心臟再生分子機(jī)制的研究進(jìn)展*

周 桑，丁雪燕 綜述，秦永文 審校

(第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200433)

心臟再生分子機(jī)制的研究進(jìn)展*

周 桑，丁雪燕 綜述，秦永文△審校

(第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200433)

肌細(xì)胞，心臟；心??；心臟；心臟再生；心肌細(xì)胞再生；心臟重編碼；移植

通常來(lái)說(shuō)，人的心肌細(xì)胞無(wú)法再生，心肌損傷范圍過(guò)大時(shí)會(huì)出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的心力衰竭。2009年Bergmann依據(jù)大氣層C14濃度的變化，證明了人的心肌細(xì)胞存在一定程度的再生能力，但再生的速率極低，成人心肌細(xì)胞的年再生速率約為0.5%～1.0%[1-2]，并隨年齡的增長(zhǎng)逐步下降，無(wú)法彌補(bǔ)心臟損傷(如心肌梗死)后的大量心肌損失。有研究者報(bào)道，鼠正常發(fā)育過(guò)程中存在心肌細(xì)胞再生，來(lái)源于原有心肌細(xì)胞的增殖，而非來(lái)源于干細(xì)胞或心臟祖細(xì)胞的分化；在心肌梗死后，鼠的心肌細(xì)胞再生則同時(shí)來(lái)源于心臟祖細(xì)胞和原有的心肌細(xì)胞的增殖。成熟的心肌細(xì)胞究竟能不能再生，又是如何再生的，這不僅僅是一個(gè)有趣的科學(xué)問(wèn)題，更有著重要的臨床意義，一旦在人體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟再生的促進(jìn)，會(huì)打破目前心衰進(jìn)展只能延緩而不能扭轉(zhuǎn)的困境，帶來(lái)心血管疾病治療手段的巨大飛躍。目前針對(duì)心臟病終末期，僅有心臟移植術(shù)(Tx)和左心室輔助裝置植入術(shù)(LVAD)兩種治療手段，均有較大的局限性。急性失代償期心衰患者的1年內(nèi)病死率高達(dá)30%，而接受了Tx或LVAD的患者1年內(nèi)病死率在16%左右，患者的預(yù)后十分嚴(yán)峻。目前，全球范圍內(nèi)有多種方法可以促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，如心臟灌注或直接注射microRNAs等小分子、經(jīng)外科手術(shù)植入經(jīng)工程改造的心肌組織等。本文將重點(diǎn)綜述心臟再生各途徑及其中尚未解決的問(wèn)題。

1 心臟再生途徑

心臟再生要求有新的心肌細(xì)胞的產(chǎn)生。目前有3種策略可以增加心肌細(xì)胞的數(shù)量：(1)在體內(nèi)將梗死區(qū)的成纖維細(xì)胞重編碼為心肌細(xì)胞；(2)促進(jìn)內(nèi)源性心臟再生；(3)將體外培育的心肌細(xì)胞移植入體內(nèi)。唯一能夠確切增加心肌細(xì)胞數(shù)量的來(lái)源是人類多能干細(xì)胞(hPSC)，包括人類胚胎干細(xì)胞(hESC)、人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)、人類孤雌生殖干細(xì)胞(hPGSC)體外培育。

1.1 直接重編碼 2008年有報(bào)道稱，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Ngn3等可使胰腺外分泌細(xì)胞直接重編碼為β細(xì)胞。2012年有報(bào)道稱，在轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和TBX5的作用下，在體外可以直接將小鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞[3]。同年其他研究者向小鼠心肌內(nèi)直接注射逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)GATA4、MEF2C和TBX5，顯著提高了成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的比率，減少了心肌梗死面積。有研究者通過(guò)減毒細(xì)菌將MyoD蛋白轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，可促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞[4]。轉(zhuǎn)錄因子HAND2、ETS2、Oct4和MESP1、MicroRNAs的研究也顯示了類似的結(jié)果[5]。目前來(lái)看，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可重復(fù)性低，重編碼的效率比較低，大部分再生的心肌細(xì)胞缺乏正常心肌細(xì)胞的表型，只有少部分再生細(xì)胞可跳動(dòng)，仍未有相關(guān)研究報(bào)道重編碼因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)非心肌組織有無(wú)較大影響，以及過(guò)度重編碼是否會(huì)引起心律失常，對(duì)成纖維細(xì)胞如何轉(zhuǎn)分化的機(jī)制也了解較少。存在的最大問(wèn)題可能是，目前所有的已報(bào)道文獻(xiàn)中再生心肌細(xì)胞均無(wú)法與鄰近心肌細(xì)胞形成電偶連。心臟再生技術(shù)應(yīng)用于心臟疾病治療仍存在較大瓶頸，需要更多有突破性的研究成果。

1.2 心肌細(xì)胞再生 鼠的基因系圖結(jié)果提示，成年鼠的心肌細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，心肌梗死后，新的心肌細(xì)胞可從非心肌細(xì)胞(指沒(méi)有α肌球蛋白重鏈)的祖細(xì)胞分化而來(lái)。另有研究者報(bào)道，在鼠的心肌梗死后模型中添加c-kit細(xì)胞可導(dǎo)致明顯的新生血管形成和心肌細(xì)胞再生；而從人類心臟中分離出的表達(dá)c-kit的心臟祖細(xì)胞可引起體內(nèi)心肌細(xì)胞的增多。干細(xì)胞曾被認(rèn)為是心臟再生的種子細(xì)胞，被應(yīng)用于骨髓干細(xì)胞移植治療心肌梗死，但在多項(xiàng)研究中均未獲得理想的臨床療效，提示心臟再生的種子細(xì)胞可能并非干細(xì)胞。最近的研究結(jié)果顯示，祖細(xì)胞對(duì)于成年哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞再生率貢獻(xiàn)極小[6]。乳鼠的基因系圖分析顯示，再生的心肌細(xì)胞主要來(lái)源于原有心肌細(xì)胞的增殖，這與成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞能夠重新返回細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。因此，目前普遍認(rèn)為心臟再生的主要來(lái)源是原來(lái)已經(jīng)存在的心肌細(xì)胞的脫分化，而促進(jìn)原有的心肌細(xì)胞重返細(xì)胞周期可能是修復(fù)受損心臟的重要途徑。

目前已報(bào)道的可以重啟心肌細(xì)胞再生能力的策略有多種。體外實(shí)驗(yàn)中，cyclinB1-CDC2的過(guò)表達(dá)和p21/p27的敲除可使更多的心肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期[7]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，小鼠心肌梗死后，過(guò)表達(dá)cyclinD2和cyclinA2可使更多的心肌細(xì)胞重返細(xì)胞周期，疤痕區(qū)可見(jiàn)心肌再生跡象。過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子E2F2或敲除其調(diào)節(jié)基因Rb和p110也可實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞再生的重啟[8]。另有研究者發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)心肌細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Nrg1)急劇增加，而抑制Nrg1的協(xié)同受體Erbb2將破壞損傷心肌細(xì)胞的增殖反應(yīng)，過(guò)表達(dá)Nrg1的魚(yú)系的心肌再生能力則顯著增強(qiáng)。研究者進(jìn)一步在健康斑馬魚(yú)驗(yàn)證Nrg1的作用，發(fā)現(xiàn)Nrg1可促進(jìn)心肌細(xì)胞去分化，壁層心肌細(xì)胞持續(xù)增加導(dǎo)致心臟肥大。在給予重組人Nrg1后，慢性收縮性心力衰竭的患者的左室收縮功能得到改善，心力衰竭的進(jìn)程被逆轉(zhuǎn)[9]；另有Nrg1的控制基因Len及Nrg1的受體ErbB2和ErbB4的激活也可刺激心肌細(xì)胞增殖的報(bào)道。但Nrg1是否能夠促進(jìn)心肌再生的作用尚存爭(zhēng)議，有研究者重復(fù)了該實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在正常成年鼠和心梗后成年鼠中，Nrg1不能促進(jìn)心肌細(xì)胞的DNA合成，心肌細(xì)胞的再生沒(méi)有得到促進(jìn)。另外有研究者報(bào)道，斑馬魚(yú)心臟部分切除后，附近的心外膜細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)改變，并大量表達(dá)維A酸(RA)及RA合成酶(raldh2)，而阻斷RA表達(dá)將使心室肌細(xì)胞無(wú)法再生。骨膜蛋白和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子也被證明與心肌細(xì)胞再生有關(guān)，也有研究者發(fā)現(xiàn)它們可引起心肌肥大[10]。

另外一種策略是通過(guò)調(diào)整生長(zhǎng)發(fā)育旁路來(lái)刺激心肌細(xì)胞增殖。研究者發(fā)現(xiàn)，GSK3β的敲除可激活Wnt通路，促進(jìn)心臟再生；反過(guò)來(lái)，通過(guò)Hippo通路抑制Wnt通路可抑制心肌再生[11]。Hippo/Yap通路包括一個(gè)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而Mst1/2(Hippo的同源基因)、Lasts1/2(Wnt的同源基因)、Salv1和YAP/TAZ(Yki的同源基因)在哺乳動(dòng)物中是該通路的核心蛋白[12]。Mst1/2的活化將使Lasts1/2氧化磷酸化激活，Lasts1/2的活化將抑制轉(zhuǎn)錄共調(diào)解因子YAP/TAZ。該通路可有效地調(diào)解胎兒心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞再生，Yap基因在心臟的特定敲除可使胚胎發(fā)育時(shí)期心臟再生減少，而在新生鼠中，Yap基因的激活可使心肌細(xì)胞細(xì)胞周期活動(dòng)增加；Lasts1/2(可抑制YAP)和Salv1(可激活Mst1/2)的失活可促進(jìn)心肌再生[12]。Fang等[13]報(bào)道了斑馬魚(yú)心臟損傷后存在JAK1/STAT3通路的激活，并有分泌蛋白R(shí)ln3a表達(dá)增加，在STAT3沉默的斑馬魚(yú)，雖然心臟可發(fā)育正常，但成年期心臟損傷后的斑馬魚(yú)心臟再生被抑制，而這種抑制作用可被外源性Rln3解除。

microRNAs的應(yīng)用則是另一種有效的策略。Eulalio等[14]通過(guò)高通量篩選技術(shù)在全基因組microRNAs庫(kù)中篩選出了能促進(jìn)新生幼鼠心肌細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)的microRNAs。共有40種microRNAs能在不引起心肌肥大的前提下使乳鼠心肌細(xì)胞再生的速率增加2倍以上，研究者進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hsa-miR-590和hsa-miR-199a可以促使體外培養(yǎng)的成人心肌細(xì)胞重返細(xì)胞周期，促進(jìn)新生和成年動(dòng)物的心肌細(xì)胞增殖。在小鼠心梗后模型中，這些microRNAs也能明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞再生、改善心功能[15-16]。值得一提的是，有幾種microRNAs可抑制肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)，并與Hippo通路有關(guān)，miR-302-367短時(shí)增加可通過(guò)Hippo通路促進(jìn)小鼠心臟再生[17]，該過(guò)程涉及肌小節(jié)的解聚和Hippo通路的激活。有趣的是，前文中提到的在心臟再生中起作用的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5也分別受幾種microRNAs的調(diào)節(jié)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA也可能參與心臟再生過(guò)程。另有研究者報(bào)道了一組不同的microRNAs(miR-1、miR-133、miR-208、miR-499)能在體外及體內(nèi)將小鼠成纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，前文提到的JAK阻斷劑可使microRNA介導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率提高。

有多項(xiàng)研究指出，心外膜細(xì)胞和心內(nèi)膜細(xì)胞在斑馬魚(yú)心臟再生中發(fā)揮了重要作用。事實(shí)上，已有諸多報(bào)道提示，心外膜細(xì)胞是心臟再生的實(shí)際啟動(dòng)者，損傷后再生的心外膜細(xì)胞從心室底部向缺損部位遷移，補(bǔ)充損失的心肌細(xì)胞，而心外膜消融后的斑馬魚(yú)無(wú)法進(jìn)行心臟再生。通過(guò)阻斷球狀動(dòng)脈表達(dá)的Hh信號(hào)可以阻斷心臟再生，而人工給予Hh信號(hào)可以使去除了球狀動(dòng)脈的心臟恢復(fù)再生能力[18]，提示控制心肌細(xì)胞再生的是球狀動(dòng)脈。除此之外，心外膜能夠特異性表達(dá)對(duì)心臟再生必要的cav1蛋白及轉(zhuǎn)錄因子tcf21，其中tcf21可作用于新生血管周?chē)募?xì)胞，促進(jìn)其增生。研究發(fā)現(xiàn)心外膜細(xì)胞表達(dá)的PDGF信號(hào)是心臟再生必不可少的信號(hào)，通過(guò)Rho相關(guān)蛋白激酶介導(dǎo)誘導(dǎo)心肌纖維的產(chǎn)生和上皮細(xì)胞特征細(xì)胞-細(xì)胞接觸的減少，而在體內(nèi)抑制PDGF信號(hào)則將削弱心肌再生和新生血管的形成。Kikuchi等[19]報(bào)道在心室損傷后3h，心外膜細(xì)胞發(fā)生了顯著的形態(tài)改變，RA合成酶2(raldh2) 表達(dá)增加。1d后，raldh2的表達(dá)開(kāi)始集中于心室損傷部位周?chē)男耐饽?，而通過(guò)轉(zhuǎn)基因阻斷RA受體或者增加RA裂解酶的表達(dá)可以抑制心臟再生。另有研究者報(bào)道，在斑馬魚(yú)心臟損傷后，心外膜細(xì)胞表達(dá)纖連蛋白的同源物fn1和fn1b，而fn1基因突變的斑馬魚(yú)心臟再生能力極低。心肌細(xì)胞還可表達(dá)fgf17b，引起心外膜細(xì)胞fgfr2和fgfr4上調(diào)，而阻斷fgfr的表達(dá)后心臟無(wú)法再生，損傷區(qū)僅由疤痕組織修復(fù)。而心內(nèi)膜細(xì)胞同樣也在斑馬魚(yú)心肌再生中發(fā)揮作用。有研究者報(bào)道，心內(nèi)膜細(xì)胞在斑馬魚(yú)心臟切除后數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生急劇的形態(tài)改變，并迅速遷移到心室各層，上調(diào)心室細(xì)胞raldh2等發(fā)育基因的表達(dá)。

1.3 基于人類多能干細(xì)胞的細(xì)胞治療hESC有無(wú)限分化為心肌細(xì)胞的潛力，關(guān)鍵在于如何使hESC穩(wěn)定、持續(xù)地分化為成熟的、有功能的心肌細(xì)胞。早期的研究中hESC自發(fā)性分化為心肌細(xì)胞的效率極低(小于3%)，而后的研究中生長(zhǎng)因子的給予和技術(shù)上的進(jìn)步將心肌細(xì)胞的產(chǎn)量提升到80%以上，使胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于心臟疾病治療成為可能[20]。然而，目前由hESC分化出的心肌細(xì)胞與普通心肌細(xì)胞在表達(dá)譜和功能上仍有較大差別。目前，hESC仍是人類多能干細(xì)胞中最接近自然原態(tài)的，然而大多數(shù)hESC系已經(jīng)使用了超過(guò)10年，長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)可能使它的基因型和表型發(fā)生了累積性的改變。為了減少移植排斥反應(yīng)，目前hESC的使用僅限于基本沒(méi)有免疫反應(yīng)的器官，如眼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在梗死后動(dòng)物模型(如小鼠、大鼠、豚鼠、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等)中，hESC能夠有效改善心功能。然而在免疫抑制的恒河猴中植入由hESC分化的心臟祖細(xì)胞后，研究者觀察到了畸胎瘤的形成[21]。遺憾的是，目前其他大部分實(shí)驗(yàn)的周期較短、尚不足以正確評(píng)估畸胎瘤的形成風(fēng)險(xiǎn)。

hPGSC依舊是較為理想的細(xì)胞來(lái)源之一，它來(lái)自于未受精的卵母細(xì)胞，避免了倫理問(wèn)題；同時(shí)，它在免疫方面的優(yōu)勢(shì)使其避免了激活自然殺傷細(xì)胞。在動(dòng)物心梗后模型中植入由hPGSC分化來(lái)的心肌細(xì)胞后，心臟再生得到了促進(jìn)，且未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成。

1997年Wilmut等[21]發(fā)現(xiàn)可通過(guò)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)(SCNT)可將體細(xì)胞重編碼為多能ESCs。此后研究者們陸續(xù)實(shí)現(xiàn)了多種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的克隆，但人體細(xì)胞多能干細(xì)胞(hNT-ESC)的實(shí)現(xiàn)依舊有較大挑戰(zhàn)性。2013年有研究者報(bào)道了hNT-ESC系的成功培育，其核基因組來(lái)自于體細(xì)胞，是正常的雙倍體細(xì)胞。與之前的研究采用的是胚胎或者嬰兒體細(xì)胞不同，Chung等[22]成功地從成人體細(xì)胞培育出人NT-ESC?？紤]到需要進(jìn)行心肌細(xì)胞移植的疾患大多數(shù)發(fā)生在高齡人群，Chung的實(shí)驗(yàn)具有重要的意義。另外，年齡增長(zhǎng)帶來(lái)的更多的基因突變是hNT-ESC和iPSCs的共同缺點(diǎn)，在應(yīng)用于臨床前篩查有無(wú)編碼區(qū)基因突變具有必要性。過(guò)去曾認(rèn)為SCNT可應(yīng)用于遺傳性線粒體疾病的患者，然而最近的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，NT-ESC與宿主線粒體不匹配時(shí)會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，而解決這一問(wèn)題尚有待更多的研究。

2006年Takahashi等[23]報(bào)道了鼠成纖維細(xì)胞能在4種轉(zhuǎn)錄因子c-MYC、OCT3/4、SOX2和KLF4作用下脫分化為iPSC。2007年研究者以類似的方法獲得了人iPSC，人iPSC在體內(nèi)和體外均可以像hESC一樣分化成三胚層結(jié)構(gòu)。然而目前人iPSC的應(yīng)用仍面臨眾多障礙。首先目前重編碼的效率低至0.001%～4.400%，培育穩(wěn)定的人iPSC系并獲得足夠數(shù)量的心肌細(xì)胞需要長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的時(shí)間。另外，有證據(jù)表明小鼠的自體iPSC同樣可引起較為輕微的免疫反應(yīng)，也有研究報(bào)道到小鼠腫瘤的發(fā)生。但對(duì)于終末期心衰的患者來(lái)說(shuō)，細(xì)胞療法可能帶來(lái)的腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后依然優(yōu)于終末期心衰本身。

2 結(jié)語(yǔ)與展望

從目前的研究結(jié)果看，心臟再生的過(guò)程與胚胎時(shí)期心臟的發(fā)育有相似的過(guò)程和調(diào)控點(diǎn)，但并不完全相同。心臟再生的機(jī)制復(fù)雜，涉及細(xì)胞、DNA、RNA和細(xì)胞因子相互作用，對(duì)心臟再生的研究可能需要從單一因素到多因素，以及從細(xì)胞因子到整體細(xì)胞水平進(jìn)行，任重而道遠(yuǎn)。多能干細(xì)胞移植方面的研究成果豐碩，然而如何盡量減少移植排斥反應(yīng)、提高干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的效率仍面臨較大瓶頸，使用哪種細(xì)胞類型及采取何種方法進(jìn)行移植尚未達(dá)成共識(shí)。有理由相信，一旦成功克服心臟再生領(lǐng)域的研究應(yīng)用于臨床的困難和障礙，將改變目前終末期心衰治療手段局限、患者預(yù)后差的困境，極大地改善患者預(yù)后。

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? 述·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.038

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81470407)。

周桑(1993-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事心臟再生研究方面研究?！?/p>

E-mail:qinyongwenaixin@sina.com。

R

A

1671-8348(2017)02-0256-03

2016-07-25

2016-10-12)