過(guò)氧化氫（H2O2）對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷的研究

趙立理，張振昶，蘇 剛，關(guān)智媛，姚春榮，石正洪*

（1.蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳所，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省平?jīng)鍪袐D幼保健院，甘肅 平?jīng)?744000）

腦神經(jīng)系統(tǒng)是人體最精密，復(fù)雜的器官，并控制著軀體其他器官的功能等[1]。神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由于感染，腫瘤，血管病變，外傷，中毒，免疫障礙，變性，遺傳，先天發(fā)育障礙，代謝等引起的疾病。而腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率全球與日俱增，據(jù)報(bào)道現(xiàn)有150萬(wàn)人患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。腦血管病具有較高的發(fā)病率，致殘率，死亡率[3]。近年來(lái)，氧化應(yīng)激（oxidative stress）等非傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素已成為腦卒中的研究焦點(diǎn)，因?yàn)檠趸瘧?yīng)激反應(yīng)始終貫穿于腦卒中發(fā)展的整個(gè)病理過(guò)程，且是早期發(fā)生，故目前諸多學(xué)者著眼于腦血管疾病的氧化應(yīng)激機(jī)制的研究[4]。增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力為防治急性腦卒中的重要措施之一。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞系（pheochromocytoma cells，PC12）是一種很好的研究神經(jīng)細(xì)胞生理，病理及藥理的模型[5]。本文采用了H2O2造成PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，MTT檢測(cè)及相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA，SOD的檢測(cè)，Hoechest 33258凋亡檢測(cè)，及H2O2的作用下PC12細(xì)胞周期變化，來(lái)證明H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

H2O2（由Sigma公司購(gòu)買），1640（Gibico），小牛血清（BI），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物技術(shù)研究所，批號(hào)（SOD A001-3，MDA A003-4）MTT（sigma公司）

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)，流式細(xì)胞儀，超低溫-80℃冰箱（美國(guó)賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)）；脫色搖床（沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司生產(chǎn)），恒溫水浴箱（天津艾薇歐科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司生產(chǎn)）。

1.3 方法

PC12氧化應(yīng)激損傷模型的建立。

1.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPIM-1640完全培養(yǎng)液配成1×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 uL，每組設(shè)6個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)分為3組，陰性對(duì)照組：不加藥物僅加基礎(chǔ)培養(yǎng)液；藥物組：分為5組，各組所加的H2O2濃度分別為200，100，50，25，12.5 mmol/L?？瞻捉M：不加藥物，而僅以RPIM-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液代替細(xì)胞。將以上的對(duì)照組，空白組，藥物組置于37.5℃，5%的CO2，相對(duì)濕度為95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2，4，6 h后在每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔中加入MTT20 uL，孵育結(jié)束時(shí)棄上層清液，加入DMSO150 uL，用酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。各組細(xì)胞存活率按照如下公式計(jì)：細(xì)胞存活率=（測(cè)定組OD值一測(cè)定空白管OD值）／（正常組O值一測(cè)定空白管OD值）×100%。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

1.3.3 細(xì)胞核Houchest33258凋亡染色

取蓋玻片在70%乙醇中浸泡5 min，將其放在六孔內(nèi)，約為50%～80%。200，100，50，25，12.5 umol/mL的H2O2作用4 h后，每孔加入0.5 mL的固定液，固定10 min或更長(zhǎng)時(shí)間（可4℃過(guò)夜）去固定液，用PBS洗兩遍。加入0.5 mL的Hoechst33258染色液，染色5 min，去染色液，用PBS洗兩遍，滴一滴抗熒光碎滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，熒光顯微鏡檢測(cè)呈藍(lán)色的細(xì)胞核。

1.3.4 MDA含量、SOD活性的檢測(cè)，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，按照南京建成試劑盒說(shuō)明書測(cè)定SOD及MDA含量。

1.3.5 流式細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)夜，IC50值23 umol/mL的H2O2孵育4 h。胰酶消化細(xì)胞后，離心1500 rpm 10 min，取上清，用300 uLPBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞液滴加入預(yù)冷的700 uL的無(wú)水乙醇中，4度避光固定過(guò)夜，固定過(guò)的細(xì)胞1500 rpm離心10 min，棄上清，用PBS洗滌，再用含RNageA重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30 min，加入100 ug/mL PI 500 uL，4℃避光孵育30 min。用300目孔徑為40～50 unL尼龍網(wǎng)膜（篩網(wǎng)）過(guò)濾細(xì)胞。

1.3.6 結(jié)果分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)，結(jié)合布爾邏輯運(yùn)算符進(jìn)行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

IC50值H2O2作用于PC12細(xì)胞，正常對(duì)照組細(xì)胞為呈長(zhǎng)梭形的貼壁細(xì)胞， 折光度強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快。而損傷組細(xì)胞折光度減弱，細(xì)胞圓縮、脫落。

2.2 H2O2作用于PC12細(xì)胞增殖活性的影響

H2O2作用于PC12細(xì)胞的活力影響，圖為200，100，50，25，12.5 mol/L的H2O2作用于PC12細(xì)胞4 h。H2O2的濃度分別為200，100，50，25，12.5 mmol/L，提示H2O2濃度為25，12.5 mmol/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故其IC50值在25 mol/L到12.5 mol/L之間。

圖1 為不同濃度的H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷MTT檢測(cè)，其中25 M和12.5 mM有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3 不同濃度梯度的H2O2對(duì)PC12細(xì)胞凋亡染色Hoechst 33258（見圖2）

圖2

2.4 細(xì)胞周期結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，給予與IC50值的H2O2損傷后的PC12細(xì)胞后，G1期細(xì)胞增多。

2.5 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞MDA含量和SOD活性的影響

與正常組比較，隨著H2O2的濃度增加，損傷組的細(xì)胞MDA明顯增加（P＜0.05），SOD活力明顯抑制（P＜0.01）

3 討 論

缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，而在急性腦卒中發(fā)生早期4 h，為腦卒中黃金搶救時(shí)間，已證實(shí)缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)理中氧化應(yīng)激損傷占有重要的作用，故目前多數(shù)學(xué)者著眼于缺血性腦卒中氧化應(yīng)激損傷的研究。ROS是氧化應(yīng)激產(chǎn)物，釋放出的氧化應(yīng)激酶可引起細(xì)胞線粒體損傷。如Cao.L.等人通過(guò)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）過(guò)表達(dá)研究了G6PD在腦血管病的氧化應(yīng)激損傷機(jī)制中的重要保護(hù)作用。PPP在腦血管病發(fā)生過(guò)程中起著保護(hù)神經(jīng)元的作用，且會(huì)使NADPH合成增加，從而減少了rGSH的生成[6]。Zhang.Y.等人通過(guò)研究證明在腦卒中發(fā)生后的不同時(shí)間點(diǎn)里氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生的NOX2表達(dá)不同，闡述了NOX2不是早期的腦卒中氧化應(yīng)激損傷時(shí)出現(xiàn)的酶，而是持續(xù)再灌注損傷時(shí)重要的氧化應(yīng)激酶，故此酶可以作為潛在的治療腦卒中的作用靶點(diǎn)?，F(xiàn)今H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型為公認(rèn)的腦血管病氧化應(yīng)激模型[7]。

本研究顯示：與正常組細(xì)胞相比，損傷組的細(xì)胞存活率明顯降低，且MDA釋放量增加，SOD活力減弱，細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡，G1期明顯阻滯，而G1期為開始合成細(xì)胞生長(zhǎng)需要的各種蛋白質(zhì)，糖類，脂類及RNA等，是DNA合成預(yù)備期。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明H2O2可引起PC12細(xì)胞停滯在G1，出現(xiàn)不分裂。且可出現(xiàn)細(xì)胞核明顯凋亡，故為今后的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷機(jī)制的研究提供的新的思路及方向，但其具體相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制還需進(jìn)一步研究及探討。同時(shí)除了基礎(chǔ)的細(xì)胞研究以外，還需進(jìn)行臨床觀察與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，通過(guò)對(duì)腦卒中氧化應(yīng)激機(jī)制的研究尋找新穎和有效的藥物靶點(diǎn)。

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