液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究進(jìn)展

許海艦，劉翠哲

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究進(jìn)展

許海艦，劉翠哲△

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）；基本原理；應(yīng)用進(jìn)展

20世紀(jì)70年代，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù) 開(kāi)始出現(xiàn)，當(dāng)時(shí)的場(chǎng)解吸（FD）離子化技術(shù)雖然能測(cè)定分子量1500～2000Da的非揮發(fā)性物質(zhì)，但重復(fù)性差。后來(lái)出現(xiàn)的快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），對(duì)分子量較大的多肽類(lèi)化合物測(cè)定效果良好。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更加精密的化合物分析質(zhì)譜法—電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜法（APCI-MS）應(yīng)運(yùn)而生。本文對(duì)近年來(lái)LC-MS的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 質(zhì)譜儀器

1.1 質(zhì)譜分析法的基本原理 質(zhì)譜分析法是將物質(zhì)離子化，并按照質(zhì)荷比分離，通過(guò)測(cè)量各離子峰的強(qiáng)度達(dá)到分析目的。以檢測(cè)器檢測(cè)到的離子信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，所作的條狀圖就是常見(jiàn)的質(zhì)譜圖。

1.2 質(zhì)譜儀的組成

1.2.1 真空系統(tǒng)：由機(jī)械真空泵、擴(kuò)散泵或分子泵組成，以抽取離子源和分析器等部分的真空。只有真空度足夠高，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度降低。

1.2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)：是將所分析的樣品導(dǎo)入離子源的裝置，包括直接進(jìn)樣、加熱進(jìn)樣和參考物進(jìn)樣等。

1.2.3 離子源：是使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)，同時(shí)對(duì)帶電粒子加速，使其進(jìn)入分析器的裝置，目前使用的離子源主要是電噴霧離子源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）。（1）ESI：樣品流出毛細(xì)管?chē)娍冢陟F化氣（N2）和強(qiáng)電場(chǎng)（3-6kV）的作用下迅速霧化，產(chǎn)生高電荷液滴，伴隨液滴揮發(fā)電場(chǎng)也隨之加強(qiáng)，此時(shí)離子移至液滴表面并揮發(fā)，產(chǎn)生單電荷或多電荷離子。一般生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，小分子得[M+H]+或[M-H]-單電荷離子。（2）APCI：樣品流出毛細(xì)管，通過(guò)氮?dú)饬黛F化到加熱管中被揮發(fā)，加熱管Corona尖端放電電極使溶劑分子形成反應(yīng)氣等離子體，樣品分子和等離子體通過(guò)氫質(zhì)子交換被電離，形成[M+H]+或[M-H]-進(jìn)入質(zhì)譜儀。

1.2.4 質(zhì)量分析器：現(xiàn)有的質(zhì)量分析器有串聯(lián)四極、三重四極桿分析器等。

1.2.5 檢測(cè)接收器：是接收離子束流的裝置，包括電子倍增器、光電倍增器和微通道板。

2 LC-MS分析條件的選擇

2.1 離子源的選擇 ESI是最軟的電離技術(shù)，適合分析中極性、強(qiáng)極性化合物分子，尤其是在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子。APCI亦為軟電離技術(shù)，適合分析弱極性小分子物質(zhì)，不適合分析帶多個(gè)電荷的大分子。

2.2 正、負(fù)離子模式的選擇 正離子模式用于分析堿性樣品，樣品由甲酸或乙酸酸化后進(jìn)行分析。樣品中含仲氨或叔氨的應(yīng)優(yōu)先考慮使用正離子模式。負(fù)離子模式用于分析酸性樣品，由三乙胺或氨水堿化樣品后分析，適合分析含較多強(qiáng)伏電性基團(tuán)的樣品，如含氯、含溴或多個(gè)羥基時(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式。

2.3 流動(dòng)相的選擇 常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水及不同比例的混合物，或一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，還可通過(guò)加入酸、堿調(diào)節(jié)pH值。LC-MS接口須避免進(jìn)入不揮發(fā)性、含磷和氯的緩沖液；流動(dòng)相中含鈉和鉀的成分應(yīng)＜lmmol/L，醋酸銨＜5mmol/L，甲酸＜2%、三乙胺＜l%、三氟乙酸0.5%。進(jìn)樣前，為達(dá)到基本分離，應(yīng)摸好液相條件，且緩沖體系應(yīng)符合質(zhì)譜要求。

2.4 流量和色譜柱的選擇 不加熱ESI目前一般用lmm～2.1mm內(nèi)徑微柱，最佳流速(1～50)μl/min；采用內(nèi)徑4.6mm的LC柱時(shí)要求柱后分流。APCI常規(guī)使用直徑4.6mm的色譜柱，最佳流速lml/min；小于100mm的短柱可提高分析效率，節(jié)省定量分析的時(shí)間。

3 LC-MS的應(yīng)用進(jìn)展

3.1 雜質(zhì)的分析 藥物在生產(chǎn)、運(yùn)輸和保存過(guò)程中，容易引入或自身產(chǎn)生無(wú)治療作用、影響藥物穩(wěn)定性和療效的雜質(zhì)，甚至對(duì)人體健康有害的物質(zhì)。雜質(zhì)通常量低、種類(lèi)多，結(jié)構(gòu)和主藥類(lèi)似，很難檢測(cè)。雜質(zhì)的一般檢測(cè)方法有TLC、HPLC、NMR和IR，但靈敏度低，在雜質(zhì)控制方面的應(yīng)用受到限制[1]。LC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜的高分離性和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性，能提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息，極大地推動(dòng)了雜質(zhì)研究的發(fā)展[2]。

頭孢菌素是最常用的抗生素，具有高效、低毒的特點(diǎn)[3]。頭孢菌素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在生產(chǎn)和運(yùn)輸過(guò)程中易產(chǎn)生一系列降解產(chǎn)物和聚合物，從而失去抗菌活性，甚至產(chǎn)生毒性，在生產(chǎn)過(guò)程中要嚴(yán)格控制雜質(zhì)的量。LC-MS聯(lián)用技術(shù)在頭孢菌素降解產(chǎn)物[4]、食品中殘留物[5]和生物樣品中代謝產(chǎn)物[6-7]等檢測(cè)方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。Rourick等[4]人用液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法考察了在酸、堿等不同條件下頭孢羥氨芐的降解規(guī)律，解析了可能的降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，包括△3-異構(gòu)體、7S構(gòu)型的差向異構(gòu)體、開(kāi)環(huán)物、哌嗪二酮衍生物、頭孢羥氨芐亞砜等。

隨著LC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，其在雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用更加廣泛，尤其是原料藥雜質(zhì)譜的分析，在對(duì)藥物中存在的已知雜質(zhì)進(jìn)行鑒別的同時(shí)，也可推導(dǎo)未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。楊昊等[8]用高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI-IT-MSn）法建立了慶大霉素Cla雜質(zhì)譜的分析方法，結(jié)果顯示慶大霉素Cla可與主要雜質(zhì)分離，并從慶大霉素Cla的原料中檢測(cè)出13個(gè)雜質(zhì)，解析了其中12個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，主要是慶大霉素A、B、小諾霉素、西索米星、威達(dá)米星或其同分異構(gòu)體和同系物，以及慶大霉素Cla和上述雜質(zhì)的降解產(chǎn)物。

飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF-MS）為高靈敏度、高選擇性的高分辨質(zhì)譜，能得到高質(zhì)量質(zhì)譜圖，以及化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量，適合大分子化合物的分析[9]。崔宏霞等[10]建立了液相高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-TOF/HR-MS）法，按照英國(guó)和美國(guó)藥典規(guī)定的可能有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)對(duì)比，初步鑒定了氯吡格雷的18個(gè)主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，且將雜質(zhì)分成了4類(lèi)。Wang等[11]用液相飛行質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜（LC-TOF/MS-IT/MS）法對(duì)羅紅霉素中19個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜碎片的分析，歸屬了所有雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Adouani等[12]在地奧司明有關(guān)物質(zhì)研究中，根據(jù)LC-MS和四級(jí)桿-飛行時(shí)間（Q-TOF）質(zhì)譜法的結(jié)果，推斷出了一種新雜質(zhì)。Raman等[13]采用LC-MS/MS和液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-TOF/MS）法對(duì)依折麥布制備工藝中產(chǎn)生的雜質(zhì)I進(jìn)行了初步分析，推測(cè)其結(jié)構(gòu)為2-(4-鄰羥芐基)-N，5-順-(4-氟代苯基)-5-羥基戊酰胺，并用NMR和IR進(jìn)一步確證。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究 藥物動(dòng)力學(xué)研究需對(duì)生物樣品中微量乃至痕量成分作定量分析。目前，藥物的研制趨于低劑量，采用常規(guī)的分離檢測(cè)技術(shù)很難準(zhǔn)確定量復(fù)雜介質(zhì)中的痕量成分。LC-MS技術(shù)為體內(nèi)藥物分析中的藥代動(dòng)力學(xué)、藥物代謝的研究提供了一種高效、可靠的分析手段。

尼莫地平為1，4-二氫吡啶類(lèi)鈣離子拮抗劑，對(duì)腦組織受體有高度選擇性，容易透過(guò)血腦屏障，能通過(guò)有效地阻止鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、抑制平滑肌收縮，達(dá)到解除血管痙攣的目的，從而保護(hù)腦神經(jīng)元、穩(wěn)定腦神經(jīng)元的功能及增進(jìn)腦血灌流，改善腦供血，提高腦組織對(duì)缺氧的耐受力。吳華等[14]建立了測(cè)定人體血漿中尼莫地平含量（尼群地平為內(nèi)標(biāo)）的LC-MS法，研究20名健康男性志愿者口服尼莫地平受試制劑和參比制劑后的藥物動(dòng)力學(xué)，為臨床用藥提供指導(dǎo)。

羥基紅花黃色素A[15]（hydroxysafflor yellow A）是具有單查爾酮苷類(lèi)結(jié)構(gòu)的化合物，是紅花藥理功效最高的水溶性部位，可抑制血小板激活因子誘發(fā)的血小板聚集與釋放，競(jìng)爭(zhēng)性抑制血小板激活因子與血小板受體的結(jié)合。李長(zhǎng)印等[16]建立了液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（SPE-LC-MS/MS）法測(cè)定人血漿中羥基紅花黃色素A（QA）濃度的分析方法。

頭孢克肟（Cefixime）為口服第三代頭孢菌素類(lèi)抗生素，主治敏感菌所致呼吸、泌尿和膽道等部位的感染。為研究頭孢克肟是否適合聯(lián)用其它藥物用于口腔科感染性疾病，黃開(kāi)明等[17]建立了LC-MS/MS法測(cè)定大鼠尾靜脈注射頭孢克肟后不同時(shí)間點(diǎn)在口腔組織分布情況和藥動(dòng)學(xué)特征，以期為臨床規(guī)范、合理用藥提供理論依據(jù)。

體內(nèi)一氧化氮與活性氧反應(yīng)生成的過(guò)氧亞硝基陰離子，可影響體內(nèi)蛋白、脂質(zhì)和DNA的硝化和氧化，且極不穩(wěn)定，很難定量。據(jù)報(bào)道，過(guò)氧亞硝基陰離子能與游離或結(jié)合型色氨酸反應(yīng)，生成3-硝基色氨酸，穩(wěn)定性良好，故3-硝基色氨酸被廣泛用作體內(nèi)產(chǎn)生活性氮的生物標(biāo)記。但硝基化色氨酸量的增加，會(huì)影響相關(guān)蛋白和細(xì)胞的功能，并引發(fā)多種代謝性疾病。同時(shí)，各組織中的3-硝基色氨酸量低，含量差異大，在體內(nèi)很難對(duì)其準(zhǔn)確定量。Li等[18]建立了用LC-MS/MS測(cè)定3-硝基色氨酸的分析方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)色氨酸和3-硝基色氨酸的分離。

4 展望

LC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜的高分離性和質(zhì)譜的強(qiáng)鑒別力，專(zhuān)屬性高，對(duì)多數(shù)藥物的檢測(cè)靈敏度優(yōu)于其它分析方法，定量測(cè)試速度亦明顯加快。該技術(shù)可解析混合物中微量組分的結(jié)構(gòu)，達(dá)到現(xiàn)代體內(nèi)藥物分析研究中高通量和高精度的要求，成為了藥代動(dòng)力學(xué)和藥物代謝研究的核心分析技術(shù)。隨著現(xiàn)代高新技術(shù)的不斷發(fā)展，LC-MS聯(lián)用技術(shù)必將在體內(nèi)藥物分析的研究中擁有不可或缺的地位。

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R927.2

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1004-687（92017）06-0513-04

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2017-03-26）