非小細胞肺癌通過EPO/EPOR信號促進自身增殖的分子機制研究

趙麗娟，李正民，何 磊，周繼明，馬曉雯，郝 強，李維娜，張 存，薛曉暢，張 偉，張英起，李 萌

(1.第四軍醫(yī)大學藥學系，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，陜西 西安 710032)

非小細胞肺癌通過EPO/EPOR信號促進自身增殖的分子機制研究

趙麗娟1，李正民2，何 磊1，周繼明1，馬曉雯1，郝 強1，李維娜1，張 存1，薛曉暢1，張 偉1，張英起1，李 萌1

(1.第四軍醫(yī)大學藥學系，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，陜西 西安 710032)

目的 研究促紅細胞生成素(EPO)及其受體(EPOR)在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達情況及其對NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響。方法 qPCR、western blot檢測EPO/EPOR在9種肺癌細胞系中的表達水平；MTT法檢測rhEPO促細胞增殖的作用，流式細胞術檢測rhEPO對細胞凋亡和周期的影響，Transwell檢測細胞遷移；qPCR、western blot檢測rhEPO對Cyclin D1和Cyclin A表達水平的影響。結果 EPO/EPOR在部分肺癌細胞中高表達，rhEPO促進高表達EPO/EPOR的肺癌細胞的增殖，而對肺癌細胞凋亡和遷移無影響，rhEPO誘導Cyclin D1表達，使用Jak2/Stat5抑制劑或干涉Jak2/Stat5后rhEPO作用消失。結論 高表達EPO/EPOR非小細胞肺癌通過Jak2/Stat5/Cyclin D1通路促進自身增殖。

促紅細胞生成素；促紅細胞生成素受體；非小細胞肺癌；細胞增殖

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種重要的促進紅細胞生成的糖蛋白，主要由胎兒肝臟和成人腎臟產生[1]。此外，EPO還具有促進組織修復和再生的作用。EPO主要通過促紅細胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)發(fā)揮其生物學功能。目前，以重組人紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)為主要成份的紅細胞生成刺激劑(erythropoiesis stimulating agents，ESAs)類藥物被廣泛用于腫瘤患者化療后發(fā)生的貧血。然而，有研究[2-6]表明，EPO/EPOR共表達在各種腫瘤，并且與腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲有關，ESAs的使用也會促進腫瘤發(fā)展，縮短患者生存期[7-10]。然而，也有文獻[11-13]認為EPO/EPOR不具有促腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

我國每年肺癌新發(fā)病例約73.3萬，死亡60余萬，發(fā)病率和死亡例數(shù)均居各類惡性腫瘤首位[14]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%以上，NSCLC的治療主要以手術和鉑類化療為主。盡管各種手術方案和化療手段對于NSCLC的治療已取得長足進步，但是NSCLC的5 a生存率仍然很低。與其他腫瘤類似，EPO/EPOR對肺癌發(fā)生、發(fā)展的作用目前也存在較大爭議[15-18]。確定EPO/EPOR在NSCLC中的表達情況，明確EPO/EPOR對NSCLC發(fā)生、發(fā)展的作用不僅對于研究NSCLC的發(fā)生、發(fā)展機制有重要意義，而且對肺癌患者化療后大量使用ESAs的情況具有重要的臨床指導意義。

因此，我們檢測了EPO/EPOR在肺癌細胞系中的表達水平，篩選出EPO/EPOR高表達細胞株，并且證明了rhEPO能夠促進EPO/EPOR高表達肺癌細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，部分NSCLC細胞株能夠分泌EPO，并且表達EPOR。在這些細胞中，EPO/EPOR信號通路能夠通過上調細胞周期蛋白Cyclin D1促進腫瘤細胞增殖。該研究結果提示至少部分NSCLC患者化療后ESAs是不安全的，應予以進一步研究。

1 資料與方法

1.1 材料 正常人支氣管上皮細胞HBEC-3KT和NSCLC細胞系HCC15、H44、H2073、H1993、H1155、H1819、H1833、H3122由美國德州大學西南醫(yī)學中心John Minna教授實驗室提供，NSCLC細胞系A549購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，人EPO依賴性白血病細胞系UT-7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。所有細胞系經(jīng)過短串聯(lián)重復序列基因分型鑒定并且傳代少于6個月。

1.2 試劑 抗EPO、EPOR、Jak2、Stat5、β-actin抗體均購自美國Abcam公司；抗phospho-EPOR、Cyclin D1的抗體及EPO中和抗體均購自美國R&D公司；抗phospho-Jak2、phospho-Stat5、Akt、phospho-Akt、P38、phospho-P38的抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。Jak2抑制劑(AG490)、Stat5抑制劑(CAS285986)、PI3k/Akt抑制劑(LY294002)、p38 MAPK抑制劑 (PD98059)均購自美國Merck Millipore公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) HBEC-3KT細胞在補充有表皮生長因子、牛垂體提取物和慶大霉素的角質形成細胞-無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。A549在含體積分數(shù)10%胎牛血清(FBS)和抗生素的DMEM/F12(11)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其他細胞均在含體積分數(shù)10% FBS和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件37 ℃、體積分數(shù)5% CO2。

1.3.2 qPCR 從細胞中提取RNA,定量后取500 ng總RNA進行反轉錄制備cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR。引物序列如下:EPO:5’-GATAAAGCCGTCAGTGGCCTTC-3’，5’-GGGAGATGGCTTCCTTCTGG G-3’;EPOR:5’-CCTGACGCTCTCCCTCATCC-3’,5’-GCCTTCAAACTCGCTCTCTGG-3’; Cyclin A: 5’-CACTCACTGGCTTTTCATCTTC-3’，5’-CAGAAAACCATTGGTCCCTC-3’；Cyclin D1:5’-TGAGGCGGTAGTAGGACAGG-3’,5’-GACCTTCGTTGCCCTCTGT-3’;βactin:5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’,5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’。

1.3.3 western blot 收集細胞，以含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解。BCA法進行蛋白定量，取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，5% BSA室溫封閉2 h，將PVDF膜與待檢測的一抗4 ℃過夜孵育，再用加入HRP標記的二抗室溫孵育，洗膜后用ECL發(fā)光試劑盒處理PVDF膜，發(fā)光顯影。β-actin用作內參。

1.3.4 MTT檢測 分5組：PBS對照組、5 IU rhEPO、10 IU rhEPO、20 IU rhEPO、10 IU rhEPO+EPO中和抗體(5 μg·mL-1)，細胞以5 000個/孔接種于96孔板，設5個副孔，加藥培養(yǎng)24 h后加20 μL 5 mg·mL-1MTT培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后去上清加200 μL DMSO，震蕩10 min測490 nm光密度(OD)值。

1.3.5 流式細胞術 細胞用50 μmol·L-1依托泊苷或50 μmol·L-1依托泊苷+10 IU·mL-1EPO處理后FITC Annexin V/PI雙染色檢測細胞凋亡。細胞用PBS或10 IU·mL-1rhEPO處理后檢測細胞周期，數(shù)據(jù)使用FlowJo軟件分析。

1.3.6 Transwell 提前12 h用Matrigel 17稀釋液包被Transwell小室基底膜，將小室放入6孔板中，用無血清培養(yǎng)基在37 ℃，30 min水化基底膜。制備細胞懸液，以1×105·mL-1200 μL接種于小室，6孔板下室加入rhEPO 10 IU·mL-1，以PBS做陰性對照，TGF-β(0.5 μg·mL-1)做陽性對照，培養(yǎng)48 h后用結晶紫染色觀察細胞侵襲。

1.3.7 siRNA轉染 將細胞接種于6孔，待細胞密度大于50%時準備轉染，轉染方法按Lipofectamine 2000說明書進行。siRNA序列：Jak2:siJAK2:sense:CCACCUGAAUGCAUUGAAATT,antisense:UUUCAAUGCAUUCAGGUGGTT,siCONsense:CUAGCUAGGTTUCCAUTCCTT,antisense:AUCGCCUTTCGGUAUAUTCTT;STAT5:siSTAT5:sense,CCGGCACAUUCUGUACAAUTT;antisense:AUUGUACAGAAUGUGCCGGTT,siCON:sense,CAUTUGGCCUTUTAACGUATT,antisense:ACCUCGAUTA CUGGCGUAATT。

2 結果

2.1 EPO/EPOR在NSCLC細胞系中的表達 qPCR和western Blot結果顯示，相對于EPO/EPOR高表達的UT-7細胞和EPO/EPOR低表達的正常肺上皮細胞HBEC-3KT，H1155、H1819、H1833和H3122具有較高水平的EPO/EPOR表達，而 A549、HCC15、H44、H1993和H2073細胞中EPO/EPOR表達水平較低(圖1)，EPO與EPOR有共表達特征。

圖1 EPO和EPOR在肺癌細胞系中的表達

2.2 rhEPO促進EPO/EPOR高表達NSCLC細胞的增殖 為了證明EPO對于NSCLC細胞的作用，我們選擇了2種EPO/EPOR高表達的肺癌細胞系H1155、H1819和1種EPO/EPOR低表達的細胞系HCC15。同時，UT-7細胞被用做陽性對照細胞。MTT結果顯示rhEPO能夠明顯促進H1155、H1819和UT-7細胞的增殖，而對HCC15細胞增殖無影響。EPO中和抗體(EPO-NA)能夠有效拮抗rhEPO對H1155和H1819的增殖促進作用(圖2)。流式細胞術結果顯示，rhEPO對于化療藥物Etoposide誘導的細胞凋亡沒有保護作用(圖3)。Transwell實驗證明rhEPO對于NSCLC細胞的遷移也沒有影響，而陽性對照轉化生長因子TGFβ可有效誘導細胞遷移(圖4)。以上結果說明EPO/EPOR能夠促進EPO/EPOR高表達的NSCLC細胞的增殖，而對于凋亡和遷移無影響。

圖2 rhEPO促進EPO/EPOR高表達NSCLC細胞的增殖

圖3 rhEPO對于化療藥物Etoposide誘導的細胞凋亡沒有保護作用

圖4 rhEPO對于NSCLC細胞的遷移沒有影響

2.3 rhEPO上調Cyclin D1促進EPO/EPOR高表達NSCLC細胞的細胞周期 流式細胞術檢測細胞周期結果顯示，rhEPO能夠明顯促進H1819和H1155的S期細胞數(shù)量，減少G0/G1期細胞比例，而對HCC15的細胞周期無影響(圖5)。因此，該結果說明rhEPO通過促進細胞周期發(fā)揮其促細胞增殖的作用。

由于rhEPO促進G1期細胞向S期細胞轉換，因此我們在H1819細胞中檢測了細胞周期蛋白Cyclin D1和Cyclin A表達的變化。實時定量PCR和Western Blot結果顯示rhEPO作用后，Cyclin D1的表達明顯上調，而Cyclin A的水平無變化。該結果說明Cyclin D1是rhEPO促進細胞增殖的關鍵周期蛋白(圖6)。

圖5 rhEPO(10 IU·mL-1)明顯促進EPO/EPOR高表達細胞的細胞周期

圖6 rhEPO明顯促進H1819細胞Cyclin D1的表達，而對Cyclin A 無影響

2.4 rhEPO通過激活EPOR/JAK2/STAT5上調Cyclin D1 既往文獻報道，EPO/EPOR誘導Jak2磷酸化并激活下游Stat5、PI3k/Akt或RAS/RAF/ERK等信號通路發(fā)揮其生物學作用。為了明確EPO/EPOR上調Cyclin D1的信號通路，我們使用Jak2抑制劑(AG490)、Stat5抑制劑(CAS285986)、PI3K/Akt抑制劑(LY294002)或P38MAPK抑制劑(PD98059)分別作用，觀察其對EPO/EPOR上調Cyclin D1的影響。qRT-PCR和western Blot結果顯示Jak2抑制劑(AG490)或Stat5抑制劑(CAS285986)能夠抑制rhEPO上調Cyclin D1，而PI3K/Akt抑制劑(LY294002)或P38MAPK抑制劑(PD98059)對該過程無影響，siRNA干涉Jak2或Stat5的表達后，也發(fā)現(xiàn)了相似的結果(圖7)。以上結果說明EPO/EPOR通過Jak2/Stat5信號通路上調Cyclin D1的表達。

3 討論

目前，EPO/EPOR對于NSCLC發(fā)生、發(fā)展的影響這一問題尚存在很大爭議，比如Saintigny等[17]認為腫瘤組織高表達EPO/EPOR會導致更短的生存期,而Rózsás等[19]則認為腫瘤組織表達EPO是預后較好的標志。因此，證明EPO對NSCLC的作用對于NSCLC發(fā)生、發(fā)展機制的研究具有重要意義。此外，由于rhEPO被廣泛用于NSCLC患者，治療化療引發(fā)的貧血，所以研究EPO對NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響對于rhEPO的臨床應用意義重大。

本研究中我們首次分析了EPO/EPOR在9種NSCLC細胞系中的表達情況，通過與EPO/EPOR高表達的UT-7細胞比較，H1155、H1819、H1833、H3122等4種細胞EPO/EPOR高表達，而其他5種細胞的EPO/EPOR表達水平較低。這一現(xiàn)象與前期報道的近50%的NSCLC患者腫瘤標本中EPO/EPOR表達增高的情況具有一致性，說明部分肺癌高表達EPO[15,17]。為了證明EPO/EPOR高表達細胞與低表達細胞對于rhEPO的反應是否一致，我們選擇了2種高表達細胞(H1155、H1819)和1種低表達細胞(HCC15)為研究對象，進行細胞學實驗。結果證明，rhEPO能夠明顯促進EPO/EPOR高表達細胞的增殖，而對于EPO/EPOR低表達的細胞無影響。該結果說明rhEPO至少促進部分NSCLC細胞的增殖，也提示rhEPO對于腫瘤組織高表達EPO/EPOR的患者應該是不安全的。

圖7 rhEPO通過Jak2/Stat5途徑上調Cyclin D1的表達

為了明確rhEPO促進NSCLC細胞增殖分子機制，我們檢測了細胞周期。結果證明rhEPO通過促進細胞周期發(fā)揮促EPO/EPOR高表達細胞增殖的作用，并且證明了Cyclin D1是rhEPO促進細胞周期的重要周期蛋白。以往文獻[4,20]曾報道活化的EPOR通過Jak2和下游Stat5、PI3K/Akt或Ras/Raf/Erk等信號通路來促進腫瘤細胞增殖或抗凋亡。為了尋找rhEPO上調Cyclin D1的具體分子機制，我們使用了以上分子的抑制劑來進行研究。結果證明只有Jak2/Stat5的抑制劑抑制了rhEPO上調Cyclin D1的作用。因此，我們認為rhEPO 通過Jak2/Stat5/Cyclin D1途徑促進EPO/EPOR高表達細胞的增殖。

綜上所述，我們的研究證明NSCLC細胞中的EPO/EPOR表達不一致，約50%的細胞系EPO/EPOR高表達；rhEPO能夠促進EPO/EPOR高表達細胞的增殖；rhEPO促進增殖的分子機制主要是通過Jak2/Stat5途徑上調周期蛋白Cyclin D1的表達。以上結果提示rhEPO對于腫瘤組織高表達EPO/EPOR的患者應該是不安全的，需要予以注意。

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The Effect of EPO/EPOR on Non-small Cell Lung Cancer Cells and Its Molecular Mechanism

ZHAO Lijuan1，LI Zhengmin2，HE Lei1，ZHOU Jiming1，MA Xiaowen1，HAO Qiang1，LI Weina1，ZHANG Cun1，XUE Xiaochang1，ZHANG Wei1，ZHANG Yingqi1，LI Meng1

(1.DepartmentofPharmacy,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China；2.SlushHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Objective To investigate the mechanism of erythropoietin (EPO) and its receptor (EPOR) on the progression of non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods The expression level of EPO and EPOR in nine NSCLC cell lines were detected by qPCR and western blot.Cell proliferation was detected by MTT assay.Apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.Transwell was used to detect cell invasion.QPCR and western blot were used to detect the effect of rhEPO on the expression of Cyclin D1 and Cyclin A.Results EPO/EPOR were highly expressed in some lung cancer cells.RhEPO promoted the proliferation of lung cancer cells with high expression level of EPO/EPOR,but had no effect on the cell apoptosis and invasion.RhEPO induced the expression of Cyclin D1 but not Cyclin A.The rhEPO-induced Cyclin D1 expression abrogated by Jak2 or Stat5 inhibitor or siRNA.Conclusion EPO/EPOR promotes NSCLC proliferation through Jak2/Stat5 /Cyclin D1 pathway.

erythropoietin; erythropoietin receptor; non-small cell lung cancer; proliferation

國家自然科學基金面上項目(編號：81272517、81673020)；陜西省自然科學基礎研究基金資助項目(編號：2016JM8096,2016SF256)

趙麗娟(1993-)，女，碩士，主要從事腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的基礎研究。E-mail：1508002893@qq.com

李萌(1978-)，博士，副教授，主要從事抗腫瘤藥物研發(fā)及基礎研究。E-mail：limeng@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.001

R734.2;R730.23

A

1673-5412(2017)01-0001-07

2016-10-21)