL Gene Are Associated with Predisposition to Breast Cancer[J]．Plos Genetics, 2015,11(5):e1005228．

[11] Matsushita Y,Yokoyama Y,Yoshida H,et al．The level of RECQL1 expression is a prognostic factor for epithelial ovarian can-cer[J]．Journal of Ovarian Research,2014,7(1):1-10．

[12] Mendoza-Maldonado R,Faoro V,Bajpai S,et al．The human RECQ1 helicase is highly expressed in glioblastoma and plays an important role in tumor cell proliferation[J]．Molecular Cancer, 2011,10(1):1-17．

[13]周珍,李旋,倪海峰,等．VEGF、EGFR及Parkin蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)及三者間的相關(guān)性研究[J]．浙江醫(yī)學(xué),2015,37(13):1116-1120．

[14] Sharma S．An appraisal of RECQ1 expression in cancer progression[J]．Frontiers in Genetics,2014,5(5):420-426．

[15]Furuichi．RecQL1 DNA repair helicase:A potential tumor marker and therapeutic target against hepatocellular carcinoma[J]．International Journal of Molecular Medicine,2010,25(4):537-545．

[16] Thangavel S,Mendozamaldonado R,Tissino E,et al．Human RECQ1 and RECQ4 helicases play distinct roles in DNA replication initiation[J]．Molecular&Cellular Biology,2010,30(6): 1382-1396．

[17]Popuri V,Croteau D L,Jr B R,et al．RECQ1 is required for cellular resistance to replication stress and catalyzes strand exchange on stalled replication fork structures[J]．Cell Cycle,2012, 11(22):4252-4265．

[18] Futami K,Kumagai E,Makino H,et al．Anticancer activity of RecQL1 helicase siRNA in mouse xenograft models[J]．Cancer Science,2008,99(6):1227-1236．

RECQL-siRNA inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines in vitro

Objective To investigate the effect of RECQL on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines in vitro．MethodsHepatocellular carcinoma (HCC)BEL7404,SK-HEP-1,Hep3B and SNU-761 cells were transfected with RECQL-siRNA in vitro to silence RECQL．The expression of RECQL protein was detected with Western blot and immunohistochemistry．The viability of HCC and normal liver THLE-2 cells were examined,the expressions of apoptosis-related proteins were detected with Western blot and cell cycle distribution was observed using FACS．Results RECQL protein was positive in BEL7404,SK-HEP-1 and Hep3B cells,and negative in SNU-761 cells．RECQL-siRNA inhibited the proliferation of HCC cells significantly in the RECQL-positive expression HCC cells(P＜0．05),but had no effect on HCC SNU-761 cells and normal liver THLE-2 cells．In SK-HEP-1 cells transfected with RECQL-siRNA,the expression of cleaved caspase-3 and cleaved PARP had no significant change,but the ratio of G2/M phase cells was significantly increased(P＜0．05 or 0．01)．Conclusion RECQL-siRNA can inhibit the proliferation of HCC cells with positive RECQL,indicating that RECQL may be a potential target gene for treatment of liver cancer．

RECQL Human hepatocellular carcinoma Cell apoptosis Cell cycle

2016-11-03）

（本文編輯：馬雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.5.2016-1804

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81602671）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ17H160003）

310006 杭州，南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院、杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

張仕蓉，E-mail:shirley4444@gmail.com