植物、微生物對氮的吸收利用比較及微生物群落解析

楊 毅，陶 權(quán)，梁 英，李成樂，李 躍，馬效芳

(1．四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065；2．四川省交通運(yùn)輸廳公路規(guī)劃勘察設(shè)計研究院，成都 610041)

水環(huán)境污染主要來自于點(diǎn)源和面源兩種不同類型的污染源排放，點(diǎn)源污染被逐漸控制之后，面源污染已成為水環(huán)境污染的關(guān)鍵因素，由其所導(dǎo)致的水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象，已嚴(yán)重威脅著水環(huán)境生態(tài)安全[1-3]。近年來，伴隨著我國城市內(nèi)澇現(xiàn)象的頻發(fā)，城市面源污染問題也逐漸成為人們普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。國內(nèi)外都對城市的面源污染開展了研究工作，發(fā)現(xiàn)我國城市由于降雨徑流沖刷造成的污染相比于國外更加嚴(yán)重[4, 5]，其攜帶的污染物對受納水體的污染貢獻(xiàn)相當(dāng)大[6, 7]。特別是我國大中型城市降雨徑流中NH+4-N污染惡化趨勢十分明顯[8-11]，成為普遍和突出的水質(zhì)污染問題之一。

人工濕地、生物滯留池和生物濾池等基于生態(tài)工程的水處理系統(tǒng)被越來越多地被應(yīng)用于城市面源氮素污染的處理[12]，此類系統(tǒng)去除N的主要方式包括微生物代謝和植物吸收[13]。 張榮社等[14]通過現(xiàn)場監(jiān)測人工濕地的脫N效果發(fā)現(xiàn)植物對N的吸收量有限。Geronimo等[15]研究結(jié)果表明生物滯留池中植物對N的吸收并不是去除N的主要途徑。但是也有報道證明植物的直接吸收對N的去除起到重要作用[16]。張鴻[17]等則發(fā)現(xiàn)人工濕地中植物不僅可以直接吸收N，其根系分泌物還可以促進(jìn)嗜N菌的生長，從而促進(jìn)N的釋放轉(zhuǎn)化。根際微生物數(shù)量也與培養(yǎng)液中N的濃度和植物生物量有關(guān)[18]。植物還能通過莖葉將光合作用產(chǎn)生的氧氣一部分輸送到根區(qū)部位[19]，使根系微環(huán)境存在好氧和缺氧環(huán)境，從而使微生物提高反硝化作用[20]。Hatt[21]和Henderson[22]等研究發(fā)現(xiàn)在生物滯留池對N的去除過程中，植物和微生物起到關(guān)鍵的作用，缺少植物和微生物，滯留池內(nèi)的填料可能成為一個不斷釋放污染物的污染源。Payne[23]等分析了生物濾池里影響N循環(huán)的主要因素，發(fā)現(xiàn)植物-微生物的相互作用以及植物根系的形態(tài)是影響N去除的關(guān)鍵因素。

微生物過程被認(rèn)為是生態(tài)工程水處理系統(tǒng)中脫N尤其是去除NH+4-N的原動力，永久去除N主要依靠硝化-反硝化途徑[13, 14, 24]，但是傳統(tǒng)的自養(yǎng)硝化、厭氧反硝化理論不足以解釋復(fù)雜環(huán)境下N的遷移轉(zhuǎn)化問題，異養(yǎng)硝化、好氧反硝化的發(fā)現(xiàn)提供了新的理論補(bǔ)充。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，環(huán)境中微生物的研究方法已經(jīng)跳出了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)限制[25]。宏基因組作為一種分子生物學(xué)新技術(shù)，能夠更全面、更深入地解析微生物群落結(jié)構(gòu)[26]，盡可能真實(shí)地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性。由于宏基因組技術(shù)數(shù)據(jù)量龐大，需要高通量測序技術(shù)作為依托[27]。目前普遍應(yīng)用的高通量測序技術(shù)主要有Roche/454焦磷酸測序、ABI/SOLiD連接酶測序和Illumina/ Solexa聚合酶合成測序[28, 29]。

微生物和植物是生態(tài)工程水處理系統(tǒng)中非常關(guān)鍵的部分，在對營養(yǎng)鹽的去除中起到了至關(guān)重要的作用，但以往的研究對于N在包含植物、微生物的完整生態(tài)體系各部分中遷移轉(zhuǎn)化的定量研究需要拓展，從而進(jìn)一步了解微生物、植物對于N去除和利用的貢獻(xiàn)。過去對于植物-微生物系統(tǒng)中微生物研究的尺度與深度不夠，本文借助高通量宏基因組Solexa聚合酶合成測序技術(shù)研究了該系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)，旨在分析微生物與植物在系統(tǒng)中的聯(lián)合作用機(jī)理，為強(qiáng)化生態(tài)工程水處理系統(tǒng)的水質(zhì)凈化效果積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物和微生物

選用植物為具有良好抗?jié)?、抗旱性的混播草。微生物來自于植物根系及周圍的土壤?/p>

1.1.2 液體培養(yǎng)基

雨水中COD含量普遍較高[30]，采用葡萄糖模擬雨水COD的方法，添加的葡萄糖濃度為500 mg/L，對應(yīng)COD濃度為533 mg/L；植物需求營養(yǎng)成分按霍格蘭營養(yǎng)液[31]配制；根據(jù)成都市土壤中有效磷的含量(7.35 mg/kg)以及土壤容重(1.4 g/cm3)得到土壤總磷的含量為10.29 mg/L。最終液體培養(yǎng)基的主要成分與質(zhì)量濃度：葡萄糖，500 mg/L；CaCl2，184.96 mg/L；KCl，124.25 mg/L；MgSO4，80.24 mg/L；KH2PO4，45.36 mg/L；FeCl3·6H2O，1.62 mg/L。

1.1.3 微生物抑制劑

分別將80、100萬單位(1單位=1 μg)的青、鏈霉素溶液溶解到500 mL容量瓶里，再分別取31.25、25 mL上述溶液至500 mL容量瓶中，配制成濃度為10 萬單位/L的微生物抑制劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計200、400、600 mg/L 3種不同NH+4-N濃度下的培養(yǎng)液，共設(shè)計4個大組，植物+微生物、植物、微生物和空白組?？瞻捉M只設(shè)計NH+4-N濃度為400 mg/L的裝置，其余組各下設(shè)3種不同NH+4-N濃度的裝置。實(shí)驗(yàn)裝置塑料杯上、下底直徑及高分別為9.5、6.7和6.5 cm，用錫箔紙將塑料杯包裹，所有裝置均放置于室內(nèi)，并保證有足夠的自然光照。為了減少溶液的揮發(fā)，塑料杯上裝有不透光的杯蓋，植物根系可以穿過杯蓋浸泡在培養(yǎng)液中。

各組別塑料杯中加入的物質(zhì)與含量如表1所示。加入的微生物取自由土壤浸泡液制成的微生物懸浮液，液體培養(yǎng)基與微生物懸浮液的體積比為9∶1；微生物抑制劑青霉素和鏈霉素溶液各加入5 mL；植物取樣后用超純水反復(fù)對根系沖洗并用液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)植物一周，在實(shí)驗(yàn)開始后的65 h再放入到裝置里。每隔一定時間向裝置里加入適量純水，以保持溶液體積的恒定。

表1 各組加入的物質(zhì)及含量Tab.1 Material and content of each group

1.2.2 取樣方法

實(shí)驗(yàn)時間為2016年1月12日-2016年3月16日，總計1 536 h(64 d)。培養(yǎng)液中NH+4-N、NO-3-N、NO-2-N的測定采用耗竭法，NH+4-N采樣時間分別為3、20、45、96、138、187、307、1 128、1 536 h，NO-x-N采樣時間為307、1 128、1 536 h，每次取5 mL的培養(yǎng)液，經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后測定，最后數(shù)據(jù)處理時需要從N的減少量中扣除取樣造成的損失，植物體TN、微生物濕重測定需等實(shí)驗(yàn)結(jié)束后方能開始。

1.2.3 高通量測序樣品預(yù)處理

對NH+4-N濃度為400 mg/L的微生物、空白組水樣進(jìn)行處理，混勻原始樣品，樣品足夠時，取4 mL液體樣品，分多次加入滅菌的2 mL離心管中，10 000 rpm室溫離心3 min，棄置上層液體，倒置離心管于吸水紙上，直至沒有液體流出；樣品不足4 mL就全部離心。

1.3 分析項(xiàng)目與檢測方法

1.3.1 主要指標(biāo)測定

NH+4-N：參照《水質(zhì)氨氮的測定水楊酸分光光度法(HJ 536-2009)》；植物體TN測定方法：采用濃硫酸-過氧化氫消煮，過硫酸鉀氧化吸光光度法測定[32]；微生物重量采用濕重法測定[33]；NO-x-N：參照瑞士萬通792 Basic IC離子色譜儀使用說明書；pH采用pHB-4便攜式pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定；溶解氧采用LDO便攜式溶氧儀(美國哈希)測定；鏡檢實(shí)驗(yàn)采用OLYMPUS CX41光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.2 高通量宏基因測序分析

1.3.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及DNA純化回收

本實(shí)驗(yàn)委托上海生工生物工程股份有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程為：采用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行提取基因組DNA，采用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。PCR第一輪擴(kuò)增，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量，細(xì)菌擴(kuò)增V3-V4區(qū)域通用引物為341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)，真菌擴(kuò)增NS1-FUNG區(qū)域通用引物為NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和Fung(ATTCCCCGTTACCCGTTG)；第二輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。DNA純化回收，對于細(xì)菌擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)處理，對于真菌PCR產(chǎn)物和其他擴(kuò)增片段小于400 bp的PCR產(chǎn)物，選用0.8倍的磁珠處理。定量混合，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1的等量混合后測序，等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測序濃度為20 pmol。

1.3.2.2 基于Illumina平臺的16S rDNA、18S rDNA宏基因組測序

獲得DNA樣品后采用在Illumina Miseq平臺上進(jìn)行雙端測序。細(xì)菌和真菌采用質(zhì)量控制軟件Prinseq，拼接軟件分別采用FLASH和PEAR對樣品去除引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列，完成對樣品序列的質(zhì)量控制。細(xì)菌質(zhì)量控制后序列長度大部分分布在400～600 bp之間，平均長度為440 bp以上，各樣本序列數(shù)均在500以上，滿足基本分析要求。細(xì)菌和真菌分別利用Mothur、Usearch軟件去除序列中的嵌合體。將多條序列按其序列間的距離，細(xì)菌通過Uclust軟件、真菌通過Usearch軟件進(jìn)行聚類分成操作分類單元(OTU)，相似度定為97%。對處理后序列進(jìn)行物種分類，采用軟件為RDP classifier，分類閾值為0.8。通過Mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，衡量樣本物種多樣性以及組間樣本差別。

2 結(jié)果與討論

2.1 N在植物、微生物作用下的遷移轉(zhuǎn)化

2.1.1 不同組別pH值、溶解氧變化

各組別pH值隨時間的變化如圖1所示，隨著時間增加，除微生物組pH值在1 080 h(45 d)時有明顯上升外，所有組別pH值剛開始都下降，而后逐漸趨于平緩，NH+4濃度的大小對pH值變化基本沒有影響。實(shí)驗(yàn)剛開始由于液體培養(yǎng)基的pH值為6.37，微生物懸浮液pH值為8.07，造成微生物、植物+微生物組的pH值要明顯高于植物、空白組，但是隨著時間的增加，這種差距逐漸減小。

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，各組別溶解氧濃度隨時間的變化范圍較大。實(shí)驗(yàn)剛開始18 h內(nèi)，含有微生物組別的溶解氧水平遠(yuǎn)低于不含微生物組別，65 h時恢復(fù)到和不含微生物的組別一樣的水平。添加植物后，植物、微生物、植物+微生物組溶解氧水平持續(xù)降低至185 h，且植物+微生物比微生物、植物組溶解氧降低更多，而后又開始上升。

2.1.2 培養(yǎng)液中NH+4-N濃度隨時間的變化

各組別NH+4-N濃度隨時間的變化如圖3所示。所有組別均表現(xiàn)出剛開始250 h內(nèi)快速降低，而后緩慢下降，且植物+微生物、植物組要比微生物、空白組降低更多且速率更快。NH+4-N初始濃度為200 mg/L時，植物+微生物、植物組約從200降至100 mg/L以下，而微生物組約從200降至150 mg/L左右；初始濃度為400 mg/L時，植物+微生物、植物組約從400降至150 mg/L左右，而微生物、空白組約從400降至250 mg/L左右；初始濃度為600 mg/L時，植物+微生物、植物組約從600降至250 mg/L左右，而微生物組約從600降至400 mg/L左右。可知植物+微生物、植物組隨著NH+4-N濃度的增加，其對NH+4-N的利用也越多。實(shí)驗(yàn)后期植物+微生物組培養(yǎng)液中NH+4-N濃度最低，其次為植物、微生物組，且植物+微生物組的NH+4-N仍有持續(xù)降低的趨勢，對NH+4-N的去除效率為：植物+微生物>植物>微生物。

圖1 培養(yǎng)液中pH值隨時間的變化 Fig.1 Changes of pH in the culture solution

圖2 培養(yǎng)液中溶解氧隨時間的變化Fig.2 Changes of DO in the culture solution

圖3 培養(yǎng)液中NH+4-N濃度隨時間的變化 Fig.3 Concentration variation of NH+4-N in the culture solution

2.1.3 不同組別植物各部位對N的吸收利用

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過測定植物葉、莖、根含N量，與實(shí)驗(yàn)開始時保存的植物原樣進(jìn)行對比，可知植物在不同NH+4濃度及微生物環(huán)境下對N的吸收利用效果。以往研究表明植物不同部位對N的積累量不同，盧少勇等[34]發(fā)現(xiàn)處于生長期的植物，地上部N含量高于地下部，但是衰亡期N會轉(zhuǎn)移到地下部；也有研究[35]發(fā)現(xiàn)地上部對N的積累和地下部相等，所以有必要對混播草不同部位的含N量進(jìn)行測定。如圖4所示，所有組別的植物總N量均高于原樣，且植物+微生物含N量高于植物組，特別是NH+4-N濃度為200 mg/L的組別，植物+微生物含N量比植物組高13.8 mg/g。除此之外，植物各部位含N量的特點(diǎn)為：莖、葉含N量之和大于根含N量，N含量主要集中在莖、葉處。

圖4 植物各部位含N量 Fig.4 Content of N in different part of plant 注：圖中Z-400，Z代表植物，400代表NH+4濃度為400 mg/L，其他相同。

為考慮植物對N的吸收情況，結(jié)合植物原樣重量和含N量，植物各部位吸收N量如圖5所示，植物+微生物吸收量均大于植物組，特別是NH+4-N濃度為200 mg/L的組別，植物+微生物組對N的吸收多出4.48 mg，說明微生物可以一定程度促進(jìn)植物對N的吸收利用。植物可以通過根系為微生物提供氧氣，同時根系分泌物也可作為微生物的碳源，為微生物生長創(chuàng)造良好的環(huán)境，同時微生物可以為植物提供各種形式的N，有利于植物的吸收，所以植物+微生物比單純的植物更能促進(jìn)N的轉(zhuǎn)化利用。

圖5 植物各部位吸收N量Fig.5 Content of the absorbed N in different part of plant

2.1.4 不同組別微生物對N的同化利用

實(shí)驗(yàn)過程中在微生物組培養(yǎng)液中觀察到了白色絮狀體，為衡量微生物同化作用對N的利用效果，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時通過濕重法得到微生物的重量，假設(shè)微生物干重∶濕重為1∶10，微生物細(xì)胞干重含N量為12.5%[36]，得到細(xì)胞含N量，視為微生物同化作用利用的N。如圖6所示，所有組別中均有微生物存在，且對所有不同NH+4濃度的組別，微生物濕重的大小依次為：植物+微生物>微生物>植物，微生物組中NH+4濃度為400 mg/L的組別中微生物生長狀況最好。植物+微生物組中植物能為微生物提供附著場所和氧氣，植物可生成發(fā)達(dá)的根系形成巨大的表面積[24]且其在根系周圍形成根系生物圈增加微生物生物量[16]，所以微生物濕重值比微生物組高；植物組由于微生物抑制劑的作用，微生物生長緩慢，所以濕重相對較低。

圖6 微生物的濕重 Fig.6 The wet weight of microorganism

2.1.5 不同組別微生物硝化/反硝化對N的利用

通過分析各組別NO-2、NO-3濃度隨時間的變化，可以得到微生物硝化甚至反硝化的能力。不同NH+4-N濃度下，培養(yǎng)液中NO+x含量隨時間的變化如圖7所示。在所有時間段各組別都檢測到了NO-2，NO-3在實(shí)驗(yàn)的后期被檢測到。13 d時所有組別都檢測到NO-2，濃度約為1～2 mg/L，NO-3只在NH+4-N濃度為200 mg/L的植物組少量檢測到，說明具有硝化功能的微生物開始作用；47 d時所有微生物組都檢測出了NO-3和NO-2，濃度分別約3～4和1～2 mg/L，NO-2相比之前略有增加。植物組NO-2濃度略微增加，但NO-3未被檢出，植物+微生物組與之相同，但在NH+4-N濃度為600 mg/L的組別檢測到少量NO-3，由于根系能夠利用NH+4和NO-3，從而可能導(dǎo)致有植物的組別NO-3幾乎沒有產(chǎn)生的假象；64 d時，除空白組外，其余組都檢測到NO-3和NO-2，微生物組兩者之和低于之前，而植物、植物+微生物組則相反其中NO-2濃度降低，NO-3增加，微生物組NO-3濃度的顯著降低預(yù)示了反硝化作用的存在，而植物、植物+微生物組NO-3增加可能是之前積累的NO-2通過微生物被氧化成NO-3。總之，培養(yǎng)液中NO-x濃度復(fù)雜的變化現(xiàn)象預(yù)示了微生物、植物對N利用的活躍性。

圖7 不同NH+4-N濃度培養(yǎng)液中NOx-的變化 Fig.7 Concentration variation of NOx- in the different culture solution

2.1.6 N遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律

通過對培養(yǎng)液各形態(tài)N濃度、植物體TN含量的測定，根據(jù)微生物含N量占其濕重的百分比估算其同化利用的N，由物料平衡[16]得到植物-微生物系統(tǒng)對N的轉(zhuǎn)化利用關(guān)系：培養(yǎng)液NH+4-N減少量=植物吸收N量+硝化作用生成NO-x-N+微生物同化作用利用N量+氨氮揮發(fā)量+反硝化利用N量，其中NH+4-N減少量已經(jīng)扣除了取樣造成的損失，由于冬季氨氮揮發(fā)速率相當(dāng)?shù)?，所以此?shí)驗(yàn)取氨氮揮發(fā)量為其減少量的1%[37, 38]。做出各組別N的遷移轉(zhuǎn)化，結(jié)果如表2所示，再做出各途徑所占百分比，如圖8所示。

通過分析表2可知，植物、微生物對NH+4-N濃度降低的貢獻(xiàn)大小依次為：植物+微生物>植物>微生物組，降低量分別為25.01～39.97、11.88～40.96、4.62～8.97 mg，對應(yīng)降低率為38.46%～55.39%、32.90%～37.22%和4.53%～12.83%。植物吸收N量大小順序?yàn)椋褐参?微生物>植物組，吸收量分別為8.18～8.69和4.21～8.59 mg，對應(yīng)吸收率為7.87%～19.24%、5.66%～11.66%。各組微生物硝化能力無法比較，因?yàn)楦鹘M存在的反硝化作用和植物對N的吸收利用會導(dǎo)致硝化作用產(chǎn)物的濃度降低，所以表中只列出了NO-x-N 的生成量。同化作用利用N能力的大小依次為：植物+微生物>微生物>植物組，利用量分別為2.12～3.78、1.64～2.29和1.13～1.49 mg。通過反硝化對N的去除能力大?。褐参?微生物>植物>微生物組。

由圖8分析可知，在NH+4-N的轉(zhuǎn)化利用中，植物、植物+微生物組主要通過反硝化作用及植物的吸收利用來實(shí)現(xiàn)，其中反硝化作用貢獻(xiàn)最大，為49%～79%，其次植物吸收為15%～37%；而微生物組主要通過反硝化和同化作用來實(shí)現(xiàn)，分別為51%～62%、26%～36%。

圖8 各途徑比例圖 Fig.8 The fate of N in different groups

2.2 植物-微生物系統(tǒng)去N機(jī)理

2.2.1 植物體凈重變化

通過測定植物凈重判斷不同組植物的長勢。如圖9所示，經(jīng)過64 d的生長，所有組別植物凈重均大于實(shí)驗(yàn)開始時原樣凈重，增加了4～5倍，長勢正常[20]。相同NH+4-N濃度下，植物組中植物凈重大于植物+微生物組。隨著NH+4-N濃度增加，植物+微生物組微生物濕重分別是植物組的2.52、2.53和1.84倍，吸收N量分別為2.06、0.99和1.31倍，植物吸收N量倍數(shù)并沒有隨著微生物濕重倍數(shù)升高而變大。蔣先軍等[39]在研究植物根系微生物硅酸鹽細(xì)菌的代謝產(chǎn)物對植物生長的促進(jìn)作用中發(fā)現(xiàn)，低濃度代謝物可促進(jìn)植物生長，而高濃度代謝物作用則相反，微生物可通過其分泌物抑制植物對營養(yǎng)的有效吸收。

表2 各組N遷移轉(zhuǎn)化Tab.2 The migration and transformation of N in each group

圖9 不同組植物體烘干凈重 Fig.9 Dry weight of plant in different group

2.2.2 宏基因組測序

實(shí)驗(yàn)過程中所有溶液均有白色絮狀物產(chǎn)生，通過對培養(yǎng)液中微生物進(jìn)行鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)微生物組含有大量的菌膠團(tuán)和有隔菌絲，空白組以絲狀菌和有隔菌絲為主，溫東輝[36]在模擬生物沸石柱處理雨水的動態(tài)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)沸石表面會出現(xiàn)以絲狀菌為主的白色絮狀物，并通過需N微生物純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硝化過程屬于異養(yǎng)硝化，起硝化作用的微生物包含真菌。

2.2.2.1 微生物種群多樣性分析

樣本中Coverage值體現(xiàn)了微生物測序后組裝得到的基因組序列占整個基因組的比例，如表3所示，本研究Coverage值均大于95%，能確保測序結(jié)果代表樣品中的微生物組成。豐富度指數(shù)ACE和Chao1值越大則群落豐富度越高；多樣性指數(shù)Shannon值越大則群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大則群落多樣性越低。從表中可以看出微生物組細(xì)菌豐富度和多樣性均高于空白組，微生物組真菌多樣性高于空白組，豐度則略低于空白組。與其他研究[25, 40]對土壤細(xì)菌的測試結(jié)果相對比可知，本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌種群豐度要高，而多樣性卻要低，可能由于培養(yǎng)液中較高的NH+4-N和葡萄糖濃度造成某些異養(yǎng)菌過度繁殖而自養(yǎng)菌卻無法生長。就群落水平而言，種群多樣性高的群落包含更多具有不同生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性的種群，系統(tǒng)穩(wěn)定性更強(qiáng)[27]。

表3 不同樣本的Alpha多樣性Tab.3 Alpha diversity of the different samples

2.2.2.2 16S rDNA序列在門分類層面上的特征

本研究通過高通量測序技術(shù)從微生物組獲得17446條高質(zhì)量序列，從空白組獲得15936條高質(zhì)量序列，經(jīng)項(xiàng)目分析，得到微生物組細(xì)菌由16個門、105個屬組成，空白組細(xì)菌由13個門、66個屬組成。在門分類水平的序列數(shù)和相對豐度如表4所示。其中，微生物組優(yōu)勢類群為變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和藍(lán)藻門，相對豐度分別占細(xì)菌群落的70.74%、26.72%、1.07%和0.95%；而空白組以變形菌門最為豐富，其次為酸桿菌門，分別占96.59%和2.97%。微生物測序結(jié)果和其他土壤類似，群落主要以變形菌門和酸桿菌門為主[25, 41]。另外，培養(yǎng)液較低的pH值也有利于某些酸桿菌的生長。

2.2.2.3 16S rDNA序列在屬分類層面上的特征

深入解析植物-微生物系統(tǒng)的微生物種群結(jié)構(gòu)，揭示在N遷移轉(zhuǎn)化中起決定作用的細(xì)菌，將在屬分類水平相對豐度較大和兩組之間豐度存在顯著差異的菌種列出并進(jìn)行特征描述。如表5所示，可見微生物組優(yōu)勢菌屬為Burkholderia、Terriglobus、Rhodanobacter、Acidisoma和Rhizobium，相對豐度分別占細(xì)菌群落的30.78%、26.02%、23.56%、9.64%和1.37%。其中Burkholderia、Rhodanobacter、Acidisoma和Rhizobium屬于變形菌門，Terriglobus屬于酸桿菌門。兩組中物種豐度較大的菌屬，Rhodanobacter、Burkholderia、Terriglobus和Acidisoma，多數(shù)可在pH值為3～6的酸性、偏鹽環(huán)境中生長，培養(yǎng)液低pH和高鹽環(huán)境決定了以上菌屬相比其他菌屬具有更顯著的生長優(yōu)勢。微生物組中優(yōu)勢菌屬基本上都屬于化能異養(yǎng)型；Rhodanobacter、Rhizobium、Psedomonas、Bacillus屬具有脫氮固氮功能，Nitrospira、Leifsonia、Afipia屬能夠?qū)喯跛嵫趸上跛帷?/p>

表4 細(xì)菌在門水平上的分布Tab.4 Taxonomic compositions of bacterial communitiesat the phylum level

菌種鑒定表明培養(yǎng)液中幾乎不存在硝化細(xì)菌，而培養(yǎng)液中又檢測到NO-3和NO-2，另外根據(jù)N在植物、微生物環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化關(guān)系可知，培養(yǎng)液中有相當(dāng)一部分N是通過反硝化作用去除。Rhodanobacter屬可以在缺氧條件下以NO-3、NO-2和N2O為電子受體而以葡萄糖、乙酸為電子供體將它們還原為N2[42]；Rhizobium sp.可以實(shí)現(xiàn)同步硝化/反硝化，魏巍等[43]從水庫底泥篩選出此根瘤菌，發(fā)現(xiàn)其具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用在硝化過程中NO-3、NO-2并沒有大量積累；Psedomonas屬也被證實(shí)具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能[44]；Bacillus屬在降解有機(jī)物和氨氮方面具有極大潛力，另外也可以利用NO-2反硝化生成N2。

表5 細(xì)菌在屬水平上的分布(僅列出了兩組中占有比例較多的屬)Tab.5 Taxonomic compositions of bacterial communities at the genus level

注：上述各菌屬的特征描述來源于中、外文獻(xiàn)和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第八版)》。

2.2.2.4 18S rDNA序列在屬分類層面上的特征

真菌在N循環(huán)過程中扮演重要角色[52]，酸性土壤中硝化作用的主要承擔(dān)者包括真菌，反硝化真菌能夠?qū)O-3、 NO-2還原為N2O，并可通過真菌協(xié)同反硝化作用產(chǎn)生N2，另外，菌根真菌在植物對N的吸收中也起到關(guān)鍵作用[53]。真菌能夠在各種濃度O2供應(yīng)條件下生存，高濃度時進(jìn)行有氧呼吸，低濃度時進(jìn)行NO-3呼吸，完全厭氧時進(jìn)行氨發(fā)酵[54]。

通過高通量測序技術(shù)從微生物組獲得46073條高質(zhì)量序列，從空白組獲得50580條高質(zhì)量序列，經(jīng)項(xiàng)目分析，微生物組真菌由25個屬組成，空白組由23個屬組成。相對豐度如圖10，僅列出了樣品中相對豐度大于0.2%和參與N循環(huán)的屬。微生物組中優(yōu)勢類群為Penidiella、Gibberella、Phaeosphaeria、Coniochaeta、Inonotus、Talaromyces 、Botryotinia，相對豐度分別占真菌群落的31.37%、18.16%、17.85%、14.99%、9.28%、2.83%、2.67%。Gibberella屬能在低氧壓條件下利用復(fù)雜的ATP產(chǎn)能系統(tǒng)進(jìn)行反硝化作用[55]，Talaromyces屬進(jìn)行反硝化作用的產(chǎn)物除了N2O、更多為NO[56]，兩者累積占真菌總數(shù)的20.83%；此外，Penicillium、Kluyveromyces、Rhizopus、Alternaria、Fusarium等具有產(chǎn)生N2O能力的菌屬也在微生物或空白組樣品中檢測到，Jirout等[57]也為Gibberella、Penicillium、Fusarium屬在產(chǎn)生N2O方面具有極大的潛力提供了強(qiáng)有力的證明。

圖10 真菌在屬水平上的分布Fig.10 Taxonomic compositions of fungi communities at the genus level

根據(jù)上述分析可知，開始階段培養(yǎng)液中DO和COD含量較高，雖然NH+4-N濃度大，但硝化細(xì)菌很難生存，而具有異養(yǎng)硝化/好氧反硝化功能的細(xì)菌屬Rhizobium、Psedomonas、Bacillus可以在低pH環(huán)境下快速生長并進(jìn)行硝化反硝化作用，NH+4-N濃度隨之快速降低。同時發(fā)酵產(chǎn)酸細(xì)菌屬Bacillus、Enhydrobacter對葡萄糖進(jìn)行分解活動，產(chǎn)生中間酸類產(chǎn)物，造成溶液pH值和DO濃度快速降低，進(jìn)而抑制Rhizobium、Psedomonas、Bacillus屬的硝化反硝化作用，NH+4-N濃度因此降低緩慢，而此時細(xì)菌屬Rhodanobacter和真菌屬Gibberella、Talaromyces開始作用，進(jìn)一步消耗NH+4-N，并將NO-3、 NO-2還原為N2和N2O，所以可發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的第47～64 d，微生物組中NO-3、NO-2濃度都發(fā)生了降低現(xiàn)象，特別是NO-3。除此之外，由于微生物組含有可將NO-2氧化成NO-3的菌屬Nitrospira、Leifsonia、Afipia，所以才有13～47 d時NO-3濃度上升的現(xiàn)象，而空白組不含這幾類菌屬且NH+4-N可能經(jīng)過同步硝化反硝化產(chǎn)生氣體而直接排走，所以沒有生成NO-3。

3 結(jié) 語

(1)植物、微生物對NH+4-N濃度降低的貢獻(xiàn)大小依次為：植物+微生物>植物>微生物組，降低量分別為25.01～39.97、11.88～39.96、4.62～8.97 mg，對應(yīng)降低率為38.46%～55.39%、 32.90%～37.22%和4.53%～12.83%。植物+微生物、植物組主要通過反硝化作用和植物吸收來去除N，其中反硝化作用貢獻(xiàn)最大，為49%～79%，植物吸收占15%～37%；而微生物組主要通過反硝化和同化作用來實(shí)現(xiàn)，分別為51%～62%、26%～36%。

(2)不同NH+4-N濃度下，植物+微生物組中植物對N的吸收量均大于植物組，且所有組莖、葉含N量之和大于根含N量；微生物同化作用利用N能力的大小：植物+微生物>微生物>植物組；反硝化作用能力大?。褐参?微生物>植物>微生物組，植物和微生物達(dá)成了相互促進(jìn)的關(guān)系。

(3)通過高通量宏基因組測序得到微生物組細(xì)菌包括16個門，105個屬組成，其中Proteobacteria門最豐富，其次為Acidobacteria門，相對豐度分別占細(xì)菌群落的70.74%、26.72%，在屬分類水平上優(yōu)勢類群有Burkholderia、Terriglobus、Rhodanobacter、Acidisoma和Rhizobium，相對豐度分別為30.78%、26.02%、23.56%、9.64%和1.37%，同時檢測到Psedomonas、Bacillus屬。Burkholderia屬可以促進(jìn)植物的生長，Rhodanobacter屬是植物-微生物系統(tǒng)的優(yōu)勢脫氮菌，Rhizobium、Psedomonas、Bacillus屬具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化功能，具有自養(yǎng)硝化功能的Nitrospira屬幾乎不存在。微生物組真菌由25個屬組成，其中相對豐度分別占群落18.16%、2.83%的優(yōu)勢菌Gibberella、Talaromyces能夠進(jìn)行反硝化作用產(chǎn)生N2O或NO，Penicillium、Kluyveromyces、Rhizopus、Alternaria、Fusarium等具有產(chǎn)生N2O能力的菌屬也被檢測到。

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