miR-567在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其作用機(jī)制

張婷，趙順玉，孔雙喜

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430014）

胰腺癌是種高度惡性的腫瘤，在腫瘤致死疾病中高居第4位[1]。近年來(lái)，胰腺癌的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)胰腺癌患者5年生存率僅1%～3%[2]。因此，對(duì)胰腺癌發(fā)生分子機(jī)制的探索，將為尋求新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物、開(kāi)發(fā)新的治療策略提供新的思路和依據(jù)。microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的高度保守性非編碼RNA分子[2]。在調(diào)控基因表達(dá)方面具有重要作用，往往通過(guò)堿基配對(duì)綁定到靶基因3'UTR非翻譯區(qū)，導(dǎo)致靶基因降解或翻譯抑制[3]。miRNA能調(diào)控約60%的蛋白編碼基因[4]，廣泛參與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程[5]。miRNA在多種人類疾病中呈異常表達(dá)，尤其是腫瘤，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[6]。研究[7]表明，miR-567失調(diào)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生，影響腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。但是miR-567在胰腺癌中的生物學(xué)作用尚不清楚。

本研究旨在對(duì)miR-567在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平進(jìn)行鑒定，同時(shí)采用慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)分析miR-567對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7及胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3均購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，Cell Counting Kit-8購(gòu)自碧云天生物科技有限公司，Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司，胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Roswell公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，TaqMan Real-Time PCR Master Mixes購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，2×SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，All-in-One microRNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，實(shí)驗(yàn)所需的KPNA4、Caspase 3、Bax及GAPDH一抗均購(gòu)自美國(guó)BD公司，二抗均購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢病毒包裝與純化 miR-567慢病毒載體構(gòu)建，以人的基因組為模板，用下述引物擴(kuò)增前體 hsa-mir-567 MI0003573。miR-567_F（Xho I）：5'-CCG CTC GAG GGA TTC TTA TAG GAC AGT AT-3'；miR-567_R：5（BamHI）'- AGC GGA TCC AGC AAT AAC TTT TTT TTT TTT TAG T-3'，得到前體hsa-mir-567片段后，以Xho I/BamHI克隆到pGMLV-PE1 miR過(guò)表達(dá)慢病毒載體，測(cè)序正確后即得到hsa-miR-567的慢病毒過(guò)表達(dá)載體。然后進(jìn)行慢病毒包裝和感染細(xì)胞?？蛰d體慢病毒感染組為NC組。慢病毒包裝使用第二代體系，12 μg pGMLV-PE1 hsa-miR-567 與 CON 載 體、9 μg pSPAX2、3 μg PMD2G 載體轉(zhuǎn)入 293t細(xì)胞后，收集48 h上清，即得到病毒上清，病毒上清使用PEG純化，將病毒上清與PEG體積比4:1混合后，4度沉淀過(guò)夜，3 000r/min離心 30min，去上清，沉淀使用無(wú)血清1640培養(yǎng)基重懸。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7及胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3種植于 RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并將Panc-1細(xì)胞系分成3組，miR-567轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組，分別用含pGMLV-PE1 miR過(guò)表達(dá)慢病毒載體的慢病毒、空載體慢病毒感染miR-567轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，作為空白對(duì)照，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染，加PBS做對(duì)照。病毒感染復(fù)數(shù)為10 MOI（病毒:細(xì)胞=10:1），培養(yǎng)48 h后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RNA提 取 及 qRT-PCR ⑴ miR-567相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)：用All-in-One microRNA抽提試劑盒和All-in-One miRNA qRT-PCR 檢測(cè)試盒提取和分離正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7及胰腺癌細(xì)胞系miRNA后，使用TaqMan Real-Time PCR Master Mixes 檢 測(cè) Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3中miRNA-567的 表 達(dá)， 檢 測(cè)系 統(tǒng) 為 ABI 7500 fast，miRNA QPCR 引 物 購(gòu) 自Exiqon 公 司（Euroclone，Italy）（Accession No.MI0003573），以U6小核RNA作為內(nèi)參，使用2?ΔΔCt方法定量，量化miR-567相對(duì)表達(dá)量。⑵ KPNA4 mRNA檢測(cè)：使用Trizol提取細(xì)胞總RNA后，使用qRT-PCR檢測(cè)miR-567轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中KPNA4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，KPNA4 正向引物：5'-CAG GAG ATT CTT CCA GCC CTT TGT GT-3'； 反 向 引 物：5'-ATT ACC ATC TGT ATT TGT TCA TTG CCA GCA TC-3'，GAPDH 正 向 序 列：5'-TAT GCT CTC CTC ATG CAT TG-3'； 反 向 序 列 5'-GGG ACG ACC TTC GAT CTA CC-3'， 按 TAKARA SYBR Premix Ex Taq反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用 2?ΔΔCt法計(jì)算 KPNA4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法，將miR-567轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組3組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，按每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，培養(yǎng)基體積為200 μL。培養(yǎng)24 h后加入 5 mg/mL CCK-8 溶液 40 μL，孵育 4h 后每孔加入200 μL DMSO，搖床上充分震蕩。在轉(zhuǎn)染1、2、3、4 d后于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。重復(fù)3次，取平均值，作細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V/PI染色檢測(cè)，將miR-567轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組3組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重懸，加入相應(yīng)比例的Annexin V抗體，避光染色10min后加入適量PBS溶液以及PI染料，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例來(lái)確定細(xì)胞凋亡的變化。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將miR-567轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組兩組細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后，用200 μL Tips槍頭沿培養(yǎng)孔劃直線，計(jì)算劃痕后0、48 h劃痕面積，并計(jì)算劃痕愈合率，實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下重復(fù)3次，取均值。劃痕愈合率=（劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積）/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。遷移能力越強(qiáng)，劃痕愈合率越高。

1.2.7 Western blot 將miR-567轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組兩組細(xì)胞使用RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30min后，加入相應(yīng)比例蛋白上樣緩沖液，煮沸10min，按 30 μg 的量上樣，加入 Western blot預(yù)制膠，50 V恒壓待樣本溴酚藍(lán)跑至濃縮膠與分離膠分界線時(shí)，切換至120 V恒壓，溴酚藍(lán)跑至膠板底部時(shí)，400 mA恒流將蛋白樣本轉(zhuǎn)至PVDF膜上， 加 KPNA4（1:200）、caspase-3（1:200）、Bax（1:200）及 GAPDH（1:200）一抗，37℃孵育4 h，二抗（1:500）孵育過(guò)夜，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白測(cè)定值/GAPDH，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graph軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-567在胰腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)

設(shè)miR-567在正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7中相對(duì)表達(dá)量為1.0，在胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3的相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.06、0.34±0.041、0.44±0.033、0.53±0.08，miR-567在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均明顯低于正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 miR-567在胰腺癌細(xì)胞及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中的表達(dá) 注：1）與HPDE6-C7比較，P＜0.05Figure 1 miR-567 in pancreatic carcinoma and normal pancreatic cell line Note: 1) P＜0.05 vs. HPDE6-C7

2.2 miR-567過(guò)表達(dá)抑制Panc-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡

圖2 miR-567慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)Panc-1細(xì)胞miR-567表達(dá)及、增殖、凋亡的影響 A：miR-567相對(duì)表達(dá)量；B：細(xì)胞增殖曲線；C：細(xì)胞凋亡檢測(cè)Figure 2 In fl uence of miR-567 lentivirus vector transfection on miR-567 expression, proliferation and apoptosis in Panc-1 cells A: Relative expression level of miR-567; B: Cell growth curves; C: Cell apoptosis analysis

qRT-PCR檢測(cè)顯示，miR-567轉(zhuǎn)染組miR-567的相對(duì)表達(dá)量為14.53±0.81，明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.001），空載體轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組miR-567相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2A）。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-567轉(zhuǎn)染組在鋪板48 h之后的時(shí)間點(diǎn)，OD450值明顯小于空白對(duì)照組（均P＜0.05），空載體轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)OD450值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖2B）。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-567轉(zhuǎn)染組凋亡率為26.7%，空白對(duì)照組為7.1%，空載體轉(zhuǎn)染組為5.7%，miR-567轉(zhuǎn)染組凋亡率顯著高于空載體轉(zhuǎn)染組（P＜0.001），空白對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染組凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2C）。

2.3 miR-567過(guò)表達(dá)抑制Panc-1細(xì)胞遷移

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-567轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率為（42.7±2.9）%，空載體轉(zhuǎn)染組為（73.50±5.3）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

2.4 miR-567過(guò)表達(dá)對(duì)KPNA4及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

以空載體轉(zhuǎn)染組為對(duì)照，設(shè)其各指標(biāo)的表達(dá)量為1，qRT-PCR檢測(cè)KPNA4 mRNA顯示示，miR-567轉(zhuǎn)染組KPNA4 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.045；Western blot顯示，miR-567轉(zhuǎn)染組KPNA4蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.43±0.079、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為3.70±0.29、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為3.35±0.21，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4）。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-567過(guò)表達(dá)對(duì)Panc-1細(xì)胞遷移的影響Figure 3 Determination of in fl uence of miR-567 overexpression on migration of Panc-1 cells by scratch wound healing assay

圖4 KPNA4、caspase-3及Bax表達(dá)檢測(cè)Figure 4 Detection of expressions of KPNA4 and apoptosis-associated proteins

3 討 論

胰腺癌是一種高度侵襲性惡性腫瘤，患者常無(wú)明顯癥狀，診斷時(shí)多處于晚期且常伴有淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管侵泛等[8]。miRNA表達(dá)失調(diào)普遍存在于在腫瘤中，包括胰腺癌[8]。比如，miR-200基因簇過(guò)表達(dá)阻礙卵巢癌細(xì)胞遷移，且可作為卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志物[9]。miR-128通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞再生因子Bmi-1，抑制膠質(zhì)瘤增殖和自我更新[10]。miR-17-5p通過(guò)抑制AIB1 mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖[11]。多順?lè)醋觤iRNA簇miR-17-92在肺癌中過(guò)表達(dá)，能促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。因此，探索失調(diào)miRNA的功能對(duì)于了解胰腺癌分子發(fā)生機(jī)制非常關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，miR-567在G3級(jí)乳腺癌患者中表達(dá)低于G1級(jí)，在預(yù)后差的患者中表達(dá)低于預(yù)后較好的患者，且過(guò)表達(dá)后能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)、增殖和遷移[7]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-567在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著低于正常胰腺細(xì)胞系，意味著miR-567可能作為抑癌基因參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。通過(guò)對(duì)慢病毒介導(dǎo)的miR-567過(guò)表達(dá)的生物學(xué)行為分析，發(fā)現(xiàn)Panc-1細(xì)胞的增殖和遷移能力受到顯著抑制，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，由此證實(shí)miR-567在胰腺癌和乳腺癌中發(fā)揮類似的抑癌作用。

Bertoli等[7]還發(fā)現(xiàn)miR-567是核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白KPNA4的負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)調(diào)控KPNA4基因的表達(dá)控制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。為探討KPNA4與miR-567在胰腺癌中的關(guān)聯(lián)，本研究采用qRT-PCR及Western blot檢測(cè)了KPNA4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示KPNA4基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平受miR-567過(guò)表達(dá)的影響而下調(diào)。這表明，在胰腺癌中，miR-567也是KPNA4的負(fù)調(diào)控因子，推測(cè)miR-567過(guò)表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用也是通過(guò)降低KPNA4的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。研究[13]報(bào)道，前列腺癌KPNA4敲除后，顯著降低前列腺癌細(xì)胞遷移能力，同時(shí)前列腺癌小鼠模型的瘤體侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力也受到明顯抑制。這更進(jìn)一步表明，KPNA4是作為促癌基因參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌。

KPNA4能介導(dǎo)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，激活NF-κB響應(yīng)基因[14]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與多種生物學(xué)響應(yīng)，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥方面起重要作用[15]。但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在多種人類惡性腫瘤中異常表達(dá)或活化，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等多種生物過(guò)程相關(guān)的基因表達(dá)[16]。NF-κB信號(hào)途徑受抑制將導(dǎo)致一系列抗凋亡蛋白的表達(dá)受損，如Bcl、細(xì)胞凋亡抑制蛋白2及Bcl-xL[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，NF-κB在前列腺癌細(xì)胞中失活與血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移受抑有密切關(guān)系。NF-κB活性與裸鼠人黑色素瘤腫瘤模型的生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]。另外，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-181b通過(guò)靶向KPNA4成為下游NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子[20]。在本研究中，miR-567可能也像miR-181b那樣通過(guò)調(diào)控KPNA影響NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，筆者推測(cè)NF-κB的核轉(zhuǎn)位過(guò)程因KPNA4低表達(dá)而受到阻礙，擾亂一系列增殖、轉(zhuǎn)移及抗凋亡基因的表達(dá)，從而有助于抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

之前的研究還發(fā)現(xiàn)，KPNA4通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境中腫瘤壞死因子TNF-α和TNF-β介導(dǎo)的細(xì)胞因子的相互作用，從而促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[13]。筆者猜測(cè)，miR-567在胰腺癌中過(guò)表達(dá)后，由于KPNA4表達(dá)水平的降低，降低了TNF-α和TNF-β的分泌，影響了它們介導(dǎo)的細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，改變腫瘤微環(huán)境，因而有助于抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞凋亡途徑包括兩條，即由腫瘤壞死因子受體1及TRAIL-R1等死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑[21]，及由各種刺激所導(dǎo)致的線粒體外膜通透性改變的內(nèi)源性途徑[22]。而caspase-3、caspase-8為兩條途徑的共同執(zhí)行者，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，DNA修復(fù)終止，核酸內(nèi)切酶得以活化，DNA發(fā)生裂解，細(xì)胞骨架蛋白破壞，細(xì)胞形態(tài)失去正常。BAX亞家族起促凋亡的作用，主要包括BAK和BAX[23]。caspase-3和BAX作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，在凋亡過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-567過(guò)表達(dá)后，caspase-3和BAX上調(diào)表達(dá)，其凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)caspase-3和BAX而實(shí)現(xiàn)的。

本研究也存在著一些不足之處，比如miR-567-KPNA4介導(dǎo)的下游腫瘤相關(guān)信號(hào)通路如何，miR-567與胰腺癌患者無(wú)瘤生存率、總生存率及預(yù)后的關(guān)系如何，在基因敲除鼠中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何，都值得進(jìn)一步研究。

綜上，miR-567在胰腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)，miR-567高表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)KPNA4及上調(diào)caspase-3和BAX表達(dá)有關(guān)，這可能為將來(lái)開(kāi)發(fā)新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物、研發(fā)新的腫瘤靶向藥物提供一定的思路。

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