巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子促進(jìn)有氧糖酵解與直腸癌細(xì)胞耐藥性的關(guān)系

黃榮，汪泓，陳保華，樊明湖

（中國(guó)人民解放軍第一八四醫(yī)院 普通外科，江西 鷹潭 335000）

近年來(lái)，隨著人們健康意識(shí)的提高，結(jié)直腸癌的診斷和治療有顯著的提高[1]。但隨著治療進(jìn)展，結(jié)直腸癌耐藥的發(fā)生率也越來(lái)越高。結(jié)直腸癌耐藥的發(fā)生嚴(yán)重影響了治療效果，嚴(yán)重威脅患者的生存率[2-3]。因此，進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌的耐藥機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[4-6]。新近的研究[8]表明，MIF與乳腺癌[7]、骨腫瘤等耐藥相關(guān)，但其是否參與結(jié)直腸癌耐藥的發(fā)生及具體機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究進(jìn)一步探討MIF在結(jié)直腸癌耐藥的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株L o V o來(lái)源本實(shí)驗(yàn)室。D M E M培養(yǎng)基（l i f e公司，美國(guó)），胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）；5-氟尿嘧啶（5-FU）（Sigma公司，美國(guó)）；6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2（6-phosphofructo-2-kinase，P F K F B 3）抑制劑P F K-1 5（S e l l e c k公司，中國(guó)）；熒光標(biāo)記的葡萄糖類(lèi)似物2-N B D G（Thermo公司，美國(guó)）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒和乳酸（lactate）含量檢測(cè)試劑盒（Sigma公司，美國(guó)）；C C K-8試劑盒（D o j i n d o公司，日本）；MIF抗體（CST公司，美國(guó)）；β-actin（proteintech公司，中國(guó)）；嘌呤霉素（和元生物，上海），LipofectamineTM2000 Transfection Reagent（lip-2000，invitrogen，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo（LoVo/5-FU）構(gòu)建 耐藥株的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[9-11]報(bào)道的方法。用含5-FU的培養(yǎng)基（DMEM，含10%胎牛血清）培養(yǎng)LoVo，從5 μmol/L開(kāi)始，溶度逐漸遞增，每2周增加 5 μmol/L，持續(xù) 24 周?？梢?jiàn) LoVo在 15 μmol/L 保持穩(wěn)定生長(zhǎng)。

1.2.2 5-FU對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo生長(zhǎng)抑制曲線建立 參考Wei等[12]方法構(gòu)建生長(zhǎng)抑制曲線。1×104個(gè)/孔的結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo種于96孔板中，12 h后，加入不同溶度的 5-FU（10 μmol/L～1 mmol/L）。孵育 72 h 后，加入 CCK-8 10 μL/孔孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，描繪生長(zhǎng)抑制曲線，計(jì)算 IC50。

1.2.3 干預(yù)處理 ⑴ MIF的siRNA干擾：si-RNA由上海吉瑪生物公司幫忙設(shè)計(jì)及合成，陰性對(duì)照序列：GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC，si-MIF：ACA GGG UCU ACA UCA AUA dTdT。 將 20 μmol si-RNA 和 5 μL lip-2000 混 合 于 100 μL 無(wú) 血 清的DMEM中靜置15 min后，加入細(xì)胞長(zhǎng)至70%的6孔板中。12 h后更換含10%胎牛血清的新鮮DMEM，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，Western blot檢測(cè) MIF 蛋白水平。⑵ PFKFB3抑制劑PFK-15處理：PFK-15按終濃度 10 μmol/L預(yù)處理細(xì)胞 1 h后，再與相應(yīng)處理。⑶ MIF過(guò)表達(dá)：過(guò)表達(dá)MIF蛋白的慢病毒由上海和元生物予構(gòu)建及合成。1×105/孔細(xì)胞種于6孔板中，24 h后加入終滴度為5×106的慢病毒，12 h后更換繼續(xù)含10%胎牛血清的新鮮DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。同時(shí)給予終濃度為800 μg/L的嘌呤霉素培養(yǎng)1周，觀察細(xì)胞再無(wú)死亡，并熒光顯微鏡下95%細(xì)胞帶綠色應(yīng)該后Western blot檢測(cè)MIF蛋白表達(dá)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)MIF表達(dá) 提取全細(xì)胞胞漿蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水煮10 min后-20 ℃保存。SDS-PAGE 膠分離蛋白（90 V，1.5 h），轉(zhuǎn)膜（冰浴，90 V，2 h），封閉（5%脫脂奶粉，常溫，2 h），一抗（1:1 000）4 ℃過(guò)夜孵育，二抗（1:5 000）常溫 1 h，TBST 5min/次 ×3 次洗膜后ECL顯影。

1.2.5 葡萄糖攝取率檢測(cè) 參考Fischer等[13]的方法，葡萄糖的攝取率通過(guò)細(xì)胞對(duì)2-NBDG攝取量來(lái)反映。細(xì)胞在無(wú)血清條件下培養(yǎng)24 h后更換為含37 kBq/mL 2-NBDG 的低糖 DMEM 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。消化細(xì)胞后留小部分細(xì)胞計(jì)數(shù)，其他用0.5 mol/L氫氧化鈉裂解細(xì)胞15 min后，加入同體積0.5 mol/L鹽酸中和。用液體閃爍計(jì)數(shù)儀（HIDEX 300SL，芬蘭）檢測(cè)細(xì)胞裂解液的dpm值。（LoVo總放射活性-非特異性結(jié)合的放射活性）/（細(xì)胞數(shù)·24 h）即得出LoVo葡萄糖攝取量。

1.2.6 微孔法檢測(cè)LDH活性 LDH活性檢測(cè)根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（Sigma-Aldrich，MAK066）進(jìn)行。收集各組細(xì)胞1×106，加入100 μL細(xì)胞裂解液孵 育 冰 上 10 min 后，13 000r/min 離 心 10 min去除雜質(zhì)，收集上清。乳酸溶液、1×的INT溶液、酶溶液等體積混合為工作液。50 μL標(biāo)準(zhǔn)版品（10 milliunits/mL）或樣品和 50 μL 工作液等體積混合后加入96孔板中，室溫避光孵育30 min，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)量樣品吸光度。LDH活性=（樣品孔吸光度-背景空白對(duì)照孔吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.2.7 微孔法檢測(cè)乳酸水平 乳酸水平檢測(cè)根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)（Sigma-Aldrich，MAK064）進(jìn)行。各組細(xì)胞按1×106/孔種于6孔版中，12 h后更換1 mL/孔無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)基，13 000r/min 離心 10 min 去除雜質(zhì)。將 20 μL樣品、26 μL乳酸鹽測(cè)定緩沖液、2 μL乳酸酶混合物和2 μL乳酸鹽探針混合，在室溫下孵育30 min。酶標(biāo)儀570 nm測(cè)量樣品吸光度。用溶度微1 mmol/L的乳酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物 0、2、4、6、8、10 μL分別加入由26 μL乳酸鹽測(cè)定緩沖液、2 μL乳酸酶混合物和2 μL乳酸鹽探針混合物中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo中MIF表達(dá)和有氧糖酵解的變化

通過(guò)用5-FU培養(yǎng)LoVo 6個(gè)月，成功構(gòu)建對(duì)5-FU耐藥的結(jié)直腸癌LoVo/5-FU細(xì)胞，LoVo和LoVo/5-FU對(duì)5-FU的IC50分別為0.220和5.600 μmol/L。同時(shí)進(jìn)一步檢測(cè)MIF蛋白表達(dá)和有氧糖酵解情況，結(jié)果顯示LoVo/5-FU細(xì)胞MIF蛋白表達(dá)、葡萄糖攝取率、LDH活性、乳酸產(chǎn)生都較LoVo細(xì)胞明顯升高（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 下調(diào)MIF對(duì)LoVo/5-FU耐藥和有氧糖酵解的影響

為了解MIF高表達(dá)介與LoVo耐藥及有氧糖酵解的關(guān)系，通過(guò)siRNA下調(diào)LoVo/5-FU中MIF蛋白表達(dá)進(jìn)一步觀察上述指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示siRNA干擾后，LoVo/5-FU細(xì)胞MIF蛋白表達(dá)、葡萄糖攝取率、LDH活性、乳酸水平以及對(duì)5-FU IC50均明顯下降（圖2）。

2.3 抑制有氧糖酵解對(duì)LoVo/5-FU對(duì)5-FU耐藥的影響

進(jìn)一步用P F K-1 5抑制有氧糖酵解，觀察LoVo/5-FU對(duì)5-FU耐藥的變化。結(jié)果顯示，PFK-15可減少LoVo/5-FU葡萄糖社區(qū)了和乳酸水平（均P＜0.05），但對(duì)LDH活性影響不大（P＞0.05）；同時(shí)，明顯減少LoVo/5-FU對(duì)5-FU耐藥（圖3）。

圖2 下調(diào)MIF對(duì)LoVo/5-FU耐藥和糖酵解的影響 A：Western blot檢測(cè)MIF蛋白表達(dá)與灰度分析結(jié)果；B：糖酵解相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果；C：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線與IC50Figure 2 Effects of MIF knockdown on drug resistance and aerobic glycolysis in LoVo/5-FU cells A:Western blot analysis for MIF protein expressions and results of grayscale intensity analysis;B:Results of detection of glycolysis related markers;C:Cell growth inhibition curves and IC50 values

圖3 抑制糖酵解對(duì)LoVo/5-FU耐藥的影響 A：糖酵解相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果；B：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線與IC50Figure 3 Effects of inhibition of aerobic glycolysis on drug resistance of LoVo/5-FU cells A:Results of detection of glycolysis related markers;B:Cell growth inhibition curves and IC50 values

2.4 MIF過(guò)表達(dá)對(duì)LoVo對(duì)5-FU耐藥的影響及抑制有氧糖酵解的干預(yù)作用

為進(jìn)一步探討三者的關(guān)系，在過(guò)表達(dá)MIF的LoVo/5-FU細(xì)胞上觀察以上指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MIF后，LoVo/5-FU細(xì)胞MIF蛋白表達(dá)、葡萄糖攝取率、LDH活性、乳酸水平和5-FU的IC50均明顯增加（均P＜0.05）；加用有氧糖酵解抑制劑PFK-15后，MIF過(guò)表達(dá)的上述作用除了LDH活性無(wú)明顯有下降外，其他作用被明顯抑制（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 MIF過(guò)表達(dá)對(duì)LoVo對(duì)5-FU耐藥的影響及同時(shí)抑制有氧糖酵解的干預(yù)作用 A：Western blot檢測(cè)MIF蛋白表達(dá)與灰度分析結(jié)果；B：糖酵解相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果；C：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線與IC50Figure 4 Effects of MIF overexpression on drug resistance of LoVo cells and interventional effects of inhibition of aerobic glycolysis A:Western blot analysis for MIF protein expressions and results of grayscale intensity analysis;B:Results of detection of glycolysis related markers;C:Cell growth inhibition curves and IC50 values

3 討 論

化療是結(jié)直腸癌治療的重要手段之一，如何提高化療療效和減少腫瘤耐藥的能力是目前研究的熱點(diǎn)[14-15]。本研究通過(guò)5-FU構(gòu)建耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo（LoVo/5-FU），發(fā)現(xiàn)其MIF蛋白表達(dá)和有氧糖酵解水平都明顯增加；而抑制MIF蛋白表達(dá)或有氧糖酵解，能顯著減少LoVo/5-FU的耐藥能力。另一方面，本研究也發(fā)現(xiàn)MIF可增加LoVo的有氧糖酵解和對(duì)5-FU的耐藥能力。

MIF因能抑制單核和巨噬細(xì)胞移動(dòng)而得名。近年來(lái)研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，MIF在腫瘤組織中高表達(dá)，其通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡發(fā)生和促進(jìn)血管生成等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步的研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，MIF在腫瘤耐藥中也發(fā)揮重要作用，MIF可抑制自噬誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，進(jìn)而增加乳腺癌和骨肉瘤等腫瘤的耐藥能力。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在LoVo/5-FU中，MIF的表達(dá)較LoVo顯著增加；在LoVo中過(guò)表達(dá)MIF可以增加LoVo對(duì)5-FU的耐藥；而敲低MIF表達(dá)后，LoVo/5-FU的耐藥能力被顯著抑制。由此說(shuō)明，MIF是調(diào)控結(jié)直腸癌耐藥的一個(gè)重要因子。

MIF是如何調(diào)控結(jié)直腸癌耐藥能力增加的？現(xiàn)有研究[19-21]表明，腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Ge等[22]發(fā)現(xiàn)，有氧糖酵解的關(guān)鍵酶之一PFKFB3可以通過(guò)上調(diào)乳酸的生成，激活TLR4信號(hào)通路，誘導(dǎo)乳腺癌耐藥能力增加；而抑制有氧糖酵解也成為減少腫瘤耐藥能力的重要手段[23-25]。本研究運(yùn)用PFKFB3的抑制劑PFK-15處理LoVo/5-FU，減少有氧糖酵解后，發(fā)現(xiàn)LoVo/5-FU的耐藥能力被明顯抑制。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MIF所誘導(dǎo)的LoVo耐藥能力的增加可以被PFK-15所抑制。提示，MIF介導(dǎo)的結(jié)直腸癌耐藥能力增加可能是通過(guò)上調(diào)結(jié)直腸癌有氧糖酵解。

綜上所述，MIF介導(dǎo)的有氧糖酵解可能是結(jié)直腸癌耐藥能力增加的重要機(jī)制，是減少直腸癌耐藥能力的一個(gè)靶點(diǎn)。

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