基于Ir/MnO2標(biāo)記型前列腺特異性抗原免疫傳感器的研制

白茹燕，馬玉洪，陳志莉，胡慧英，余 佩，畢滿玲，胡 蓉，楊云慧

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明650500)

0 引言

前列腺癌是最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一。近年來(lái)，前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。前列腺癌的早期診斷對(duì)指導(dǎo)前列腺癌穿刺、治療方式以及疾病預(yù)后具有直接的影響。前列腺癌的早期診斷主要通過(guò)前列腺特異抗原（Prostate specific antigen,PSA)篩查。PSA是目前唯一公認(rèn)的診斷前列腺癌的指標(biāo)，其診斷前列腺癌的曲線下面積為0.821[1]。PSA屬于類激肽釋放酶，是前列腺腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的具有244個(gè)氨基酸殘基的、相對(duì)分子質(zhì)量為33000～34000的一種絲氨酸蛋白酶[2]。在正常生理?xiàng)l件下，它存在于前列腺組織、前列腺液、精液、血清和尿液中[3]。PSA顯示出一種類糜蛋白酶的降解底物的特異催化活性，主要作用于新鮮精漿中較大分子的膠蛋白，使它們分解成幾個(gè)低分子量的、可溶性的蛋白片斷，這導(dǎo)致了精液液化，以及隨之而來(lái)的活動(dòng)精子的釋放。大多數(shù)PSA與蛋白酶抑制劑抗糜蛋白酶結(jié)合，只有少量以游離形式存在于血清中[4]，因此PSA得檢測(cè)受到了廣大學(xué)者的關(guān)注。

癌癥生物標(biāo)志物的常規(guī)免疫檢測(cè)方法主要是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法[5]，目前PSA的檢測(cè)方法除了酶聯(lián)免疫測(cè)定之外，常用的還有熒光定量檢測(cè)法[6]、放射免疫測(cè)定（RIA)[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]、電泳法[9]、質(zhì)譜免疫測(cè)定[10]等。然而這些常規(guī)免疫測(cè)定法較復(fù)雜，并且耗費(fèi)時(shí)間，操作繁瑣，費(fèi)用昂貴，不適宜病床前的檢測(cè)[11]。因此，急需發(fā)展適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的簡(jiǎn)單、快速、靈敏方法來(lái)檢測(cè)PSA。電化學(xué)免疫傳感器不但結(jié)合了電化學(xué)傳感器和免疫傳感器的雙重優(yōu)點(diǎn)，還具有能與抗原-抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合力，具有低成本、高靈敏、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[12]。

MnO2是一種重要的功能氧化物，具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、合成容易和相對(duì)無(wú)毒等特點(diǎn)，在電池材料、磁性材料、催化劑和離子交換劑等方面有廣泛的應(yīng)用[13-14]。MnO2具有多種晶體結(jié)構(gòu)和形貌特征，而納米材料的晶型、尺寸、形貌和維數(shù)對(duì)其性能有重要的影響，因而不同晶型和形貌氧化錳納米材料的可控合成一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題之一[15]。近年來(lái)，已報(bào)道的制備納米氧化錳的方法有氧化還原沉淀法[16]、溶膠－凝膠法[17]、液相沉淀法[18]、模板法[19]、電化學(xué)沉積法[20]和低溫水熱法[21]等。其中水熱合成法由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，已成為制備一維納米材料的重要途徑，成功地合成了許多具有獨(dú)特形貌和優(yōu)良物理、化學(xué)性質(zhì)的納米材料。

該文以KMnO4與MnCl2·4H2O為反應(yīng)原料，采用水熱合成法，制備了蠶繭狀納米MnO2。通過(guò)控制反應(yīng)溫度從而達(dá)到調(diào)控MnO2形貌的目的，未使用任何表面活性劑，避免了繁瑣的后期處理過(guò)程和對(duì)環(huán)境的污染。并在所制備MnO2納米材料上負(fù)載了貴金屬Ir。采用Ir/MnO2標(biāo)記PSA抗體（Ab2）,并在電極上修飾Ag/COF-LZU1固定了PSA抗體（Ab1）,制備了Ir/MnO2夾心型PSA免疫傳感器。由于本文所合成的MnO2是具有較大的比表面積的疏松多孔物質(zhì)，對(duì)抗體具有較好的吸附性能，可增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)，提高檢測(cè)PSA的靈敏度。該傳感器可用于真實(shí)樣品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

IrCl3、AgNO3購(gòu)于昆明鉑銳金屬材料有限公司；高錳酸鉀購(gòu)于沈陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；硫酸錳購(gòu)于麥克林公司，濃硫酸購(gòu)于四川西隴化工股份有限公司；硼氫化鈉購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；前列腺特異性抗原的抗體(anti-PAS)、前列腺特異性抗原（PSA）購(gòu)于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；30%過(guò)氧化氫 （30%H2O2）、四氫呋喃（THF）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）均購(gòu)于西隴化工股份有限公司；牛血清蛋白 （BSA）、殼聚糖(CHIT)和磷酸緩沖溶液（PBS，pH7.40）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；冰醋酸購(gòu)于成都化學(xué)試劑廠；1,4-對(duì)苯二胺 （1,4-diaminobenzene）、1,4-二氧六環(huán)（1,4-dioxane）購(gòu)于阿拉丁試劑；1,3,5-均三苯甲醛（1,3,5-triformylbenzene）購(gòu)于百靈威科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純（A.R.），所用水為二次蒸餾水。

計(jì)時(shí)電流（i-t）、電化學(xué)交流阻抗(ELS)是在CHI 660D電化學(xué)工作站 （中國(guó)上海辰華儀器公司）測(cè)量；實(shí)驗(yàn)中使用三電極體系，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，修飾的玻碳電極（GCE）為工作電極，鉑電極為輔助電極；JEM2100透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）；TGL16離心機(jī) （長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；CS501超級(jí)恒溫器（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；液氮罐（成都金鳳液氮容器有限公司）；ST2200HP超聲波清洗器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 材料的制備

1.2.1 MnO2納米材料的制備

參照文獻(xiàn)[22]合成MnO2納米顆粒。將0.2535 g的一水合硫酸錳（MnSO4·H2O）充分溶解于300 mL水中。在攪拌的條件下，加入25 μL濃硫酸。接著用分液漏斗加入含有0.1580 g高錳酸鉀（KMnO4)的200 mL水溶液，滴加速度約為1～2滴/s，然后在室溫下攪拌反應(yīng)一段時(shí)間。將得到的產(chǎn)品離心分離，用水和乙醇洗滌3次，最后將洗滌后得到的產(chǎn)品在60℃的烘箱中干燥12 h，即制得實(shí)驗(yàn)所用MnO2納米顆粒。

1.2.2 Ir/MnO2納米顆粒的制備

參照文獻(xiàn)[23]還原Ir的方法合成Ir/MnO2，將10 mg MnO2分散到裝有20 mL 1∶1乙醇-水溶液的圓底燒瓶中,超聲處理半小時(shí)后，加入4 mL 1%H2IrCl4溶液，再逐滴加入3 mL 0.1 mol/L NaBH4溶液，均勻攪拌過(guò)夜，將所得產(chǎn)物離心分離，并用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌三到五次。60℃干燥4 h,即可制得Ir/MnO2納米材料。

1.2.3 Ir/MnO2標(biāo)記的PSA抗體的制備

取上面所制得的Ir/MnO2納米材料5 mg,超聲溶解在4 mL滅菌水中，取所得溶液1mL用200 mmol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至9后，加入10.0 μL 1 mg/mL的 PSA 抗體,每次加入 2.0 μL，分五次加完，每次間隔3 min。然后將上述溶液在室溫下振搖反應(yīng)2 h后，加入10%的BSA溶液25 μL,繼續(xù)振搖反應(yīng)30 min以封閉剩余的非特異性活性位點(diǎn)。將所得溶液以5000 r/min的轉(zhuǎn)速低溫離心5 min，用PBS溶液洗滌2次，分散在1 mL eluent buffer溶液中于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 COF-LZU1材料的制備

參照文獻(xiàn)[24]合成共價(jià)有機(jī)框架材料COFLZUl。 準(zhǔn)確稱取 1,4-苯二胺 （0.16 g,15 mmol)，1,3,5-均三苯甲醛(0.16 g,10 mmol)于反應(yīng)試管中，加入1.5 mL 1,4-二氧六環(huán)將其溶解混勻，然后緩慢滴加3 mol/L的醋酸0.5 mL，隨即有黃色固體產(chǎn)生。將真空線接到反應(yīng)試管上抽真空,趕盡氣泡,封管。用液氮冷凍反應(yīng)管，然后使其自然回升至室溫，連續(xù)三次凍融，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到120℃的油浴中反應(yīng)3 d，停止加熱。將系統(tǒng)冷卻至室溫，打開(kāi)反應(yīng)管，加入THF溶解，離心，依次用DMF、THF分別洗滌所得物質(zhì)三次，然后在60℃下真空干燥12h，得淡黃色固體，即為COF-LZU1。

1.2.5 Ag/COF-LZU1材料修飾的玻碳電極的制備

用金相砂紙將玻碳電極(Φ=3mm)打磨干凈，將電極表面在麂皮上用不同粒徑大小的Al2O3粉末拋光，再分別用硝酸水溶液(1∶1)、無(wú)水乙醇、蒸餾水各超聲洗滌電極5 min。將5 mg COF-LZU1溶解在4 mL DMF溶劑中，超聲使其充分溶解，取10 μL溶解的COF-LZU1溶液與10 μL殼聚糖溶液1∶1混合均勻，然后取10 μL混合液滴加到經(jīng)處理過(guò)的電極表面，自然晾干。接著通過(guò)循環(huán)伏安法將硝酸銀溶液（0.1 mol/L）中的銀離子電還原到修飾了COF材料的電極表面 （掃描電壓為-2到1.8，掃描速度為50 mV/s），用PBS溶液沖洗三次，自然晾干，即可以制得Ag/COF-LZU1材料修飾的玻碳電極。

1.2.6 免疫傳感器的制備

在Ag/COF-LZU1材料修飾的玻碳電極表面滴加30 μg/mL PSA抗體10.0 μL， 之后于4℃過(guò)夜,第二天，將已修飾好的電極用PBS溶液沖洗三次，自然晾干，滴加10.0 μL的1%BSA溶液，在溫度為37℃

恒溫箱中封閉1 h。用PBS溶液沖洗封閉完成后的電極三次，自然晾干后便可用于實(shí)驗(yàn)中PSA的測(cè)定。PSA免疫傳感器的制備流程圖如圖1所示。

圖1 免疫傳感器制備流程Fig.1 Stepwise procedure of the immunosensor

1.2.7 檢測(cè)方法

將不同濃度的PSA抗原滴加在上述修飾好的免疫傳感器上，在37℃恒溫箱中培育，之后用PBS沖洗并自然晾干。然后滴加10.0 μL Ir/MnO2納米材料標(biāo)記的PSA抗體，置于恒溫箱中培育后用PBS沖洗，自然晾干，用該傳感器做工作電極，連接好電化學(xué)工作站。在支持電解質(zhì)（PBS）中加入100 μL 3%的H2O2在-0.2 V下進(jìn)行計(jì)時(shí)電流的測(cè)定，根據(jù)該傳感器計(jì)時(shí)響應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的電流值與PSA濃度成正比的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)PSA的定量測(cè)定。每次測(cè)定完后用4 mol/L的尿素洗脫30 min，洗脫之后用PBS溶液沖洗干凈，使電極能夠再次利用。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

2.1.1COF-LZU1材料的XRD表征

為了考察所合成的材料是否與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，對(duì)合成的COF-LZU1材料進(jìn)行了X射線粉末衍射表征。如圖2所示，通過(guò)PXRD表征，可以知道該文所合成的COFs材料與文獻(xiàn)報(bào)道一致，在2θ 4.7°處出現(xiàn)了明顯的特征峰，說(shuō)明COFLZU1形成了有序的多孔結(jié)構(gòu)。

圖2 COF材料的XRD圖.(a):標(biāo)準(zhǔn)[24];(b):該文合成Fig.2 XRD patterns of COF(a):standard;(b):synthesis

2.1.2 COFs材料的微觀形貌表征

為了確定COF材料的微觀形貌，取少量COF-LZUl聲分散在無(wú)水乙醇中，用高倍透射電鏡觀察了其微觀形貌特征，如圖3所示。圖3為COF-LZUl的透射電鏡圖，從圖中可以看出COFLZU1為層層堆疊的多孔材料。

圖3 COF-LZUl的TEM圖Fig.3 TEM images of COF-LZU1

2.1.3 Ag/COFs材料的微觀形貌

為了驗(yàn)證是否將Ag成功地還原到COFs材料的表面，采用高倍掃描電鏡觀察通過(guò)電還原的方法還原了Ag的COFs材料修飾的電極表面。為了進(jìn)一步確定Ag是否被還原在COFs上，還對(duì)其進(jìn)行了能譜表征。結(jié)果如圖4所示。圖4a、為放大20000倍的Ag/COFs材料的掃描電鏡圖，b為Ag/COF材料的能譜圖。從圖4a中可以看到Ag被均勻的還原到COFs材料的表面,圖4b進(jìn)一步確定了Ag被成功的修飾到了COFs材料的表面。

圖4 Ag/COF-LZUl的 SEM 圖（a）和能譜圖（b）Fig.4 SEM images(a)and EDS(b)of Ag/COF-LZUl

2.1.4 MnO2納米材料的微觀形貌

采用高倍掃描電鏡和透射電鏡觀察所合成的MnO2材料的微觀形貌，結(jié)果如圖5所示。圖5中a為放大120000倍的MnO2的掃描電鏡圖，圖5c為120000倍下的MnO2的透射電鏡圖，從圖中可以看出MnO2納米材料的形貌為均勻的蠶繭狀，尺寸大約在100 nm～500 nm之間，而且呈現(xiàn)出巨大的比表面積，有利于抗體的固定，所以用它在作為標(biāo)記材料能增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。

圖5 MnO2納米材料的掃描電鏡圖(a)和透射電鏡圖(b)Fig.5 The SEM illustration(a)and TEM illustration(b)of MnO2

2.1.5 Ir/MnO2納米材料的透射電鏡圖

為了驗(yàn)證是否成功的將金屬Ir還原到MnO2材料上，將Ir/MnO2材料通過(guò)超聲溶解在乙醇溶液中，并通過(guò)高倍透射電鏡觀察了Ir/MnO2的形貌。其結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出Ir被均勻的還原到了MnO2納米材料中。

圖6 Ir/MnO2納米材料的透射電鏡圖Fig.6 The TEM illustration of Ir/MnO2

2.2 氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

為了進(jìn)一步了解PSA/Ir/MnO2labeled anti-PSA/Ag/COF-LZU1/CHIT/GCE免疫傳感器的電化學(xué)行為，實(shí)驗(yàn)還考察了掃描速度對(duì)PSA/Ir/MnO2labeled anti-PSA/Ag/COF-LZU1/CHIT/GCE免疫傳感器的峰電流的影響，當(dāng)掃描速度在10～100 mV/s范圍內(nèi)變化時(shí)，傳感器在含有0.01 mol/L H2O2的 PBS(0.01 mol/L，pH7.4)底液中的循環(huán)伏安行為，如圖7所示。由內(nèi)置圖可看出，陰極峰電流和陽(yáng)極極峰與掃描速度的平方根成正比。說(shuō)明此電流受擴(kuò)散控制。

2.3 MnO2和Ir/MnO2的催化性能比較

為了研究MnO2和Ir/MnO2對(duì)H2O2的催化性能，將MnO2和Ir/MnO2用殼聚糖修飾在電極上，采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定其對(duì)H2O2還原電流的催化作用，結(jié)果如圖8所示，其中a為修飾了MnO2的電極對(duì)H2O2的催化電流；b是修飾了 Ir/MnO2電極對(duì)H2O2的催化電流；由圖可看出Ir/MnO2材料比MnO2材料對(duì)H2O2的催化電流更大，說(shuō)明Ir與MnO2對(duì)H2O2的還原具有協(xié)同催化作用。

2.4 不同修飾電極界面的交流阻抗行為

交流阻抗常用于考察傳感器在制備過(guò)程中各界面在5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中的變化。圖9為不同修飾電極在5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中的交流阻抗圖。曲線a為裸玻碳電極的阻抗圖，近似一條直線，說(shuō)明電子傳遞幾乎沒(méi)有阻礙；曲線b為COFs/CHIT/GCE的交流阻抗圖，因覆蓋了COFs和殼聚糖阻礙電子傳遞，阻抗增加（Ret=680 Ω）。 c 為 Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線，因負(fù)載了金屬Ag后導(dǎo)電能力增強(qiáng)，阻抗值小于曲線b（Ret=500 Ω）。d為anti-PSA/Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線，其阻抗值比曲線c大（Ret=800 Ω），這是由于不導(dǎo)電的抗體阻礙了電子在電極表面的傳遞，說(shuō)明抗體已固定在電極表面上。曲線e為PSA/anti-PSA/Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線，與d曲線相比，半圓直徑顯著增大（Ret=1350 Ω），這是由于抗體和抗原的特異性結(jié)合阻礙了電子的傳遞；曲線f為Ir/MnO2labeled-anti-PSA/PSA/anti-PSA/Ag-COFs/CHIT/GCE交流阻抗曲線，阻抗值進(jìn)一步增大（Ret=1700 Ω），這是因?yàn)槊庖邚?fù)合物對(duì)電子的阻礙作用增強(qiáng)。

圖7 掃描速度對(duì)電極響應(yīng)電流的影響（內(nèi)置圖為峰電流對(duì)掃描速率平方根的線性圖）Fig.7 Cyclic voltammograms of the immunosensor at various scan ratesFrom inner to outer curve(a:20 mV/s;b:40 mV/s;c:60 mV/s;d:80 mV/s;e:100 mV/s;)（Inset shows the plot of current vs v1/2)

圖8 不同修飾電極對(duì)H2O2還原電流的催化效應(yīng)(a:Ir/MnO2/GCE;b:MnO2/GCE;c:GCE)Fig.8 The catalytic effect of different modified electrode to the reduction current of H2O2(a.Ir/MnO2/GCE;b.MnO2/GCE;c.GCE)

圖9 不同修飾電極界面的交流阻抗行為Fig.9 Electrochemical impedance spectroscopy(EIS)by using different modified electrodes(a:bare GCE;b:COFs/CHIT/GCE;c:Ag/COFs/CHIT/GCE;d:anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCE;e:PSA/anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCEf:Ir/MnO2 labeled-anti-PSA/PSA/anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCE)

2.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.5.1 固定抗體濃度對(duì)傳感器峰電流的影響

固定抗體濃度是影響免疫傳感器靈敏度和檢測(cè)范圍的重要因素。實(shí)驗(yàn)對(duì)固定抗體濃度進(jìn)行了優(yōu)化，同一條件下，固定PSA抗原的濃度為20 ng/mL,通過(guò)改變電極上固定抗體濃度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL）， 考察了不同固定抗體濃度對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響，結(jié)果如圖10所示，隨著固定抗體濃度的增大，傳感器的響應(yīng)電流逐漸增大，當(dāng)抗體濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)響應(yīng)電流最大，繼續(xù)增大濃度時(shí)響應(yīng)電流有所減小。因此選擇30 μg/mL作為最佳固定抗體濃度。

圖10 固定抗體濃度對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.10 Effects of the concentration of anti-PSA on the response current of PSA immunosensor

2.5.2 抗原培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響

抗原培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流也有一定的影響，在最佳固定抗體濃度下，采用不同時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)培育20 ng/mL的PSA抗原測(cè)定傳感器的響應(yīng)電流值。結(jié)果如圖11所示。從圖中可以看出響應(yīng)電流隨培育時(shí)間增大，30 min時(shí)達(dá)到最大。30 min以后響應(yīng)電流下降。因此選擇30 min作為最佳抗原培育時(shí)間。

圖11 抗原培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.11 Effects of incubation time of PSA on the response current of PSA immunosensor

2.5.3 標(biāo)記抗體培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響

標(biāo)記抗體培育時(shí)間也是影響免疫傳感器的重要因素之一，在以上所選的最佳條件下，將修飾有20 ng/mL的免疫傳感器在37℃的條件下采用不同時(shí)間 (15 min、30 min、45 min、60 min、75 min）培育標(biāo)記抗體。結(jié)果如圖12所示。由圖可看出，從15 min到40 min，傳感器響應(yīng)電流的值隨著培育時(shí)間的增加逐漸增大，隨后電流值趨于平穩(wěn)。說(shuō)明此時(shí)PSA抗原和Ir/MnO2NPs標(biāo)記的PSA抗體結(jié)合形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，該實(shí)驗(yàn)中選擇最佳標(biāo)記抗體的培育時(shí)間為40 min。

圖12 標(biāo)記抗體培育時(shí)間對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.12 Effects of incubation time of labeled anti-PSA on the response current of PSA immunosensor

2.6 免疫傳感器的校正曲線

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，獲得了傳感器對(duì)不同濃度的PSA響應(yīng)曲線，從圖13可以看出，Ir/MnO2labeled-anti-PSA/PSA/anti-PSA/Ag/COFs/CHIT/GCE免疫傳感器的響應(yīng)電流隨PSA濃度的增加而增加，電流在0.01 ng/mL～150 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為I(μA)=0.06029 c(ng/mL)+0.23217，線性相關(guān)系數(shù)為0.9980，檢測(cè)下限為3 pg/mL。所以該文研制的PSA免疫傳感器線性范圍寬，相關(guān)系數(shù)良好,靈敏度較高。

圖13 免疫傳感器的校正曲線Fig.13 Calibration curve for the PSA immunosensor

2.7 免疫傳感器的選擇性

為了考察所制備的免疫傳感器對(duì)PSA的選擇性，選擇了4種干擾物：1%牛血清蛋白(BSA)、200 ng/mL谷氨酸 （Glu）、200 ng/mL人絨毛促性腺激素（HCG）、200 ng/mL 癌胚抗原(CEA)與 40 ng/mL的PSA抗原按體積比1∶1混合在相同條件下測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示當(dāng)BSA、谷氨酸、人絨毛促性腺激素（HCG）和癌胚抗原(CEA)的濃度遠(yuǎn)大于PSA的濃度時(shí)，對(duì)PSA響應(yīng)電流的影響較小。說(shuō)明BSA(1%)、谷氨酸、人絨毛促性腺激素（HCG）和癌胚抗原(CEA)對(duì)PSA的檢測(cè)基本不造成干擾，傳感器對(duì)PSA具有較高的選擇性。

表1 電化學(xué)免疫傳感器的選擇性Tab.1 Selective of the CRP electrochemical immunosensors

2.8 回收率的測(cè)定

在生物樣品的實(shí)際測(cè)定中總會(huì)存在許多的干擾物質(zhì)，因此在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，研究了干擾物質(zhì)的存在對(duì)PSA測(cè)定的影響，該實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在稀釋的血清中加入3種不同濃度的PSA抗原，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行PSA回收率的測(cè)定，三次檢測(cè)平均回收率為97.41%（如表2所示），結(jié)果令人滿意，說(shuō)明該傳感器對(duì)檢測(cè)PSA有一定的可行性。

表2 PSA回收率的測(cè)定Tab.2 Recovery of the immunosensor

2.9 傳感器的穩(wěn)定性

為了考察免疫傳感器的穩(wěn)定性，將所研制的免疫傳感器檢測(cè)一次后置于冰箱中4℃保存，分別過(guò)7 d、14 d、28 d后再次培育相同濃度的PSA抗原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖14所示。圖中I/I0為放置一定天數(shù)后測(cè)得的電流I與初始電流I0的比值。由圖可見(jiàn)，該傳感器的穩(wěn)定性良好。

圖14 PSA電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性Fig.14 The stability of PSA electrochemical immunosensors（a:0day;b:7days;c:14days;d:28days）

3 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)研制了一種新型的以Ag/COF-LZU1復(fù)合材料為固定基質(zhì)，Ir/MnO2為標(biāo)記材料的夾心型PSA免疫傳感器，并用于測(cè)定血清樣品中的PSA?；贏g/COF-LZU1材料良好的導(dǎo)電性和Ir/MnO2納米材料的多孔尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)等特點(diǎn)對(duì)PSA抗體有較好的生物相容性，從而增強(qiáng)了響應(yīng)信號(hào)，提高了免疫傳感器的靈敏度，與傳統(tǒng)的PSA抗原檢測(cè)方法相比較，其靈敏度提高了許多，檢測(cè)下限也可達(dá)到3 pg/mL,擴(kuò)寬了線性范圍，提高了選擇性。

[1]Lojanapiwat B,Anutrakulchai W,Chongruksut W,et al.Correlation and diagnostic performance of the prostatespecific antigen level with the diagnosis,aggressiveness,and bone metastasis of prostate cancer in clinical practice[J].Prostate international,2014,2(3):133-139.

[2]年新文,任善成,許傳亮,等.前列腺癌早期診斷標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].臨床泌尿外科雜志,2016，9:852-856.

[3]石瑋,董莉,包軍勝.前列腺癌相關(guān)分子研究進(jìn)展[J].中華男科學(xué)雜志,2015,21(4):357-362.

[4]Tasian G E,Cooperberg M R,Cowan J E,et al.Prostate specific antigen screening for prostate cancer:Knowledge of,attitudes towards,and utilization among primary care physicians[C].Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations.Elsevier,2012,30(2):155-160.

[5]Link A J,Eng J,Schieltz D M,et al.Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry[J].Nature biotechnology,1999,17(7):676-682.

[6]李婭,蘇明權(quán),岳喬紅,等.前列腺癌特異DD3基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法建立及初步應(yīng)用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(17):1623-1626.

[7]Maury C P,Teppo A M.Raised serum levels of cachectin/tumor necrosis factor alpha in renal allograft rejection[J].The Journal of experimental medicine,1987,166(4):1132-1137.

[8]Jones S,Zhang X,Parsons D W,et al.Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses[J].science,2008,321(5897):1801-1806.

[9]Schmalzing D,Koutny L B,Taylor T A,et al.Immunoassay for thyroxine (T4)in serum using capillary electrophoresis and micromachined devices[J].Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications,1997,697(1):175-180.

[10]Schwartz B S,Hu H.Adult lead exposure:time for change[J].Environmental health perspectives,2007,115(3):451-454.

[11]Akter T,Kim W S.Reversibly stretchable transparent conductive coatings of spray-deposited silver nanowires[J].ACS applied materials&interfaces,2012,4(4):1855-1859.

[12]Kavosi B,Salimi A,Hallaj R,et al.Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy[J].Biosensors and Bioelectronics,2015,74:915-923.

[13]Xia Y,Yang P,Sun Y,et al.One-dimensional nanostructures:synthesis,characterization,and applications[J].Advanced materials,2003,15(5):353-389.

[14]Liu Z,Ooi K.Preparation and alkali-metal ion extraction/insertion reactions with nanofibrous manganese oxide having 2×4 tunnel structure[J].Chemistry of materials,2003,15(19):3696-3703.

[15]雷曉玲,代海,馮開(kāi)忠,等.MnO2納米材料的可控制備和催化性能研究[J].功能材料,2013,44(13):1940-1942.

[16]Chen L,Song Z,Liu G,et al.Synthesis and electrochemical performance of polyaniline-MnO2nanowire composites for supercapacitors[J].Journal of Physics and Chemistry of Solids,2013,74(2):360-365.

[17]Reddy R N,Reddy R G.Sol-gel MnO2as an electrode material for electrochemical capacitors[J].Journal of Power Sources,2003,124(1):330-337.

[18]Subramanian V,Zhu H,Wei B.Alcohol-assisted room temperature synthesis of different nanostructured manganese oxides and their pseudocapacitance properties in neutral electrolyte[J].Chemical Physics Letters,2008,453(4):242-249.

[19]Sugantha M,Ramakrishnan P A,Hermann A M,et al.Nanostructured MnO2for li batteries[J].International Journal of Hydrogen Energy,2003,28(6):597-600.

[20]Hu C C,Tsou T W.Capacitive and textural characteristics of hydrous manganese oxide prepared by anodic deposition[J].Electrochimica Acta,2002,47(21):3523-3532.

[21]Hu C C,Wu Y T,Chang K H.Low-temperature hydrothermal synthesis of Mn3O4and MnOOH single crystals:determinant influence of oxidants[J].Chemistry of Materials,2008,20(9):2890-2894.

[22]Liu R,Zhou H,Liu J,et al.Preparation of Pd/MnO2-reduced graphene oxide nanocomposite for methanol electro-oxidation in alkaline media[J].Electrochemistry Communications,2013,26(1):63-66.

[23]Chang S H,Yeh M,Rick J,et al.Bimetallic catalyst of PtIr nanoparticles with high electrocatalytic ability for hydrogen peroxide oxidation[J].Sensor and Actuators B:Chemical,2014,190(1):55-60.

[24]Ding S Y,Gao J,Wang Q,et al.Construction of covalent organic framework for catalysis:Pd/COF-LZU1 in Suzuki-Miyaura coupling reaction[J].Journal of American Chemical Society,2011,133(49):19816-19822.