攜Jagged 2基因siRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞影響

徐林，易超，依馬木買(mǎi)買(mǎi)提江·阿布拉，蘇雅婷，晏冬，李海軍，丁偉

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 肝膽外科，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 醫(yī)務(wù)部，新疆烏魯木齊 830000；3. 廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院 普通外科，廣東 深圳 518001）

長(zhǎng)久以來(lái)，胰腺癌一直是困擾著臨床醫(yī)師的難題，其早期發(fā)病隱匿進(jìn)展迅速，多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已屬晚期，喪失了最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)，而其對(duì)放化療又均不敏感，以根治性切除為主的綜合治療模式仍是目前最主要的治療方法，致使胰腺癌已成為嚴(yán)重影響全人類(lèi)生命健康的疾病[1-3]。隨著近年來(lái)分子生物化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制已逐漸明了，多數(shù)學(xué)者[4-6]認(rèn)為其惡性生物學(xué)特性的產(chǎn)生與維持是一個(gè)多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的過(guò)程。本研究通過(guò)Jagged 2（JAG2）基因針對(duì)Notch信號(hào)通路在胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步闡明胰腺癌的發(fā)病發(fā)展機(jī)制及探尋有效的早期診斷與靶向治療位點(diǎn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：人胰腺癌組織源細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒（Human Cancer PrimaCell?:Pancreatic Cancer Tissues Cells）及人胰腺癌組織源細(xì)胞鑒定試劑盒（Human Pancreatic Cancer Tissues Cell Primarker? Kit）購(gòu)自齊氏生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、Transwell 試劑盒購(gòu)自Corning公司；胎牛血清購(gòu)自Ausbian公司；胰蛋白酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；慢病毒載體構(gòu)建包裝試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒、RNA提取純化試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Western blot試劑盒及抗體購(gòu)自吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自上海普飛公司；MTT試劑盒購(gòu)自Genview公司；Annexin V-APC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience公司；碘化丙啶購(gòu)自igma公司。儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)產(chǎn)自蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；PCR儀產(chǎn)自Applied Biosystems公司；Real time PCR儀產(chǎn)自Roche公司；凝膠成像儀產(chǎn)自天能公司；CO2培養(yǎng)箱產(chǎn)自SANYO公司；高速離心機(jī)產(chǎn)自Thermo Scientific公司；熒光顯微鏡產(chǎn)自O(shè)lympus公司；倒置顯微鏡產(chǎn)自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；生物安全柜產(chǎn)自上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀產(chǎn)自Tecan infinite公司；流式細(xì)胞儀產(chǎn)自Millipore公司；96孔板產(chǎn)自Cornning公司。

1.2 胰腺癌原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)與傳代

胰腺癌組織來(lái)源：收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院2014年1月—2016年6月間行胰十二指腸切除術(shù)的胰腺惡性腫瘤患者的新鮮腫瘤組織標(biāo)本共22例，并按如下的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)初步篩選出其中的12例擬用于后續(xù)研究的標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 經(jīng)快速病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌；⑵ 經(jīng)本院首次確診的新發(fā)病例；⑶ 患者年齡≥18歲；⑷ 患者本人及患者家屬同意留取組織標(biāo)本并用于研究，允許研究資料交流發(fā)表。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 經(jīng)常規(guī)病理及免疫組化證實(shí)存在局部脈管侵犯、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或?yàn)槠渌认賽盒阅[瘤；⑵ 存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑶ 合并有其他惡性腫瘤或糖尿病、高血壓、心腦血管疾病等全身系統(tǒng)性疾病；⑷ 術(shù)前已接受放療、化療或其他抗腫瘤藥物治療患者；⑸ 近3年內(nèi)有手術(shù)史。

胰腺癌原代細(xì)胞的分離與純化：參照美國(guó)IRB與HIPAA批準(zhǔn)方案收集手術(shù)切除的胰腺癌組織標(biāo)本后，采用人胰腺癌組織源細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒分離并純化獲得胰腺癌原代細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并置于37℃、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%及以上面積時(shí)用凍存液（DMEM/F12+40%FBS+10%DMSO）重懸細(xì)胞并置于凍存管中4℃放置0.5 h，-20℃放置1.5 h，-80℃放置過(guò)夜，24 h后轉(zhuǎn)入液氮罐內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?2例組織樣本成功分離胰腺癌原代細(xì)胞6例，3例細(xì)胞在分離過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重污染，2例細(xì)胞分離后出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片成活細(xì)胞數(shù)極少至分離失敗，1例細(xì)胞中成纖維細(xì)胞去除失敗大量生長(zhǎng)。

胰腺癌原代細(xì)胞的傳代：凍存細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，用上述完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶的80%以上，棄培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞后加入0.25%胰蛋白酶1 mL 37℃孵育2min，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓時(shí)立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液1 500r/min離心5min，沉淀細(xì)胞并用完全培養(yǎng)基重懸后按1:2傳代比例傳5代，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)備用。細(xì)胞傳代過(guò)程中，1例細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重污染，1例細(xì)胞出現(xiàn)大量脫落死亡。余成功傳代培養(yǎng)細(xì)胞每例取1株經(jīng)人胰腺癌組織源細(xì)胞鑒定試劑盒鑒定證實(shí)確為胰腺癌細(xì)胞。

1.3 JAG2基因siRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與篩選

根據(jù)Genebank提供的基因信息設(shè)計(jì)3條siRNA靶點(diǎn)序列（siRNA1：GCT CTA CCA GTG CAA GAA CTT；siRNA2：CGC TGC TAC GAC CTG GTC AAT；siRNA3：CTG TGT GTA AAC AAG GGT GTA）并由吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司代為合成siRNA片段（表1），將1μL上述合成的siRNA片段與1μL經(jīng)雙酶（AgeI、EcoR I）切的慢病毒載體（圖1）混合后加入1μL T4 DNA ligase 16℃連接過(guò)夜（反應(yīng)體系中加入10倍的T4 DNA ligase緩沖液并用ddH2O補(bǔ)足體檢至20μL），10μL連接產(chǎn)物加入100μL感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30min，42℃熱激90 s，冰浴2min后加入500μL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，菌液均勻涂在含雙抗的平板上恒溫培養(yǎng)15 h，行PCR菌檢（PCR引物為上游：CCA TGA TTC CTT CAT ATT TGC；下游：ATG TCC TTC TGC TGA TAC TGG G），陽(yáng)性克隆接種至含雙抗的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)15 h后行測(cè)序，測(cè)序正確的菌液同上培養(yǎng)15 h后采用質(zhì)粒提抽試劑盒提抽質(zhì)粒并行質(zhì)檢。將經(jīng)胰酶消化的293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞密度達(dá)70%～80%備用，轉(zhuǎn)染前2 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基；上述構(gòu)建的載體質(zhì)粒20 μg、pHelper1.0載體15 μg、pHelper 2.0載體10 μg及相應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑充分混勻調(diào)整體積至1 mL，室溫下孵育15min，緩慢加入293T細(xì)胞中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h洗滌細(xì)胞去除殘余轉(zhuǎn)染復(fù)合物后，緩慢加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基20 mL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h。收集293T細(xì)胞4℃、5 055r/min離心10min去除細(xì)胞碎片，以0.45 μm濾器過(guò)濾上清40 ml，25 000r/min離心2 h，棄去上清沉淀重懸后10 000r/min離心5min去上清獲得目標(biāo)病毒，采用熒光法測(cè)得病毒滴度分別為6×108、8×108、5×108TU/mL。

上述分離培養(yǎng)成功的胰腺癌原代細(xì)胞，參照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明利用構(gòu)建好的3條siRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72 h收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA后，以GAPDH為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞中JAG2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量并采用Western blot法驗(yàn)證各組細(xì)胞中JAG2蛋白表達(dá)情況，選擇抑制效率最高的siRNA慢病毒表達(dá)載體用于后續(xù)研究。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s、1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s、60℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)；95℃15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s、1個(gè)循環(huán)。

表1 JAG2基因siRNA片段Table 1 The siRNA fragments for JAG2 gene

圖1 慢病毒載體信息Figure 1 Information of the lentiviral vector

1.4 JAG2基因siRNA慢病毒表達(dá)載體對(duì)人胰腺癌原代細(xì)胞生物學(xué)特性影響分析

胰腺癌原代細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋70%～80%培養(yǎng)瓶后分為2組，參照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，對(duì)照組細(xì)胞用不攜帶siRNA的空慢病毒載體（包含GV載體質(zhì)粒、pHelper 1.0載體及pHelper 2.0）轉(zhuǎn)染，JAG2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用siRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)72 h后觀察2組細(xì)胞生長(zhǎng)情況并于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)率（即轉(zhuǎn)染率），當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上融合度且轉(zhuǎn)染率達(dá)70%～80%時(shí)收集細(xì)胞行如下實(shí)驗(yàn)：參照MTT試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)兩組細(xì)胞5 d生長(zhǎng)情況并繪制生長(zhǎng)曲線，并依據(jù)細(xì)胞增殖抑制率=（1-JAG2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD490值/對(duì)照組細(xì)胞OD490值）×100%公式計(jì)算JAG2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制率；兩組細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)收集細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸1300r/min離心5min，4℃預(yù)冷的D-Hanks洗滌細(xì)胞沉淀2次后1300r/min離心3min，用500μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞沉淀并與10μL Annexin V-APC混勻，避光室溫反應(yīng)15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并對(duì)比分析；收集兩組細(xì)胞1300 r/min離心5min，4℃預(yù)冷的D-Hanks洗滌細(xì)胞沉淀1次，1300 r/min離心5min，4℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞1h，再重復(fù)離心并用預(yù)冷D-Hanks洗滌細(xì)胞，加入含碘化丙啶（PI）細(xì)胞染色液染色細(xì)胞后流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期；完全培養(yǎng)基重懸兩組細(xì)胞后，參照Transwell試劑盒說(shuō)明，上室中加入100μL細(xì)胞懸液調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，下室內(nèi)加入600μL 30%FBS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，去除培養(yǎng)基及非轉(zhuǎn)移細(xì)胞后Giemsa染色3～5min，顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞，對(duì)比分析各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 JAG2基因siRNA慢病毒表達(dá)載體的篩選

成功構(gòu)建JAG2 siRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胰腺癌原代細(xì)胞（圖2A）；經(jīng)構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后胰腺癌原代細(xì)胞中JAG2基因相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2B，其中對(duì)照組為加入ddH2O的空白對(duì)照，3條siRNA慢病表達(dá)載體相較于對(duì)照組的抑制率分別為69.2%、4.8%、60.5%；Western blot結(jié)果顯示JAG2蛋白表達(dá)情況與mRNA基本一致（圖2C），故選擇抑制效果最強(qiáng)的JAG2 siRNA1慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

依據(jù)兩組細(xì)胞經(jīng)M T T處理后每天測(cè)得的O D490值繪制的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，J A G 2 siRNA慢病毒表達(dá)載體可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.05），轉(zhuǎn)染24、48、72、96、1 2 0 h的抑制率分別為（1 1.8 4±2.1 0）%、（2 6.9 1±0.8 9）%、（4 2.0 0±1.8 9）%、（40.26±2.74）%、（44.96±2.89）%（圖3）。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

經(jīng)培養(yǎng)5 d后，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（4.98±0.33）%，JAG2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率為（7.52±0.19）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

2.4 細(xì)胞周期分析

經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，對(duì)照組細(xì)胞中處于G1期、S期及G2/M期的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例分別為（55.05±1.23）%、（23.53±0.94）%、（21.42±0.82）%，JAG2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞各期細(xì)胞比例則分別為（6 1.0 6±0.8 0）%、（11.88±1.03）%、（27.07±0.39）%；與對(duì)照組比較，JAG2 siRNA轉(zhuǎn)染組的胰腺癌細(xì)胞位于G1及G2/M期的細(xì)胞增多，而位于S期的細(xì)胞則明顯減少（均P＜0.05）（圖5）。

圖2 轉(zhuǎn)染效果觀察 A：轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞熒光照片（×100）；B：轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞JAG2 mRNA表達(dá)檢測(cè)；C：轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞JAG2蛋白表達(dá)檢測(cè)Figure 2 Transfection effect observations A: Fluorescence microscopy images of the pancreatic cells after transfection (×100); B: JAG2 mRNA expressions in the pancreatic cells after transfection; C: JAG2 protein expressions in the pancreatic cells after transfection

圖3 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Figure 3 Growth curves of each group of cells

圖4 各組細(xì)胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of each group of cells

圖5 各組細(xì)胞細(xì)胞周期分析Figure 5 Cell cycle analysis in each group of cells

2.5 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JAG2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞小室內(nèi)的細(xì)胞計(jì)數(shù)為（2.0±0.40）個(gè)/高倍視野，對(duì)照組細(xì)胞小室內(nèi)計(jì)數(shù)（69±8.15）個(gè)/高倍視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。

圖6 各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力測(cè)定 A：Transwell實(shí)驗(yàn)照片（×100）；B：兩組遷移細(xì)胞數(shù)比較Figure 6 Determination of invasion and metastasis ability in each group of cells A: Transwell assay fi ndings (×100); B: Comparison of the number of migrating cells between the two groups of cells

3 討 論

Notch信號(hào)通路是一條廣泛存在于脊椎動(dòng)物與非脊椎動(dòng)物進(jìn)化上高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路由Notch受體家族、配體Delta和Serrate/Jagged、轉(zhuǎn)錄因子CSL（CBF-1、suppressor of hairless、Lag的合稱）蛋白、調(diào)節(jié)因子及其它效應(yīng)物構(gòu)成，當(dāng)相鄰近細(xì)胞間的Notch受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)3次裂解產(chǎn)生其胞內(nèi)活性成分NICD進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL形成復(fù)合物激活下游靶基因，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及黏附等生物學(xué)功能[7-9]。Notch通路被認(rèn)為是胚胎發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵性細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而其異常激活則與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤血管的形成關(guān)聯(lián)密切[10-13]。胰腺癌研究方面，Notch信號(hào)通路已被證實(shí)在動(dòng)物胚胎胰腺早期發(fā)育中可促進(jìn)胰腺前體的大量增生并維持胰腺細(xì)胞處于祖細(xì)胞狀態(tài)，在成熟胰腺中該通路成員的表達(dá)量則處于較低的水平，只有當(dāng)胰腺出現(xiàn)急慢性炎癥時(shí)，該通路才再次被激活作用于胰腺的損傷修復(fù)，而胰腺癌組織中則可檢測(cè)到該通路部分成員的過(guò)度表達(dá)[14-16]。Tang等[17]的研究顯示，miR-34a可靶向阻斷Notch通路從而影響胰腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，證實(shí)Notch信號(hào)通路的激活可能是胰腺癌惡性生物學(xué)特性產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Zhou等[18]通過(guò)體外阻遏胰腺癌細(xì)胞中Notch3的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步的研究結(jié)果也提示，Notch3的表達(dá)與胰腺癌脈管受侵、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期明顯相關(guān)，且是縮短患者生存期的高危因素。杜瀟等[19]的研究結(jié)果也提示，通過(guò)轉(zhuǎn)染Notch1胞內(nèi)段（NICD）質(zhì)?？缮险{(diào)Notch通路關(guān)鍵靶基因Hes1的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞株的凋亡從而促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。

筆者課題組[20]在前期研究采用表達(dá)譜基因芯片對(duì)手術(shù)切除的胰腺癌及其癌旁正常組織間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，Notch信號(hào)通路中的主要成員Notch1、Notch2、Notch3、HES（hairy and enhancer of split）1、HES 5、CSHL（chorionic somatomammotropin hormone like）1及JAG2基因均存在不同程度的差異表達(dá)，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，僅有Notch2基因的表達(dá)與基因芯片結(jié)果不相符，其余基因中以JAG2基因在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)豐度最高。JAG2基因作為Notch信號(hào)通路的配體，其異常表達(dá)已被證實(shí)與結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21-24]。胰腺癌方面，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少，Hu等[25]的研究結(jié)果顯示，JAG2基因高表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，但這種作用的發(fā)揮主要依賴于JAG2與Notch1間的相互作用，而不是通過(guò)激活Notch通路的下游靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。為進(jìn)一步分析JAG2基因及Notch信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制，本研究成功構(gòu)建了3條攜帶JAG2 siRNA的慢病毒表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)染胰腺癌原代細(xì)胞后篩選出對(duì)JAG2基因表達(dá)抑制率最高的阻遏載體。經(jīng)該阻遏表達(dá)載體轉(zhuǎn)染抑制JAG2基因表達(dá)從而阻斷Notch信號(hào)通路后，胰腺癌原代細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移能力均出現(xiàn)明顯的下降，而細(xì)胞凋亡比率則顯著上升，證實(shí)Notch信號(hào)通路可能在胰腺癌的惡性生物學(xué)特性維持過(guò)程中起著重要的作用，同時(shí)也說(shuō)明在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中JAG2基因可能是Notch通路發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本研究在一定程度上證實(shí)了Notch信號(hào)通路在胰腺癌惡性生物學(xué)特性產(chǎn)生與維持過(guò)程中的重要作用，但因胰腺癌極低的手術(shù)切除率及胰腺癌原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的困難，樣本量較少，結(jié)果存在一定的偏倚，且該通路在胰腺癌細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制及其與其它通路的協(xié)同拮抗作用尚未明確，還需更為深入的研究論證。筆者相信，隨著胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程分子調(diào)控機(jī)制的不斷明確，該通路勢(shì)必會(huì)成為胰腺癌早期診斷甚至是靶向治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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