胃癌細(xì)胞中miR-455-3p的表達(dá)及其對增殖和凋亡的影響

夏茜，李暉，吳杰

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北 武漢430000）

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其致死率高居癌癥相關(guān)死因的第2位[1]。我國是胃癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率高居所有惡性腫瘤之首，死于胃癌的人數(shù)約占所有腫瘤致死人數(shù)的25%[2]。盡管近年來胃癌的治療取得了很大進(jìn)步，但胃癌的總體預(yù)后仍不理想。miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，其長度大約在20個核苷酸，通過與3'端或5'端的非翻譯區(qū)結(jié)合對mRNA進(jìn)行調(diào)控，影響編碼蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖等過程[2-5]。許多研究[6-9]表明腫瘤的發(fā)生與miRNA的異常表達(dá)密切相關(guān)。miR-455-3p被報道在結(jié)腸癌、食管癌及乳腺癌中參與調(diào)控增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)過程[10-12]。然而目前尚無關(guān)于miR-455-3p在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對胃癌增殖和凋亡的影響的報道，本研究旨在探討miR-455-3p在胃癌中的表達(dá)情況及對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1及5種胃癌細(xì)胞系（AGS、Hs746T、MGC-803、SGC-7901、BSG-823）均購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，DMEM培養(yǎng)基、TRIzol均購自美國Invitrogen公司，caspase-3、caspase-8、caspase-9活性檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，p27 kip1蛋白、p21及GAPDH一抗均購自美國Santa Cruze公司，實(shí)驗(yàn)所需的二抗購自美國BD公司，miR-455-3P模擬物及陰性對照序列均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)分組及轉(zhuǎn)染

正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1及5種胃癌細(xì)胞系均加入至DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用lipofectamine 2000分別將AGS細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-455-3p模擬物和miR-455-3p陰性對照序列，miR-455-3p模擬物序列引物的正義鏈為：5'-GCA GUC CAU GGG CAU AUA CAC-3'，反義鏈為：5'-GUG UAU AUG CCC AUG GAC UGC UU-3'；陰性對照序列為隨機(jī)序列，正義鏈為：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，反義鏈為：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'，轉(zhuǎn)染濃度為300 nmol/mL孔，將兩組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA 提取與 qRT-PCR

按TRIzol reagent說明書從miR-455-3p模擬物組和陰性對照組細(xì)胞中提取總RNA，并采用NanoDrop1000分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司）測定RNA濃度，利用熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）測定。所采用的引物序列如下：miR-455-3p序列（PUBMED號：MIMAT0004784）：5'-GCA GUC CAU GGG CAU AUA CAC-3'，使用2-ΔΔCt方法定量，內(nèi)參選擇為U6小核RNA，并計(jì)算miR-455-3p的相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測

采用CCK8法，將miR-455-3p模擬物組與陰性對照組兩組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，以2×103個/孔將兩組細(xì)胞種植于96孔板上，每孔培養(yǎng)基體積200 μL，經(jīng)分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 d后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，在450 nm波長下，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)，用Annexin V/PI 染色檢測，將miR-455-3p模擬物組和陰性對照組兩組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，PBS清洗2次，并使用結(jié)合緩沖液重懸，加入相應(yīng)比例的Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液以及PI染料，流式細(xì)胞儀檢測Annexin V陽性細(xì)胞比例來確定細(xì)胞凋亡的變化。

1.6 蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot法測定p27 kip1和p21蛋白的表達(dá)量，培養(yǎng)24 h后，收集miR-455-3p模擬物組和陰性對照組細(xì)胞，裂解后，提取總蛋白，以每孔20 μg蛋白量上樣，濃縮膠100 V 30 min，分離膠60 V 1 h，轉(zhuǎn)膜，加入p27 kip1和p21一抗，濃度為1:200，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，加入二抗，濃度為1:1 000，顯影液曝光，以GAPDH為內(nèi)參，測定條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以目的蛋白測定值與GAPDH的比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 caspase 酶活性檢測

依據(jù)caspase活性檢測試劑盒說明書，將miR-455-3p模擬物組和陰性對照組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，1 000r/min低速離心5 min，收集2×103個細(xì)胞，裂解細(xì)胞，分別加入caspase酶活性檢測試劑盒，在405 nm下用分光光度計(jì)測量兩組吸光度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-455-3p在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

qRT-PCR示：miR-455-3p在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中相對表達(dá)量為0.10±0.03，Hs746T中為0.45±0.04，MGC-803中為0.25±0.03，SGC7901中為0.30±0.07，BSG823為0.26±0.03，正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1相對表達(dá)量為1.0±0.03，miR-455-3p在5種胃癌細(xì)胞系中的相對表達(dá)量明顯低于RGM-1細(xì)胞系（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 miR-455-3p在胃癌細(xì)胞系及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中的表達(dá) 與RGM-1細(xì)胞比較，1）P＜0.01；2）P＜0.001Figure 1 Expressions of miR-455-3p in normal gastric mucous cell line and different types of gastric cancer cell lines 1) P＜0.01;2) P＜0.001 vs. RGM-1 cells

2.2 miR-455-3p過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖的影響

miR-455-3p模擬物組與陰性對照組比較，在轉(zhuǎn)染后0、1、2、3、4 d的OD 450 nm值分別為[（0.29±0.03）vs.（0.27±0.04），P＞0.05]，[（0.43±0.08）vs.（0.75±0.10），P＜0.05]，[（0.69±0.09vs.（1.57±0.25），P＜0.05]，[（1.13±0.15）vs.（2.23±0.19），P＜0.01]，[（1.72±0.20）vs.（3.48±0.27），P＜0.001]（圖2）。

圖2 miR-455-3p模擬物組和陰性對照組增殖曲線的比較與陰性對照比較，1）P＜0.05；2）P＜0.01；3）P＜0.001Figure 2 Comparison of the proliferation curves of miR-455-3p mimics group and negative control group 1) P＜0.05;2) P＜0.01;3) P＜0.001 vs. negative control group

2.3 miR-455-3p過表達(dá)對胃癌細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞術(shù)示，miR-455-3p模擬物組細(xì)胞凋亡率為（21.33±1.20）%，陰性對照組為（1.46±0.14）%，miR-455-3p模擬物組細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對照組（P＜0.001）（圖3）。

圖3 miR-455-3p模擬物組和陰性對照組凋亡情況比較 A：流式細(xì)胞術(shù)示兩組的凋亡情況；B：兩組凋亡率比較Figure 3 Comparison of apoptosis of miR-455-3p mimics group and negative control group A:Apoptosis examined by flow cytometer;B:Comparison of the apoptosis rates between the two groups

2.4 miR-455-3p 過表達(dá)對 p27 kip1 和 p21 蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p27 kip1和p21蛋白，發(fā)現(xiàn)miR-455-3p模擬物組p27 kip1表達(dá)量明顯高于陰性對照組[（3.1±0.27）vs.1.0，P＜0.01]；miR-455-3p模擬物組p21表達(dá)量與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.1±0.05）vs.1.0，P＞0.05]（圖4）。

圖4 miR-455-3p模擬物組與陰性對照組P27 kip1與P21表達(dá)情況Figure 4 Protein expressions of P27 kip1 and P21 in miR-455-3p mimics group and negative control group

2.5 miR-455-3p過表達(dá)對caspase蛋白活性的影響

以陰性對照組為參照，miR-455-3p模擬物組caspase-8相對活性為0.95±0.07、caspase-9相對活性為2.1±0.15、caspase-3相對活性為3.4±0.3，后兩項(xiàng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 miR-455-3p模擬物組與陰性對照組caspase酶活性比較Figure 5 Comparison of activities of caspase enzymes of miR-455-3p mimics group and negative control group

3 討 論

胃癌的發(fā)生及發(fā)展是受到包括miRNA在內(nèi)的眾多基因參與及調(diào)控的結(jié)果[13]。miRNA已成為胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可起促癌或者抑癌作用[13]。Zhang等[14]報道m(xù)iR-21在人胃癌細(xì)胞及組織中表達(dá)增加，且miR-21高表達(dá)能顯著促進(jìn)人胃癌細(xì)胞株增殖與侵襲能力。Katada等[15]分析了42 個未分化胃癌及鄰近正常胃組織的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-34b、miR-34c、miR-128a、miR-20b及miR-150在未分化胃癌中的表達(dá)水平顯著升高，且miR-20b 及miR-150高表達(dá)的患者生存率低，反之在未分化胃癌中miR-128b、miR-129 及miR-148 表達(dá)水平明顯下調(diào)；miR-27a的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Motoyama等[16]發(fā)現(xiàn)let-7家族的表達(dá)水平與高遷移率族蛋白A2呈負(fù)相關(guān)，且是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因子。Tie等[17]證實(shí)了miR-218與Robo1蛋白的表達(dá)負(fù)相關(guān)，miR-218低表達(dá)可激活Robo1-Slit通路并誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移，而過表達(dá)的miR-218在體外可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲，并認(rèn)為miR-218可作為胃癌靶向治療的候選基因。Guo等[18]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-331-3p可以調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄因子E2F1進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

在結(jié)腸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-455-3p可抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡，起抑癌基因的作用[10]。在三陰性乳腺癌中，過表達(dá)miR-455-3p通過靶向作用于抑癌基因EI24，而促進(jìn)遷移和侵襲[11]。在食管鱗癌中，miR-455-3p通過靶向FAM83F抑制細(xì)胞增殖和侵襲[12]。本文研究了miR-455-3p對胃癌增殖的影響，并初步探尋了其機(jī)制，相對于正常胃細(xì)胞系，miR-455-3p在5種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)量均顯著地下調(diào)；miR-455-3p的過表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS的增殖，這表明miR-455-3p可能在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮著抑癌基因的作用。

p27 kip1是一種熱穩(wěn)定蛋白，又稱激酶抑制蛋白1（kip1），是能夠結(jié)合細(xì)胞周期蛋白-周期素依賴激酶2復(fù)合體的一種多肽分子，p27 kip1與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切，具有負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖能力的作用，許多研究[19-24]證實(shí)p27 kip1的表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度的增高而降低。通過發(fā)揮細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控作用，p27 kip1抑制細(xì)胞周期素E、D等G1期激酶復(fù)合物，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，防止細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖和分化；當(dāng) p27 kip1表達(dá)水平下降時，這種細(xì)胞周期阻滯作用便會減弱，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖和分化，促進(jìn)腫瘤生成、浸潤及進(jìn)展[20-21]。本研究進(jìn)一步通過Western blot檢測了miR-455-3p模擬物組和陰性對照組p27 KIP1和p21蛋白的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-455-3p模擬物組p27 kip1表達(dá)量顯著高于陰性對照組，這與miR-455-3p模擬物組抑制增殖的作用相一致，可能通過抑制細(xì)胞周期素E、D等G1期激酶復(fù)合物，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[20-21]。而p21在兩組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

進(jìn)一步，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)m i R-4 5 5-3 p能促進(jìn)胃癌細(xì)胞系A(chǔ) G S的凋亡，并顯著增加caspase-9、caspase-3的活力，這說明miR-455-3p的表達(dá)上調(diào)可能通過增加caspase-9、caspase-3的活力而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，而miR-455-3p表達(dá)上調(diào)對于p21蛋白的水平及caspase-8活力影響不大。caspase-3是細(xì)胞凋亡途徑中的重要調(diào)控因子，caspase-9、caspase-3均為內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)凋亡的重要組成部分。作為caspase系統(tǒng)下游的重要成員，caspase-3的激活是bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所必需的步驟，并且caspase-3與Bcl-2、Bax等關(guān)系密切并相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡[25]。黃斌等[25]研究發(fā)現(xiàn)靶向治療后的胃癌組織caspase-3水平明顯上調(diào)，并且與正常組織相比較，胃癌細(xì)胞及組織的caspase-3水平明顯下調(diào)，這說明caspase-3水平與腫瘤惡性程度可能呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)論與黃斌等[25]的結(jié)果一致，說明了miR-455-3p可能通過上調(diào)caspase-9、caspase-3的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。同時我們的結(jié)果也表明了miR-455-3p有望成為胃癌治療的新靶點(diǎn)及突破口。

當(dāng)然，本研究也存在一些不足之處，比如miR-455-3p的下游靶基因尚需要通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，miR-455-3p在動物體內(nèi)的作用如何也需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究證明了miR-455-3p在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá)水平，miR-455-3p表達(dá)上調(diào)能夠通過上調(diào)p27 kip1表達(dá)水平抑制胃癌細(xì)胞增殖并通過上調(diào)caspase-9、caspase-3的表達(dá)水平而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，這為深入揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視點(diǎn)，且可能作為一個新的治療靶點(diǎn)。

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