外源NO緩解秋茄低溫脅迫傷害的生理機(jī)制研究

余敏　杜照奎　王麗佳　祝慶

摘要：為探討外源一氧化氮（NO）提高紅樹(shù)植物抗低溫的生理機(jī)制，以秋茄（Kandelia obovata）為試驗(yàn)材料，對(duì)其施加不同濃度（0、0.1、0.5、1.0和1.5 mmol/L）的外源NO供體（SNP），并進(jìn)行4 ℃低溫處理，研究外源NO對(duì)低溫脅迫下秋茄幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，SNP處理降低了秋茄幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，提高了葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）的活性以及可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和游離脯氨酸的含量，從而降低了低溫脅迫對(duì)秋茄幼苗的傷害，以0.5 mmol/L SNP處理效果最佳。低溫脅迫下，適宜濃度的外源NO通過(guò)提高抗氧化酶活性，促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，降低膜透性和膜脂過(guò)氧化水平，保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高秋茄幼苗抗低溫脅迫的能力。

關(guān)鍵詞：紅樹(shù)植物；秋茄（Kandelia obovata）；低溫；外源硝普鈉；抗氧化酶；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.761.7；Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）03-0490-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.024

Physiological Mechanism of Exogenous Nitric Oxide on Alleviating Low Temperature Stress of Kandelia obovata

YU Mina，DU Zhao-kuia，b，c，WANG Li-jiaa，ZHU Qinga

（a.School of Life Sciences； b.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Evolutionary Ecology and Conservation；c.Institute of Ecology， Taizhou University， Taizhou 318000， Zhejiang， China）

Abstract： Aiming to explore the physiological mechanism of exogenous NO donor sodium nitroprusside（SNP） improving the ability of low temperature endurance of mangrove，Kandelia obobata seedlings were chosen as experimental materials，different concentrations of sodium nitroprusside（SNP）（0，0.1，0.5，1.0 and 1.5 mmol/L） was employed as exogenous nitric oxide（NO） donor to study the effects of different concentrations of exogenous NO on the plant relative electrical conductivity，MDA content，the activities of antioxidative enzymes and the contents of osmotic adjustment substance of K. obovata seedlings under 4 ℃ low-temperature stress. The results showed that，the treatment of SNP could reduce the relative electrical conductivity and content of MDA； increase the activities of SOD，POD，CAT and APX， and the content soluble protein， soluble sugar and free praline of the seedlings under low-temperature stress to reduce the damage caused by chilling. It was also found that the cold resistance effect of treatment with 0.5 mmol/L SNP was the best. It indicated that the exogenous NO with proper concentration could enhance the K. obovata seedlings adaptability for low temperature stress through improving the activities of antioxidative enzymes， increasing the osmotic adjustment substance contents， to reduce membrane lipid peroxidation and protecting the stability of cell membrane structure.

Key words： mangrove； Kandelia obovata； low temperature； exogenous sodium nitroprusside； antioxidative enzyme； osmotic adjustment substance

紅樹(shù)林處于熱帶、亞熱帶海洋和陸地過(guò)渡區(qū)，是一種低緯度海岸帶地區(qū)特殊的濕地生態(tài)系統(tǒng)，具有調(diào)節(jié)環(huán)境氣候、維護(hù)生態(tài)的多樣性、防浪穩(wěn)固海岸、抵抗自然災(zāi)害、降解環(huán)境污染、為人類(lèi)提供多樣的生物資源等多功能[1]。秋茄（Kandelia obovata）是紅樹(shù)科秋茄屬植物，也是在中國(guó)分布最廣泛的紅樹(shù)林種類(lèi)[2]，多見(jiàn)于中國(guó)東南沿海地區(qū)，如海南、廣西、廣東、臺(tái)灣、福建和浙江等地。鑒于秋茄重要的生態(tài)功能和價(jià)值，人們一直致力于其向高緯度地區(qū)引種。秋茄雖是眾多紅樹(shù)植物中耐寒性最強(qiáng)的種類(lèi)，但高緯度地區(qū)冬季極端低溫天氣會(huì)使得秋茄遭受到凍害，甚至引起植株的死亡。

NO是一種易溶于脂類(lèi)和水分子的活性小分子氣體，在植物對(duì)生物和非生物脅迫反應(yīng)、細(xì)胞程序性死亡、呼吸作用、光形態(tài)建成、果實(shí)成熟、葉片伸展、氣孔關(guān)閉、植物衰老、開(kāi)花調(diào)控和激素反應(yīng)等過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。近年來(lái)研究表明，NO在提高植物的抗逆性反應(yīng)中起著重要的作用，因而越來(lái)越受到大家的關(guān)注[4]，但有關(guān)外源NO在秋茄抗寒性方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)以秋茄盆栽幼苗為試材，研究低溫脅迫下外源不同濃度的NO供體——硝普鈉（SNP）對(duì)其葉片抗氧化系統(tǒng)及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，闡明低溫脅迫時(shí)NO調(diào)控秋茄幼苗抗寒性的機(jī)理，旨在提高秋茄幼苗期的耐寒性，并為高緯度秋茄的栽培種植提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)和處理

試驗(yàn)在浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2015年6月上旬，將采自浙江省玉環(huán)縣茅埏島的秋茄繁殖體——胚軸扦插至裝有海泥的塑料盆中，每盆1株，正常管理。2015年11月初，選取長(zhǎng)勢(shì)整齊的幼苗，分成6組，每組5株，移入人工氣候室，光照度為9 000 lx，光/暗周期為14 h/10 h，溫度為28 ℃/15 ℃，相對(duì)濕度70%。室內(nèi)適應(yīng)3 d后，開(kāi)始葉面噴施SNP，以藥液附于葉面全部濕潤(rùn)但不下滴為度。

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理：①CK1：28 ℃培養(yǎng)+噴施蒸餾水；②CK2：4 ℃培養(yǎng)+噴施蒸餾水；③T1：4 ℃處理+噴施0.1 mmol/L SNP；④T2：4 ℃處理+噴施0.5 mmol/L SNP；⑤T3：4 ℃處理+噴施1.0 mmol/L SNP；⑥4 ℃處理+噴施1.5 mmol/L SNP。每天上午9：00左右噴1次，連續(xù)處理3 d后采集幼苗每枝條的第2片葉片測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，每處理5次重復(fù)。

1.2 測(cè)定方法

采用電導(dǎo)率儀法[5]測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸法[5]測(cè)定丙二醛（MDA）含量；采用氮藍(lán)四唑法[6]測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚法[7]測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性；采用過(guò)氧化氫還原法[8]測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性；參照NaKano等[9]的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性；采用考馬斯亮藍(lán)染色法[6]測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的含量；采用蒽酮比色法[6]測(cè)定可溶性糖的含量；采用茚三酮顯色法[6]測(cè)定脯氨酸含量。各參數(shù)的含量均以鮮重計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和繪圖，運(yùn)用SPSS 13.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。文中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)低溫脅迫下秋茄幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響

逆境脅迫通常會(huì)引起植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大，因此可以用電導(dǎo)率的相對(duì)變化來(lái)表示植物細(xì)胞的受損程度。由圖1可知，CK2的相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于CK1，表明低溫導(dǎo)致秋茄葉片細(xì)胞的破損。而SNP處理的相對(duì)電導(dǎo)率均低于CK2，T1、T2、T3和T4分別較CK2降低了23.21%、33.93%、26.79%和26.78%，其中T2處理抑制相對(duì)電導(dǎo)率增加的效果最好。

2.2 外源NO對(duì)低溫脅迫下秋茄MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，可以和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的蛋白質(zhì)和酶進(jìn)行結(jié)合，從而破壞植物膜的結(jié)構(gòu)，其含量越高意味著膜損傷程度越重。從圖2可知，CK2組MDA含量明顯高于CK1和SNP處理組，以T2處理的MDA含量最低，比CK2低40.30%，兩者差異顯著。說(shuō)明低溫脅迫導(dǎo)致秋茄葉片細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA積累的增加，外源NO處理可抑制MDA的積累，在一定程度上緩解低溫對(duì)膜的傷害。

2.3 外源NO對(duì)低溫脅迫下秋茄幼苗抗氧化酶類(lèi)活性的影響

SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶類(lèi)在植物體內(nèi)清除活性氧，保護(hù)植物免受氧化脅迫方面發(fā)揮著重要作用。由表1可知，CK2處理組SOD活性顯著低于CK1組，表明低溫處理顯著降低了秋茄葉片SOD活性；但經(jīng)外源NO處理后，低溫脅迫下秋茄幼苗的SOD活性均比CK2有所提高，特別是T1和T2處理效果和CK2相比有顯著差異。溫度降低，秋茄葉片POD和CAT活性均增加，這可能是秋茄低溫適應(yīng)的應(yīng)對(duì)策略，外源NO處理后，兩者的增幅更大，T2處理的POD活性及T2處理的CAT活性較CK2分別增加37.86%和69.32%，均達(dá)到顯著水平。T1、T2和T3處理下，秋茄幼苗的APX活性分別較CK2高20.71%、36.90%、49.52%，但T4處理下APX活性較CK2降低2.47%，低溫下不同濃度的SNP對(duì)CAT和APX活性的影響有濃度效應(yīng)，即低濃度促進(jìn)，高濃度抑制，并且以T2和T3處理提高兩者活性的效果最好，與CK2相比有顯著性差異。數(shù)據(jù)分析表明，秋茄可以通過(guò)提高SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶的活性，清除低溫脅迫產(chǎn)生的氧自由基，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的目的，以便更好地適應(yīng)低溫環(huán)境。

2.4 外源NO對(duì)低溫脅迫下秋茄滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和游離脯氨酸等均是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，已有的研究表明，較多植物體內(nèi)會(huì)累積滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)保護(hù)體內(nèi)組織免受凍害。從表2可以看出，CK1組可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于CK2組，表明低溫處理降低了秋茄葉片中可溶性蛋白質(zhì)的量；但T1、T2、T3和T4組較CK2可溶性蛋白質(zhì)的含量分別提高了66.56%、101.99%、87.42%和63.25%，且均顯著高于CK2，意味著外源NO可以有效提高秋茄葉片可溶性蛋白質(zhì)的含量，其中T2甚至恢復(fù)到CK1的水平，效果最佳。CK2組較CK1組可溶性糖和脯氨酸含量顯著提高，增幅分別達(dá)到75.31%和33.41%。外源NO處理后，T1和T4較CK2組并沒(méi)有顯著提高可溶性糖和游離脯氨酸的含量，但T2和T3卻顯著提高了，表明外源NO對(duì)于提高該兩者的量具有濃度效應(yīng)。以上數(shù)據(jù)表明外源NO處理可促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在秋茄葉片中的積累，是提高秋茄低溫適應(yīng)的另一重要因素。

3 小結(jié)與討論

植物遭受逆境脅迫后（如低溫、紫外線(xiàn)和重金屬等）細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)活性降低甚至喪失，細(xì)胞膜受損破裂，胞內(nèi)電解質(zhì)外流引起電導(dǎo)率增大，導(dǎo)致植物代謝紊亂[10]。因而，相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜透性和膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[11]。已有研究結(jié)果表明，外源NO可抑制低溫脅迫下苦瓜幼苗葉片MDA含量的升高，降低葉片質(zhì)膜相對(duì)透性，提高苦瓜低溫適應(yīng)能力[12]；噴施外源NO供體SNP能顯著提高蝴蝶蘭抗低溫能力，質(zhì)膜透性和MDA含量均顯著降低[13]；外源NO可以顯著降低低溫脅迫下核桃幼苗葉片的質(zhì)膜相對(duì)透性及丙二醛含量，緩解其遭受的冷脅迫損傷[14]；本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果大體相同，即低溫脅迫會(huì)對(duì)秋茄葉片細(xì)胞膜造成傷害，具體表現(xiàn)為MDA積累，電解質(zhì)滲漏率增加。噴施外源NO供體SNP可明顯減輕秋茄葉片的電解質(zhì)滲漏率和MDA含量上升的幅度，表明外源NO處理可在一定程度上提高秋茄對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)能力。

植物細(xì)胞中SOD、POD、CAT和APX等是其內(nèi)源抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，能有效清除植物體內(nèi)的氧自由基和過(guò)氧化物[15]，其活性水平在一定程度上代表了細(xì)胞清除活性氧自由基的能力，也間接反映了植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫處理使得秋茄葉片的POD、CAT和APX活性均呈上升趨勢(shì)，但與常溫對(duì)照相比，差異并不顯著，這可能是秋茄主動(dòng)適應(yīng)低溫的反應(yīng)；而SOD活性則顯著下降，這可能是由于活性氧大量生成使細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)明顯受到了抑制和破壞，脅迫強(qiáng)度超出秋茄植株的耐受能力，使得酶活下降。研究表明，低濃度NO不僅可作為抗氧化劑迅速清除活性氧自由基，而且能誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高酶活性[17]。本研究中，SNP處理顯著提高了低溫脅迫下秋茄幼苗葉片SOD活性，有利于促進(jìn)O2·-歧化生成H2O2，而H2O2主要通過(guò)POD、CAT和APX得以清除，減輕了活性氧自由基的破壞作用，提高了秋茄幼苗對(duì)寒冷的適應(yīng)性。

植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和游離脯氨酸等[18]。前人研究表明，很多植物在低溫脅迫下會(huì)累積可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以適應(yīng)寒冷，保護(hù)體內(nèi)組織免受凍害[18，19]。本研究中，低溫脅迫條件下，CK2較CK1組可溶性蛋白質(zhì)含量顯著降低，這可能是低溫脅迫的被動(dòng)反應(yīng)，但可溶性糖和游離脯氨酸含量卻顯著上升，可能是秋茄應(yīng)對(duì)低溫的適應(yīng)策略；當(dāng)外源NO處理低溫下的秋茄后，無(wú)論是可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖還是游離脯氨酸含量均較CK2顯著上升。張玲玲等[20]用外源NO對(duì)處理NaCl脅迫下的秋茄幼苗，發(fā)現(xiàn)表明SNP處理促進(jìn)葉片中脯氨酸含量的上升，使秋茄更好地適應(yīng)鹽生環(huán)境，這與本研究結(jié)果類(lèi)似。據(jù)此認(rèn)為外源NO供體SNP處理能夠提升低溫脅迫條件下秋茄葉片內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，從而進(jìn)一步提高其葉片細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力，更有利于秋茄在低溫脅迫下維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。

綜上所述，外源NO可以提高秋茄幼苗葉片SOD、POD、CAT和APX等4種抗氧化酶的活性，清除低溫脅迫產(chǎn)生的氧自由基，降低相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，保護(hù)秋茄幼苗的細(xì)胞膜系統(tǒng)；同時(shí)增加可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，維持細(xì)胞正常代謝，從而增強(qiáng)了秋茄幼苗對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性。本試驗(yàn)是在室內(nèi)模擬完成的，冬季灘涂上生長(zhǎng)的秋茄可能會(huì)受到水淹和鹽脅迫，甚至于更低溫度和更長(zhǎng)時(shí)間的脅迫，環(huán)境更為惡劣，研究結(jié)果能否在野外條件下發(fā)揮作用有待于進(jìn)一步探討。

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