Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴增表達與蒽環(huán)類藥物療效關(guān)系的研究

張成娟，董鳳梅，徐本玲，袁 鵬

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴增表達與蒽環(huán)類藥物療效關(guān)系的研究

張成娟1，董鳳梅2，徐本玲1，袁 鵬1

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

目的 探討Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴增表達與蒽環(huán)類藥物療效的關(guān)系。方法 207例經(jīng)病理證實的乳腺癌患者均接受FEC方案新輔助化療，并測定其Ki-67、Her-2及Top2A基因的表達。結(jié)果 207例乳腺癌患者中，Ki-67分級為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例；Her-2基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Top2A基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)。Ki-67分級與Her-2基因、Top2A基因擴增無關(guān) (P>0.05)。Her-2、Top2A的擴增與化療療效均呈正相關(guān)(r=0.59、0.58,P<0.05)。結(jié)論 Her-2、Top2A的表達對乳腺癌患者化療藥物的選擇及預(yù)后的判斷具有重要的指導(dǎo)價值。

Ki-67；Her-2；DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα；乳腺癌；蒽環(huán)類藥物

近年來，乳腺癌已成為全世界威脅女性健康的第一大惡性腫瘤，其發(fā)病率正以每年5%的速度呈增長狀態(tài)，且年輕、低齡化的趨勢越來越明顯[1-3]。在乳腺癌各種治療中，化療的地位較為重要，而腫瘤細胞存在的多藥耐藥現(xiàn)象是化療失敗的主要因素。蒽環(huán)類藥物作為乳腺癌化療較為傳統(tǒng)的一類藥物，近年來關(guān)于其急性不良反應(yīng)的報道較多，且有少數(shù)患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，提示部分蒽環(huán)類藥物選擇性不高的現(xiàn)狀[4]。因此，尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測蒽環(huán)類藥物敏感性的新的生物學(xué)標(biāo)志物質(zhì)，對臨床個體化治療手段的選擇尤為重要。目前人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(DNA topoisomerase Ⅱα，Top2A)及Ki-67在乳腺癌中的擴增表達研究較少。因此本文通過對接受新輔助化療的乳腺癌患者中Ki-67、Her-2及Top2A的擴增表達及其與蒽環(huán)類藥物療效的關(guān)系進行研究，探討其能否成為預(yù)測蒽環(huán)類化療藥物療效的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2008年1月至2013年12月收治的207例接受新輔助化療的經(jīng)病理證實的乳腺癌患者，均為女性，年齡23～56(40±16)歲，參照TNM標(biāo)準(zhǔn)分期為Ⅱ期71例，Ⅲ期136例?；颊呷榉可暇嬖诳蓽y量的病灶，腫瘤直徑3～12 cm?；熐靶谐Ｒ?guī)血及心、肝、腎功能檢查，排除化療禁忌證者、年齡>56歲者以及不配合研究者。

1.2 化療方案的選擇 所有患者均采用FEC方案進行化療：5-氟尿嘧啶500 mg·m-2，環(huán)磷酰胺500 mg·m-2，表阿霉素100 mg·m-2，均采取靜脈滴注，化療結(jié)束后3 d給予患者行療效評估。

1.3 Ki-67的檢測 采用Envision二步法，石蠟切片并脫蠟，放入乙二胺四乙酸修復(fù)液行修復(fù)5 min；行PBS沖洗，加入一抗過夜(4 ℃)。重復(fù)PBS沖洗，加入二抗40 min(37 ℃)；重復(fù)PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺液顯色，蘇木素-尹紅復(fù)染后封片行鏡下觀察。其中每張切片中選擇5個高倍視野，根據(jù)切片中所選視野的陽性細胞占全部細胞的比例進行結(jié)果判定，其中<5%為陰性(-)、5%～<25%為弱陽性(+)、25%～50%為陽性(++)、>50%為強陽性(+++)。

1.4 Her-2及Top2A基因表達的檢測 采用熒光原位雜交(FISH)檢測Her-2、Top2A的基因表達。具體過程為：石蠟切片脫蠟，放入預(yù)處理液中10 min(95 ℃),胃蛋白酶孵育10 min(25 ℃)，雜交儀中變性5 min(80 ℃)后45 ℃雜交過夜，DAPI中顯色。100高倍鏡下觀察FISH結(jié)果并對腫瘤細胞核的信號進行計數(shù)。結(jié)果紅色信號的總數(shù)/綠色信號的總數(shù)比值≥2.2時，即為Her-2基因、Top2A基因擴增;不超過1.8時為無擴增; 1.8～2.2時，則需要再計數(shù)20個細胞核中的信號。

1.5 療效評估 療效按WHO制定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)評估，完全緩解(CR)：所有病灶均完全消失；部分緩解(PR)：靶病灶最大徑之和減少≥50%，至少維持30 d；疾病進展(PD)：靶病灶最大徑之和至少增加≥25%，或出現(xiàn)新病灶。疾病穩(wěn)定(SD) 靶病灶最大徑之和縮小未達PR，或增大未達PD。以CR+PR為有效，以PD+SD為無效。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，等級計數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67分級及其與Top2A、Her-2基因擴增的關(guān)系 207例患者中，Ki-67分級為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例。Her-2基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Top2A基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Ki-67分級與Top2A基因、Her-2基因擴增無關(guān)(χ2=1.28、1.33，P>0.05)。見表1、圖1。

表1 Ki-67分級及其與Top2A、Her-2基因擴增的關(guān)系

2.2 乳腺癌患者Her-2及Top2A擴增與含蒽環(huán)類藥物化療療效的關(guān)系 Her-2基因擴增26例中有效為10例(38.5%)，無擴增的118例患者中無有效病例出現(xiàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Top2A基因擴增的26例患者中有效為21例(80.77%)，無擴增的118例患者中有效為30例(16.6%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且Her-2、Top2A的擴增與化療療效均呈正相關(guān)(r=0.59、0.58，P<0.05)。見表2。

圖1 Her-2及Top2A基因在乳腺癌患者中的擴增情況

A:Her-2基因在乳腺癌上無擴增，紅色信號的Her-2基因與綠色信號的CEN17比值<1.8；B:Her-2基因在乳腺癌上擴增，紅色信號的Her-2基因與綠色信號的CEN17比值≥2.2；C:Top2A基因在乳腺癌上無擴增，紅色信號的Top2A基因與綠色信號的CEN17比值<1.8；D: Top2A基因在乳腺癌上無擴增，紅色信號的Top2A基因與綠色信號的CEN17比值不低于2.2

表2 乳腺癌患者Her-2及Top2A擴增與含蒽環(huán)類藥物化療療效的關(guān)系

3 討論

乳腺癌新輔助化療針對腫瘤，可有效縮小其病灶范圍，提高保乳治療的效果及概率，針對化療后的腫瘤變化，能夠及時調(diào)整方案，使得該病的治療更有選擇及針對性，效果較為明顯。含蒽環(huán)類藥物的治療方案是目前最為常用的方案之一。

Top2A作為調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動態(tài)變化、控制核酸生理功能的一種關(guān)鍵酶，在多種細胞的酶類中均有存在，且在增殖細胞中呈現(xiàn)有周期特異性表達。Top2A在腫瘤增殖的不同細胞周期中表達各異，一般表現(xiàn)為在DNA復(fù)制后期及有絲分裂期延長，有絲分裂期結(jié)束后表達有所下降，提示腫瘤增殖受Top2A表達的影響[5]。目前較為一致的觀點認為，Her-2蛋白的過表達與基因擴增存在一定的相關(guān)性，且Her-2與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系較為密切[6]。

有學(xué)者認為位于17q12-21基因座的基因，可能在調(diào)節(jié)乳腺癌對藥物的反應(yīng)性中起作用[7-8]。作為蒽環(huán)類藥物重要的作用靶點之一，Top2A基因的擴增或缺失可影響蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)及其藥效。Top2A陽性表達可提示患者的預(yù)后不良，對患者的預(yù)后評估比較重要[9-11]。另外，Her-2基因突變可導(dǎo)致基因擴增表達過度，引起Top2A基因出現(xiàn)異常，Her-2狀態(tài)對預(yù)測蒽環(huán)類化療藥物的化療效果尚無統(tǒng)一定論。Ki-67在臨床監(jiān)測中也較為重要，其高水平的表達可提示細胞增殖活動較為活躍，表明此類患者的預(yù)后不良。新輔助化療后Ki-67表達的下降可反映腫瘤細胞的減少及對化療的敏感程度，并有利于乳腺癌的預(yù)后[12-13]。有學(xué)者通過對385例化療前核心穿刺標(biāo)本、新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本的Ki-67檢測發(fā)現(xiàn)新輔助化療前后Ki-67的陽性細胞百分比的改變可作為影響預(yù)后的因素[14-17]。而本研究中Ki-67的表達未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，提示Ki-67蛋白表達與預(yù)后相關(guān)性不明顯，可能與本研究的研究例數(shù)、治療時間有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，207例患者中，Ki-67分級為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例；Her-2基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)；Top2A基因擴增26例(12.6%)，未擴增181例(87.4%)，Ki-67分級與Top2A基因、Her-2基因擴增無關(guān)(P>0.05)。另外，HER-2基因擴增26例中有效為10例(38.5%)，無擴增的118例患者中無有效病例出現(xiàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Top2A基因擴增的26例患者中有效為21例(80.77%)，無擴增的118例患者中有效為30例(16.6%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且Her-2的擴增、Top2A的擴增與化療效果均呈正相關(guān)(r=0.59、0.58，P<0.05)，可見Top2A對療效影響的相關(guān)系數(shù)高于Her-2對療效影響的相關(guān)系數(shù)，提示Top2A擴增時，對含蒽環(huán)類化療藥物敏感性較高，化療獲益較大，蒽環(huán)類化療藥物的療效更好，Top2A可能比Her-2對蒽環(huán)類藥物更有預(yù)測作用?？赡艿脑蚍治鰹椋篐er-2可能并不能直接預(yù)測蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)性，Her-2和蒽環(huán)類藥物效能的關(guān)系可能依賴于Top2A的同時擴增，并且Her-2激活可以直接增加Top2A的活性。

綜上所述，通過對乳腺癌中Ki-67、Her-2基因、Top2A基因表達的研究發(fā)現(xiàn)，Her-2、Top2A基因不僅可以對乳腺癌患者進行較為準(zhǔn)確的個體化分析和評價，Ki-67的表達較不明顯?？蓪er-2基因、Top2A基因作為準(zhǔn)確預(yù)測蒽環(huán)類藥物敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物，對于降低腫瘤對蒽環(huán)類藥物耐藥性，提高化療藥物的敏感性，最終達到提高乳腺癌患者無病生存期和總生存期的目的有一定作用。

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Relationship Between Ki-67,Her-2 and Top2A Amplification in the Breast Cancer and Efficacy of Anthracycline-based Regimen

ZHANG Chengjuan1,DONG Fengmei2,XU Benling1,YUAN Peng1

(1.HenanProvincialTumorHospital,Zhengzhou450008,China;2.ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou450007,China)

Objective To explore the relationship of Ki-67,Her-2 and Top2A amplification in the breast cancer and efficacy of anthracycline-based regimen.Methods The 207 patients with breast cancer confirmed by pathology underwent the FCC regimen neoadjuvant chemotherapy,and the Ki-67,Her-2,Top2A gene expressions were detected.Results Among the 207 patients,Ki-67 classification of (-) were 32 patients,58 patients were (+),95 patients were (++),22 patients were (+++).Her-2 gene amplification were 26 patients (12.6%),no-amplification were 181 patients (87.4%).Top2A gene amplification were 26 patients (12.6%),no-amplification were 181 patients (87.4%).Ki-67 classification was unrelated with the amplification of Her-2 and Top2A genes (P>0.05).Her-2 and Top2A amplification were positive correlated with the effect of chemotherapy (r=0.59,0.58;P<0.05).Conclusion The expression of Her-2 and Top2A has important guiding value in the selection of chemotherapy drugs and prognosis of patients with breast cancer.

Ki-67; human epidermal growth factor receptor 2; DNA topoisomerase Ⅱα; breast cancer; augmentation; anthracycline-based drugs

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(編號：81602637)；河南省科技攻關(guān)計劃項目(編號：162102410046)

張成娟(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤靶向治療相關(guān)基因檢測及其臨床應(yīng)用的研究工作。E-mail：zcj2016@126.com

袁鵬(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺癌的診治及其分子靶點研究工作。E-mail：yuanpeng117@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.003

R737.9；R730.53

A

1673-5412(2017)01-0011-04

2016-10-21)