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    基于Ir/MnO2標(biāo)記型前列腺特異性抗原免疫傳感器的研制

    2017-03-21 06:08:23白茹燕馬玉洪陳志莉胡慧英畢滿玲楊云慧
    化學(xué)傳感器 2017年4期
    關(guān)鍵詞:納米材料抗原電極

    白茹燕,馬玉洪,陳志莉,胡慧英,余 佩,畢滿玲,胡 蓉,楊云慧

    (云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,云南昆明650500)

    0 引言

    前列腺癌是最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一。近年來(lái),前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。前列腺癌的早期診斷對(duì)指導(dǎo)前列腺癌穿刺、治療方式以及疾病預(yù)后具有直接的影響。前列腺癌的早期診斷主要通過(guò)前列腺特異抗原(Prostate specific antigen,PSA)篩查。PSA是目前唯一公認(rèn)的診斷前列腺癌的指標(biāo),其診斷前列腺癌的曲線下面積為0.821[1]。PSA屬于類激肽釋放酶,是前列腺腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的具有244個(gè)氨基酸殘基的、相對(duì)分子質(zhì)量為33000~34000的一種絲氨酸蛋白酶[2]。在正常生理?xiàng)l件下,它存在于前列腺組織、前列腺液、精液、血清和尿液中[3]。PSA顯示出一種類糜蛋白酶的降解底物的特異催化活性,主要作用于新鮮精漿中較大分子的膠蛋白,使它們分解成幾個(gè)低分子量的、可溶性的蛋白片斷,這導(dǎo)致了精液液化,以及隨之而來(lái)的活動(dòng)精子的釋放。大多數(shù)PSA與蛋白酶抑制劑抗糜蛋白酶結(jié)合,只有少量以游離形式存在于血清中[4],因此PSA得檢測(cè)受到了廣大學(xué)者的關(guān)注。

    癌癥生物標(biāo)志物的常規(guī)免疫檢測(cè)方法主要是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法[5],目前PSA的檢測(cè)方法除了酶聯(lián)免疫測(cè)定之外,常用的還有熒光定量檢測(cè)法[6]、放射免疫測(cè)定(RIA)[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]、電泳法[9]、質(zhì)譜免疫測(cè)定[10]等。然而這些常規(guī)免疫測(cè)定法較復(fù)雜,并且耗費(fèi)時(shí)間,操作繁瑣,費(fèi)用昂貴,不適宜病床前的檢測(cè)[11]。因此,急需發(fā)展適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的簡(jiǎn)單、快速、靈敏方法來(lái)檢測(cè)PSA。電化學(xué)免疫傳感器不但結(jié)合了電化學(xué)傳感器和免疫傳感器的雙重優(yōu)點(diǎn),還具有能與抗原-抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合力,具有低成本、高靈敏、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[12]。

    MnO2是一種重要的功能氧化物,具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、合成容易和相對(duì)無(wú)毒等特點(diǎn),在電池材料、磁性材料、催化劑和離子交換劑等方面有廣泛的應(yīng)用[13-14]。MnO2具有多種晶體結(jié)構(gòu)和形貌特征,而納米材料的晶型、尺寸、形貌和維數(shù)對(duì)其性能有重要的影響,因而不同晶型和形貌氧化錳納米材料的可控合成一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題之一[15]。近年來(lái),已報(bào)道的制備納米氧化錳的方法有氧化還原沉淀法[16]、溶膠-凝膠法[17]、液相沉淀法[18]、模板法[19]、電化學(xué)沉積法[20]和低溫水熱法[21]等。其中水熱合成法由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),已成為制備一維納米材料的重要途徑,成功地合成了許多具有獨(dú)特形貌和優(yōu)良物理、化學(xué)性質(zhì)的納米材料。

    該文以KMnO4與MnCl2·4H2O為反應(yīng)原料,采用水熱合成法,制備了蠶繭狀納米MnO2。通過(guò)控制反應(yīng)溫度從而達(dá)到調(diào)控MnO2形貌的目的,未使用任何表面活性劑,避免了繁瑣的后期處理過(guò)程和對(duì)環(huán)境的污染。并在所制備MnO2納米材料上負(fù)載了貴金屬Ir。采用Ir/MnO2標(biāo)記PSA抗體(Ab2),并在電極上修飾Ag/COF-LZU1固定了PSA抗體(Ab1),制備了Ir/MnO2夾心型PSA免疫傳感器。由于本文所合成的MnO2是具有較大的比表面積的疏松多孔物質(zhì),對(duì)抗體具有較好的吸附性能,可增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào),提高檢測(cè)PSA的靈敏度。該傳感器可用于真實(shí)樣品的檢測(cè)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑和儀器

    IrCl3、AgNO3購(gòu)于昆明鉑銳金屬材料有限公司;高錳酸鉀購(gòu)于沈陽(yáng)市化學(xué)試劑廠;硫酸錳購(gòu)于麥克林公司,濃硫酸購(gòu)于四川西隴化工股份有限公司;硼氫化鈉購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;前列腺特異性抗原的抗體(anti-PAS)、前列腺特異性抗原(PSA)購(gòu)于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司;30%過(guò)氧化氫 (30%H2O2)、四氫呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均購(gòu)于西隴化工股份有限公司;牛血清蛋白 (BSA)、殼聚糖(CHIT)和磷酸緩沖溶液(PBS,pH7.40)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;冰醋酸購(gòu)于成都化學(xué)試劑廠;1,4-對(duì)苯二胺 (1,4-diaminobenzene)、1,4-二氧六環(huán)(1,4-dioxane)購(gòu)于阿拉丁試劑;1,3,5-均三苯甲醛(1,3,5-triformylbenzene)購(gòu)于百靈威科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純(A.R.),所用水為二次蒸餾水。

    計(jì)時(shí)電流(i-t)、電化學(xué)交流阻抗(ELS)是在CHI 660D電化學(xué)工作站 (中國(guó)上海辰華儀器公司)測(cè)量;實(shí)驗(yàn)中使用三電極體系,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極,修飾的玻碳電極(GCE)為工作電極,鉑電極為輔助電極;JEM2100透射電鏡(日本電子株式會(huì)社);TGL16離心機(jī) (長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司);CS501超級(jí)恒溫器(重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);液氮罐(成都金鳳液氮容器有限公司);ST2200HP超聲波清洗器 (上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

    1.2 材料的制備

    1.2.1 MnO2納米材料的制備

    參照文獻(xiàn)[22]合成MnO2納米顆粒。將0.2535 g的一水合硫酸錳(MnSO4·H2O)充分溶解于300 mL水中。在攪拌的條件下,加入25 μL濃硫酸。接著用分液漏斗加入含有0.1580 g高錳酸鉀(KMnO4)的200 mL水溶液,滴加速度約為1~2滴/s,然后在室溫下攪拌反應(yīng)一段時(shí)間。將得到的產(chǎn)品離心分離,用水和乙醇洗滌3次,最后將洗滌后得到的產(chǎn)品在60℃的烘箱中干燥12 h,即制得實(shí)驗(yàn)所用MnO2納米顆粒。

    1.2.2 Ir/MnO2納米顆粒的制備

    參照文獻(xiàn)[23]還原Ir的方法合成Ir/MnO2,將10 mg MnO2分散到裝有20 mL 1∶1乙醇-水溶液的圓底燒瓶中,超聲處理半小時(shí)后,加入4 mL 1%H2IrCl4溶液,再逐滴加入3 mL 0.1 mol/L NaBH4溶液,均勻攪拌過(guò)夜,將所得產(chǎn)物離心分離,并用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌三到五次。60℃干燥4 h,即可制得Ir/MnO2納米材料。

    1.2.3 Ir/MnO2標(biāo)記的PSA抗體的制備

    取上面所制得的Ir/MnO2納米材料5 mg,超聲溶解在4 mL滅菌水中,取所得溶液1mL用200 mmol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至9后,加入10.0 μL 1 mg/mL的 PSA 抗體,每次加入 2.0 μL,分五次加完,每次間隔3 min。然后將上述溶液在室溫下振搖反應(yīng)2 h后,加入10%的BSA溶液25 μL,繼續(xù)振搖反應(yīng)30 min以封閉剩余的非特異性活性位點(diǎn)。將所得溶液以5000 r/min的轉(zhuǎn)速低溫離心5 min,用PBS溶液洗滌2次,分散在1 mL eluent buffer溶液中于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 COF-LZU1材料的制備

    參照文獻(xiàn)[24]合成共價(jià)有機(jī)框架材料COFLZUl。 準(zhǔn)確稱取 1,4-苯二胺 (0.16 g,15 mmol),1,3,5-均三苯甲醛(0.16 g,10 mmol)于反應(yīng)試管中,加入1.5 mL 1,4-二氧六環(huán)將其溶解混勻,然后緩慢滴加3 mol/L的醋酸0.5 mL,隨即有黃色固體產(chǎn)生。將真空線接到反應(yīng)試管上抽真空,趕盡氣泡,封管。用液氮冷凍反應(yīng)管,然后使其自然回升至室溫,連續(xù)三次凍融,然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到120℃的油浴中反應(yīng)3 d,停止加熱。將系統(tǒng)冷卻至室溫,打開(kāi)反應(yīng)管,加入THF溶解,離心,依次用DMF、THF分別洗滌所得物質(zhì)三次,然后在60℃下真空干燥12h,得淡黃色固體,即為COF-LZU1。

    1.2.5 Ag/COF-LZU1材料修飾的玻碳電極的制備

    用金相砂紙將玻碳電極(Φ=3mm)打磨干凈,將電極表面在麂皮上用不同粒徑大小的Al2O3粉末拋光,再分別用硝酸水溶液(1∶1)、無(wú)水乙醇、蒸餾水各超聲洗滌電極5 min。將5 mg COF-LZU1溶解在4 mL DMF溶劑中,超聲使其充分溶解,取10 μL溶解的COF-LZU1溶液與10 μL殼聚糖溶液1∶1混合均勻,然后取10 μL混合液滴加到經(jīng)處理過(guò)的電極表面,自然晾干。接著通過(guò)循環(huán)伏安法將硝酸銀溶液(0.1 mol/L)中的銀離子電還原到修飾了COF材料的電極表面 (掃描電壓為-2到1.8,掃描速度為50 mV/s),用PBS溶液沖洗三次,自然晾干,即可以制得Ag/COF-LZU1材料修飾的玻碳電極。

    1.2.6 免疫傳感器的制備

    在Ag/COF-LZU1材料修飾的玻碳電極表面滴加30 μg/mL PSA抗體10.0 μL, 之后于4℃過(guò)夜,第二天,將已修飾好的電極用PBS溶液沖洗三次,自然晾干,滴加10.0 μL的1%BSA溶液,在溫度為37℃

    恒溫箱中封閉1 h。用PBS溶液沖洗封閉完成后的電極三次,自然晾干后便可用于實(shí)驗(yàn)中PSA的測(cè)定。PSA免疫傳感器的制備流程圖如圖1所示。

    圖1 免疫傳感器制備流程Fig.1 Stepwise procedure of the immunosensor

    1.2.7 檢測(cè)方法

    將不同濃度的PSA抗原滴加在上述修飾好的免疫傳感器上,在37℃恒溫箱中培育,之后用PBS沖洗并自然晾干。然后滴加10.0 μL Ir/MnO2納米材料標(biāo)記的PSA抗體,置于恒溫箱中培育后用PBS沖洗,自然晾干,用該傳感器做工作電極,連接好電化學(xué)工作站。在支持電解質(zhì)(PBS)中加入100 μL 3%的H2O2在-0.2 V下進(jìn)行計(jì)時(shí)電流的測(cè)定,根據(jù)該傳感器計(jì)時(shí)響應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的電流值與PSA濃度成正比的關(guān)系,實(shí)現(xiàn)對(duì)PSA的定量測(cè)定。每次測(cè)定完后用4 mol/L的尿素洗脫30 min,洗脫之后用PBS溶液沖洗干凈,使電極能夠再次利用。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 材料的表征

    2.1.1COF-LZU1材料的XRD表征

    為了考察所合成的材料是否與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24],對(duì)合成的COF-LZU1材料進(jìn)行了X射線粉末衍射表征。如圖2所示,通過(guò)PXRD表征,可以知道該文所合成的COFs材料與文獻(xiàn)報(bào)道一致,在2θ 4.7°處出現(xiàn)了明顯的特征峰,說(shuō)明COFLZU1形成了有序的多孔結(jié)構(gòu)。

    圖2 COF材料的XRD圖.(a):標(biāo)準(zhǔn)[24];(b):該文合成Fig.2 XRD patterns of COF(a):standard;(b):synthesis

    2.1.2 COFs材料的微觀形貌表征

    為了確定COF材料的微觀形貌,取少量COF-LZUl聲分散在無(wú)水乙醇中,用高倍透射電鏡觀察了其微觀形貌特征,如圖3所示。圖3為COF-LZUl的透射電鏡圖,從圖中可以看出COFLZU1為層層堆疊的多孔材料。

    圖3 COF-LZUl的TEM圖Fig.3 TEM images of COF-LZU1

    2.1.3 Ag/COFs材料的微觀形貌

    為了驗(yàn)證是否將Ag成功地還原到COFs材料的表面,采用高倍掃描電鏡觀察通過(guò)電還原的方法還原了Ag的COFs材料修飾的電極表面。為了進(jìn)一步確定Ag是否被還原在COFs上,還對(duì)其進(jìn)行了能譜表征。結(jié)果如圖4所示。圖4a、為放大20000倍的Ag/COFs材料的掃描電鏡圖,b為Ag/COF材料的能譜圖。從圖4a中可以看到Ag被均勻的還原到COFs材料的表面,圖4b進(jìn)一步確定了Ag被成功的修飾到了COFs材料的表面。

    圖4 Ag/COF-LZUl的 SEM 圖(a)和能譜圖(b)Fig.4 SEM images(a)and EDS(b)of Ag/COF-LZUl

    2.1.4 MnO2納米材料的微觀形貌

    采用高倍掃描電鏡和透射電鏡觀察所合成的MnO2材料的微觀形貌,結(jié)果如圖5所示。圖5中a為放大120000倍的MnO2的掃描電鏡圖,圖5c為120000倍下的MnO2的透射電鏡圖,從圖中可以看出MnO2納米材料的形貌為均勻的蠶繭狀,尺寸大約在100 nm~500 nm之間,而且呈現(xiàn)出巨大的比表面積,有利于抗體的固定,所以用它在作為標(biāo)記材料能增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。

    圖5 MnO2納米材料的掃描電鏡圖(a)和透射電鏡圖(b)Fig.5 The SEM illustration(a)and TEM illustration(b)of MnO2

    2.1.5 Ir/MnO2納米材料的透射電鏡圖

    為了驗(yàn)證是否成功的將金屬Ir還原到MnO2材料上,將Ir/MnO2材料通過(guò)超聲溶解在乙醇溶液中,并通過(guò)高倍透射電鏡觀察了Ir/MnO2的形貌。其結(jié)果如圖6所示,從圖中可以看出Ir被均勻的還原到了MnO2納米材料中。

    圖6 Ir/MnO2納米材料的透射電鏡圖Fig.6 The TEM illustration of Ir/MnO2

    2.2 氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

    為了進(jìn)一步了解PSA/Ir/MnO2labeled anti-PSA/Ag/COF-LZU1/CHIT/GCE免疫傳感器的電化學(xué)行為,實(shí)驗(yàn)還考察了掃描速度對(duì)PSA/Ir/MnO2labeled anti-PSA/Ag/COF-LZU1/CHIT/GCE免疫傳感器的峰電流的影響,當(dāng)掃描速度在10~100 mV/s范圍內(nèi)變化時(shí),傳感器在含有0.01 mol/L H2O2的 PBS(0.01 mol/L,pH7.4)底液中的循環(huán)伏安行為,如圖7所示。由內(nèi)置圖可看出,陰極峰電流和陽(yáng)極極峰與掃描速度的平方根成正比。說(shuō)明此電流受擴(kuò)散控制。

    2.3 MnO2和Ir/MnO2的催化性能比較

    為了研究MnO2和Ir/MnO2對(duì)H2O2的催化性能,將MnO2和Ir/MnO2用殼聚糖修飾在電極上,采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定其對(duì)H2O2還原電流的催化作用,結(jié)果如圖8所示,其中a為修飾了MnO2的電極對(duì)H2O2的催化電流;b是修飾了 Ir/MnO2電極對(duì)H2O2的催化電流;由圖可看出Ir/MnO2材料比MnO2材料對(duì)H2O2的催化電流更大,說(shuō)明Ir與MnO2對(duì)H2O2的還原具有協(xié)同催化作用。

    2.4 不同修飾電極界面的交流阻抗行為

    交流阻抗常用于考察傳感器在制備過(guò)程中各界面在5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中的變化。圖9為不同修飾電極在5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中的交流阻抗圖。曲線a為裸玻碳電極的阻抗圖,近似一條直線,說(shuō)明電子傳遞幾乎沒(méi)有阻礙;曲線b為COFs/CHIT/GCE的交流阻抗圖,因覆蓋了COFs和殼聚糖阻礙電子傳遞,阻抗增加(Ret=680 Ω)。 c 為 Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線,因負(fù)載了金屬Ag后導(dǎo)電能力增強(qiáng),阻抗值小于曲線b(Ret=500 Ω)。d為anti-PSA/Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線,其阻抗值比曲線c大(Ret=800 Ω),這是由于不導(dǎo)電的抗體阻礙了電子在電極表面的傳遞,說(shuō)明抗體已固定在電極表面上。曲線e為PSA/anti-PSA/Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線,與d曲線相比,半圓直徑顯著增大(Ret=1350 Ω),這是由于抗體和抗原的特異性結(jié)合阻礙了電子的傳遞;曲線f為Ir/MnO2labeled-anti-PSA/PSA/anti-PSA/Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線,阻抗值進(jìn)一步增大(Ret=1700 Ω),這是因?yàn)槊庖邚?fù)合物對(duì)電子的阻礙作用增強(qiáng)。

    圖7 掃描速度對(duì)電極響應(yīng)電流的影響(內(nèi)置圖為峰電流對(duì)掃描速率平方根的線性圖)Fig.7 Cyclic voltammograms of the immunosensor at various scan ratesFrom inner to outer curve(a:20 mV/s;b:40 mV/s;c:60 mV/s;d:80 mV/s;e:100 mV/s;)(Inset shows the plot of current vs v1/2)

    圖8 不同修飾電極對(duì)H2O2還原電流的催化效應(yīng)(a:Ir/MnO2/GCE;b:MnO2/GCE;c:GCE)Fig.8 The catalytic effect of different modified electrode to the reduction current of H2O2(a.Ir/MnO2/GCE;b.MnO2/GCE;c.GCE)

    圖9 不同修飾電極界面的交流阻抗行為Fig.9 Electrochemical impedance spectroscopy(EIS)by using different modified electrodes(a:bare GCE;b:COFs/CHIT/GCE;c:Ag/COFs/CHIT/GCE;d:anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCE;e:PSA/anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCEf:Ir/MnO2 labeled-anti-PSA/PSA/anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCE)

    2.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

    2.5.1 固定抗體濃度對(duì)傳感器峰電流的影響

    固定抗體濃度是影響免疫傳感器靈敏度和檢測(cè)范圍的重要因素。實(shí)驗(yàn)對(duì)固定抗體濃度進(jìn)行了優(yōu)化,同一條件下,固定PSA抗原的濃度為20 ng/mL,通過(guò)改變電極上固定抗體濃度(10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL), 考察了不同固定抗體濃度對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響,結(jié)果如圖10所示,隨著固定抗體濃度的增大,傳感器的響應(yīng)電流逐漸增大,當(dāng)抗體濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)響應(yīng)電流最大,繼續(xù)增大濃度時(shí)響應(yīng)電流有所減小。因此選擇30 μg/mL作為最佳固定抗體濃度。

    圖10 固定抗體濃度對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.10 Effects of the concentration of anti-PSA on the response current of PSA immunosensor

    2.5.2 抗原培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響

    抗原培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流也有一定的影響,在最佳固定抗體濃度下,采用不同時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)培育20 ng/mL的PSA抗原測(cè)定傳感器的響應(yīng)電流值。結(jié)果如圖11所示。從圖中可以看出響應(yīng)電流隨培育時(shí)間增大,30 min時(shí)達(dá)到最大。30 min以后響應(yīng)電流下降。因此選擇30 min作為最佳抗原培育時(shí)間。

    圖11 抗原培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.11 Effects of incubation time of PSA on the response current of PSA immunosensor

    2.5.3 標(biāo)記抗體培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響

    標(biāo)記抗體培育時(shí)間也是影響免疫傳感器的重要因素之一,在以上所選的最佳條件下,將修飾有20 ng/mL的免疫傳感器在37℃的條件下采用不同時(shí)間 (15 min、30 min、45 min、60 min、75 min)培育標(biāo)記抗體。結(jié)果如圖12所示。由圖可看出,從15 min到40 min,傳感器響應(yīng)電流的值隨著培育時(shí)間的增加逐漸增大,隨后電流值趨于平穩(wěn)。說(shuō)明此時(shí)PSA抗原和Ir/MnO2NPs標(biāo)記的PSA抗體結(jié)合形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。因此,該實(shí)驗(yàn)中選擇最佳標(biāo)記抗體的培育時(shí)間為40 min。

    圖12 標(biāo)記抗體培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.12 Effects of incubation time of labeled anti-PSA on the response current of PSA immunosensor

    2.6 免疫傳感器的校正曲線

    在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,獲得了傳感器對(duì)不同濃度的PSA響應(yīng)曲線,從圖13可以看出,Ir/MnO2labeled-anti-PSA/PSA/anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCE免疫傳感器的響應(yīng)電流隨PSA濃度的增加而增加,電流在0.01 ng/mL~150 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,其線性方程為I(μA)=0.06029 c(ng/mL)+0.23217,線性相關(guān)系數(shù)為0.9980,檢測(cè)下限為3 pg/mL。所以該文研制的PSA免疫傳感器線性范圍寬,相關(guān)系數(shù)良好,靈敏度較高。

    圖13 免疫傳感器的校正曲線Fig.13 Calibration curve for the PSA immunosensor

    2.7 免疫傳感器的選擇性

    為了考察所制備的免疫傳感器對(duì)PSA的選擇性,選擇了4種干擾物:1%牛血清蛋白(BSA)、200 ng/mL谷氨酸 (Glu)、200 ng/mL人絨毛促性腺激素(HCG)、200 ng/mL 癌胚抗原(CEA)與 40 ng/mL的PSA抗原按體積比1∶1混合在相同條件下測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1,結(jié)果顯示當(dāng)BSA、谷氨酸、人絨毛促性腺激素(HCG)和癌胚抗原(CEA)的濃度遠(yuǎn)大于PSA的濃度時(shí),對(duì)PSA響應(yīng)電流的影響較小。說(shuō)明BSA(1%)、谷氨酸、人絨毛促性腺激素(HCG)和癌胚抗原(CEA)對(duì)PSA的檢測(cè)基本不造成干擾,傳感器對(duì)PSA具有較高的選擇性。

    表1 電化學(xué)免疫傳感器的選擇性Tab.1 Selective of the CRP electrochemical immunosensors

    2.8 回收率的測(cè)定

    在生物樣品的實(shí)際測(cè)定中總會(huì)存在許多的干擾物質(zhì),因此在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,研究了干擾物質(zhì)的存在對(duì)PSA測(cè)定的影響,該實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,在稀釋的血清中加入3種不同濃度的PSA抗原,在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,進(jìn)行PSA回收率的測(cè)定,三次檢測(cè)平均回收率為97.41%(如表2所示),結(jié)果令人滿意,說(shuō)明該傳感器對(duì)檢測(cè)PSA有一定的可行性。

    表2 PSA回收率的測(cè)定Tab.2 Recovery of the immunosensor

    2.9 傳感器的穩(wěn)定性

    為了考察免疫傳感器的穩(wěn)定性,將所研制的免疫傳感器檢測(cè)一次后置于冰箱中4℃保存,分別過(guò)7 d、14 d、28 d后再次培育相同濃度的PSA抗原進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖14所示。圖中I/I0為放置一定天數(shù)后測(cè)得的電流I與初始電流I0的比值。由圖可見(jiàn),該傳感器的穩(wěn)定性良好。

    圖14 PSA電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性Fig.14 The stability of PSA electrochemical immunosensors(a:0day;b:7days;c:14days;d:28days)

    3 結(jié)論

    該實(shí)驗(yàn)研制了一種新型的以Ag/COF-LZU1復(fù)合材料為固定基質(zhì),Ir/MnO2為標(biāo)記材料的夾心型PSA免疫傳感器,并用于測(cè)定血清樣品中的PSA?;贏g/COF-LZU1材料良好的導(dǎo)電性和Ir/MnO2納米材料的多孔尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)等特點(diǎn)對(duì)PSA抗體有較好的生物相容性,從而增強(qiáng)了響應(yīng)信號(hào),提高了免疫傳感器的靈敏度,與傳統(tǒng)的PSA抗原檢測(cè)方法相比較,其靈敏度提高了許多,檢測(cè)下限也可達(dá)到3 pg/mL,擴(kuò)寬了線性范圍,提高了選擇性。

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