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    人參皂苷rg3聯(lián)合rh-ES治療乳腺癌荷瘤小鼠的實驗研究

    2017-03-23 07:33:32李根陳文文梁華王玉蘭
    中國普通外科雜志 2017年11期
    關(guān)鍵詞:恩度皂苷人參

    李根,陳文文,梁華,王玉蘭

    (四川省成都市婦女兒童中心醫(yī)院 藥劑科,四川 成都 610091)

    乳腺癌是女性高發(fā)腫瘤,流行性病學(xué)調(diào)查顯示,乳腺癌是女性首位惡性腫瘤,每年發(fā)病率約42/10萬,并且逐年增高[1]。放化療是乳腺癌常用治療方案,但傳統(tǒng)的放化療藥物具有較強毒副作用,并易出現(xiàn)耐藥。在這種情況下,臨床開始探究使用植物來源的天然化合物治療乳腺癌的可行性[2]。已有研究[3]表明,人參皂苷rg3是人參根部提取的單體成分,對多種腫瘤細胞生長、浸潤以及轉(zhuǎn)移具有抑制作用,并且毒副作用較低。重組人血管內(nèi)皮抑素(rh-ES,恩度)則是臨床常用的非小細胞肺癌治療藥物,其在乳腺癌中的價值如何,臨床研究較少。本研究分析了人參皂苷rg3及人參皂苷rg3聯(lián)合恩度對MCF-7乳腺癌細胞移植小鼠的治療作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    購買72只雌性裸小鼠,SPF級,體質(zhì)量15~20 g,購買自中科院國家嚙齒類上海實驗分中心,3~4周齡。

    1.2 實驗儀器與藥品

    流式細胞儀由美國DD細胞公司生產(chǎn);PCR儀由美國MJ Research公司生產(chǎn);紫外分光光度儀由日本Shimadzu公司生產(chǎn);凝膠圖像分析系統(tǒng)由美國PALL公司生產(chǎn)。恩度由山東先聲麥得津生物制藥有限公司提供;人參皂苷rg3由遼寧生物醫(yī)藥科技有限公司提供;VEGF兔抗人單克隆抗體由美國eBioscience公司提供;BAD顯色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供;小牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供。

    1.3 模型制備與干預(yù)方法。

    將MCF-7細胞取出后,于無菌環(huán)境下PBS洗點3次,滴入0.2 mL胰蛋白酶,置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)10 min,待細胞復(fù)蘇后,置于100 mL 10%小牛血清+100 IU/mL青霉素+0.03%L-谷氨酞胺溶液內(nèi),室溫環(huán)境培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)3代。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞,選用30 mL胰蛋白酶消化,并選用臺盼藍染液進行細胞計數(shù),計數(shù)在95%顯示穿代成功。于顯微鏡下將細胞數(shù)調(diào)整至5×107個/mL,并其接種至小鼠右側(cè)乳房,待造模成功后,采用隨機數(shù)字表法分為對照組(等量生理鹽水注射)、人參皂苷組(靜注人參皂苷rg3 5 mg/kg,隔日1次)、恩度組(靜注10 mg/kg,隔日1次)、聯(lián)合組(靜注恩度10 mg/kg+人參皂苷rg3 5 mg/kg,隔日1次)各18只,干預(yù)時間3周。

    1.4 指標檢測方法

    1.4.1 腫瘤質(zhì)量、體積測量 干預(yù)3周后,脫頸處死小鼠,取出瘤體,計算瘤體質(zhì)量及體積:腫瘤體積=1/12πab2,抑瘤率=(1-治療組瘤重/對照組瘤重)×照組瘤重。

    1.4.2 流式細胞術(shù) 取各組樣本剪碎后制備成細胞懸液,2 500r/min離心10 min,沉淀后懸PBS洗滌2次,70%酒精固定25 min,滴入15 mL 10%Trition X-100孵化15 min,滴入0.2 mg/mL Rnase孵化10 min,選用碘化丙啶幾Annexin-V進行雙染色,病選用流式細胞儀檢測細胞周期情況。

    1.4.3 RT-PCR 根據(jù)TRIZol法提取樣本總RNA,收集沉淀下來的核酸,并選用冷乙醇洗滌2次,干燥后選用50 mL 0.2% DEPC進行水解,選用DNA/RNA紫外檢測儀檢測其含量。根據(jù)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶方法進行cDNA制備操作,取5 μL cDNA選用Taq酶進行擴增,將樣本PCR反應(yīng),條件為:95 ℃,60 s;55 ℃,60 s;72 ℃,30 s,32 個循環(huán)。將所得物置于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳20 min,選用凝膠成像系統(tǒng)進行定量分析。

    1.4.4 Western blot 將樣本剪碎后加入至400 μL裂解液內(nèi),碾碎組織,裂解30 min后,2 500r/min離心10 min,取上清并冷藏待用。取100 μg樣本,滴入10 mL Tris2HCL,15 mL二硫蘇糖醇,10 mL PL,震蕩均勻,于100 ℃下變性5 min,滴至不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠樣品孔內(nèi),電泳,VEGF兔抗人單克隆抗體一抗,山羊IgG二抗,ECL顯色,并鏡檢[4]。

    1.4.5 免疫組化 將樣本常規(guī)包埋切片后,脫蠟水化,并選用500 mL檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù),PBS洗滌3次,MMP-2、MMP-9兔抗人單克隆抗體一抗,羊抗兔IgG二抗;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,鏡檢。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

    統(tǒng)計軟件采用SPSS 16.0,采用均數(shù)±標準差(±s)進行統(tǒng)計描述,多組間比較采用單因素方差分析法,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及抑制率比較

    人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組組小鼠的腫瘤質(zhì)量、體積均明顯低于對照組(均P<0.05);聯(lián)合組的腫瘤質(zhì)量、體積均明顯低于人參皂苷組、恩度組(均P<0.05),抑制率明顯大于人參皂苷組、恩度組(均P<0.05);人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

    表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及抑制率比較(n=18,±s)

    表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及抑制率比較(n=18,±s)

    注:1)與對照組比較,P<0.05;2)與聯(lián)合組比較,P<0.05

    組別 腫瘤質(zhì)量(g) 腫瘤體積(mm3)抑制率(%)對照組 1.351±0.045 1766.9±97.1 —人參皂苷組 1.070±0.0421),2)1320.1±83.91),2)20.80±1.902)恩度組 1.014±0.0491),2)1281.7±90.01),2)24.94±1.862)聯(lián)合組 0.881±0.0391) 819.6±52.41) 34.79±2.11 F 26.135 25.007 34.198 P<0.001 <0.001 <0.001

    2.2 各組小鼠腫瘤組織中細胞周期分布情況比較

    人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的G0/G1期、S期細胞比例均明顯低于對照組,G2/M期細胞比例高于對照組(均P<0.05);聯(lián)合組的G0/G1期、S期明顯低于人參皂苷組、恩度組,G2/M期細胞比例明顯高于人參皂苷組、恩度組(均P<0.05);人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)(表2)。

    2.3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA、蛋白的表達率比較

    人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的V E G F m R N A、蛋白均明顯低于對照組(均P<0.05);聯(lián)合組的VEGF mRNA、蛋白均明顯低于人參皂苷組、恩度組(均P<0.05);人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)(圖1)(表3)。

    表2 各組小鼠腫瘤組織中細胞周期分布情況比較(%,n=18,±s)

    表2 各組小鼠腫瘤組織中細胞周期分布情況比較(%,n=18,±s)

    注:1)與對照組比較,P<0.05;2)與聯(lián)合組比較,P<0.05

    組別 G0/G1期 S期 G2/M期對照組 53.29 33.18 12.46人參皂苷組 41.171),2) 29.111),2) 27.411),2)恩度組 38.201),2) 28.641),2) 29.531),2)聯(lián)合組 31.161) 24.131) 34.881)F 42.180 21.694 49.807 P<0.001 <0.001 <0.001

    圖1 腫瘤組織中VEGF表達檢測 A:VEGF mRNA檢測;B:VEGF蛋白表達檢測 1:對照組;2:人參皂苷組;3:恩度組;4:聯(lián)合組

    表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA、蛋白表達水平比較(光密度值,n=18,±s)

    表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA、蛋白表達水平比較(光密度值,n=18,±s)

    注:1)與對照組比較,P<0.05;2)與聯(lián)合組比較,P<0.05

    組別 VEGF mRNA VEGF蛋白對照組 1.294 0.562人參皂苷組 1.0441),2) 0.4611),2)恩度組 0.9381),2) 0.4451),2)聯(lián)合組 0.7291) 0.2761)F 22.008 14.796 P<0.001 <0.001

    2.4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白的表達率比較

    人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠腫瘤組織的MMP-2、MMP-9蛋白表達率明顯低于對照組(均P<0.05);聯(lián)合組的MMP-2、MMP-9蛋白明顯低于人參皂苷組、恩度組(P<0.05);人參皂苷組與恩度組間無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)(表4)。

    表4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達率比較(%,n=18,±s)

    表4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達率比較(%,n=18,±s)

    注:1)與對照組比較,P<0.05;2)與聯(lián)合組比較,P<0.05

    組別 MMP-2 MMP-9對照組 34.06 32.96人參皂苷組 31.841),2) 28.501),2)恩度組 30.771),2) 28.111),2)聯(lián)合組 27.091) 25.941)F 20.085 24.462 P<0.001 <0.001

    3 討 論

    流行性病學(xué)研究[5]顯示,乳腺癌與雌激素暴露存在密切聯(lián)系,而我國日益增長的工業(yè)污染則進一步加劇了女性雌激素實際負荷量,最終導(dǎo)致我國乳腺癌發(fā)病率逐年增高。MCF-7細胞是一組以雌激素受體陽性為特征的人乳腺癌細胞,可特異性被雌激素及雌激素樣活性因子激活,并增殖、分化[5-7],所以本研究選用MCF-7細胞進行乳腺癌小鼠的造模并研究了人參皂苷rg3聯(lián)合恩度對腫瘤細胞的作用。

    人參皂苷rg3是紅參中提取的一種皂苷,對多種疾病具有改善、預(yù)防作用,如心腦血管疾病、冠心病、記憶力衰退等[8]。研究[9]表明,人參皂苷rg3對包括肺癌、胃癌等在內(nèi)的多種腫瘤細胞具有抑制作用。本研究中,人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的腫瘤質(zhì)量、體積均顯著的低于對照組,并且聯(lián)合組的腫瘤質(zhì)量、體積均顯著的低于人參皂苷組、恩度組,這表明人參皂苷rg3在抑制小鼠腫瘤增殖上具有顯著療效,如與恩度聯(lián)合使用,這一抑制效用可進一步增強。對比各組小鼠腫瘤組織細胞周期發(fā)現(xiàn),人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的G0/G1期、S期均顯著的低于對照組,G2/M期細胞比例高于對照組;聯(lián)合組的G0/G1期、S期顯著的低于人參皂苷組、恩度組,G2/M期細胞比例顯著的高于人參皂苷組、恩度組,這表明人參皂苷rg3可通過將腫瘤細胞周期阻滯在G2/M期來抑制腫瘤細胞增殖、侵襲,并且聯(lián)合恩度使用,療效更佳。

    血管新生理論認為腫瘤增殖、分化與其內(nèi)部毛細血管異常增生有關(guān),而腫瘤新生血管生成影響因素則可能與以下幾方面有關(guān):⑴ 促血管生成因子與抑制因子平衡破壞;⑵ 內(nèi)皮細胞與血管外基質(zhì)幾間質(zhì)細胞相互作用[10];⑶ 血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的相應(yīng)靶點被激活,促使血管內(nèi)皮基底膜降解,并誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)重塑[11]。VEGF是人體內(nèi)最為重要的促血管生成因子,可與血管內(nèi)皮細胞上的特異受體結(jié)合,并誘導(dǎo)血管生成[12]。本研究中,人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組3組小鼠的VEGF mRNA、蛋白顯著的低于對照組,提示人參皂苷rg3可通過抑制VEGF表達來降低腫瘤血管生成,并以此抑制腫瘤增殖、分化。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的VEGF mRNA、蛋白顯著的低于人參皂苷組、恩度組,這表明聯(lián)合使用時,小鼠腫瘤VEGF的抑制作用更強。

    MMPs是中性膚鏈內(nèi)切酶家族,對多種細胞外基質(zhì)具有降解作用。被破壞結(jié)構(gòu)的血管將釋放大量的血管生成因子,誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移,參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展[13]。MMP-9是MMPs家族分子量最大的酶,可被多種具有轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細胞合成,并通過降解結(jié)構(gòu)蛋白Ⅳ型膠原等來幫助腫瘤細胞突破各種屏障[14]。MMP-2同為MMPs家族成員,可作為酶原、糖基化參與物存在于人體各處。MMP-2對明膠,I、IV以及V型膠原具有裂解能力,并以此參與腫瘤侵襲過程[15]。本組研究中,人參皂苷組、恩度組、聯(lián)合組三組小鼠的MMP-2、MMP-9蛋白顯著的低于對照組;聯(lián)合組的MMP-2、MMP-9蛋白顯著的低于人參皂苷組、恩度組,這表明人參皂苷rg3+恩度對MMP-2、MMP-9的抑制效用最大,并以此降低腫瘤的侵襲性。本研究通過動物實驗,對人參皂苷rg3+恩度的臨床價值及作用機制進行分析,發(fā)現(xiàn)人參皂苷rg3+恩度可通過抑制促血管生成因子、MMPs家族表達,阻滯腫瘤細胞周期并降低腫瘤的侵襲性。但對于參皂苷rg3+恩度作用MCF-7乳腺癌細胞的信號路徑以及具體靶點,我們尚無明確結(jié)論,這有待后續(xù)的研究。

    綜上所述,人參皂苷rg3聯(lián)合恩度治療MCF-7乳腺癌細胞移植小鼠,能顯著減低M M P-2、MMP-9蛋白、VEGF mRNA、蛋白的表達,調(diào)節(jié)細胞周期分布,降低腫瘤侵襲性,從而達到抑制腫瘤的目的。

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