微生物發(fā)酵法制備1,3-丙二醇的研究進(jìn)展

楊 云 殷 冉 裴建軍

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

1,3-丙二醇(1,3-propanedio，簡稱1,3-PDO)是一種重要的化工原料[1]，可用于油墨、印染、涂料、化妝品、食品、潤滑油和藥物等方面的生產(chǎn)。此外，1,3-PDO 還可以作為單體合成聚酯、聚醚、聚氨酯和雜環(huán)化合物等，如1,3-PDO與對苯甲酸發(fā)生聚合反應(yīng)可生成極具發(fā)展前途的新型聚酯高分子材料聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)。

1,3-PDO的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，目前實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的主要是化學(xué)合成法，主要包括丙烯醛水合加氫法和環(huán)氧乙烷羰基化法。但該方法存在設(shè)備投資大、工藝要求嚴(yán)格、產(chǎn)品提取難度大、副產(chǎn)物多、三廢處理成本高、原料不可再生等諸多問題。以葡萄糖或甘油為底物，通過微生物發(fā)酵法制備1,3-PDO具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單、選擇性好、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少、原料可再生、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已成為本產(chǎn)品制備領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)和發(fā)展的趨勢[2]。本文從發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝、1,3-丙二醇代謝中關(guān)鍵酶和制備1,3-丙二醇基因工程菌等幾個方面對發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

1 生產(chǎn)1，3-丙二醇的發(fā)酵菌種

目前從自然界中發(fā)現(xiàn)的能夠生產(chǎn)1,3-PDO的微生物菌種都是細(xì)菌，主要集中在腸桿菌科、乳桿菌屬和梭菌屬。腸道細(xì)菌中主要有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellaneumoniae)、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)、弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)和成團(tuán)腸桿菌(Enterobaeteragglomerans)；乳桿菌屬的包括短乳桿菌(Lactobacillibrevis)和布氏乳桿菌(Lactobacillibuchneri)；梭菌屬主要包括丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiabutyricum)和巴氏梭狀芽孢桿菌(Clostridiapasteuianu)。肺炎克雷伯氏菌、丁酸梭狀芽孢桿菌和弗氏檸檬菌因具有較高的甘油、1,3-PDO耐受力以及較高的底物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度，是目前研究較多的三種菌種[3]。肺炎克雷伯氏菌是一種革蘭氏陰性菌，具有兼性厭氧特性。丁酸梭菌是一種嚴(yán)格厭氧菌，對高溫、干燥等環(huán)境具有較強(qiáng)抵抗力，主要存在于土壤、海水和淡水的沉積物以及人和家畜的腸道內(nèi)。這些野生型菌株都只能以甘油為唯一碳源和供能物質(zhì)，經(jīng)過代謝后，除生成目的產(chǎn)物1,3-PDO外，還能產(chǎn)生乙醇、乙酸、丁酸、2,3-丁二醇、乳酸、玻拍酸等副產(chǎn)物。由于底物、產(chǎn)物及副產(chǎn)物都能抑制菌體的生長，因此，篩選獲得對底物、產(chǎn)物和副產(chǎn)物耐受能力強(qiáng)的1,3-丙二醇發(fā)酵優(yōu)良菌種是該方面研究的重要內(nèi)容之一[4]。

對1,3-丙二醇生產(chǎn)菌種的研究，除了從自然界中分離、篩選野生菌并利用物理化學(xué)手段對其進(jìn)行誘變育種以外，還包括基因工程菌的構(gòu)建[5]?；蚬こ叹臉?gòu)建主要是基于進(jìn)一步提高1,3-PDO的產(chǎn)量、降低制備成本，利用基因工程手段對野生菌進(jìn)行改造；或?qū)Ρ旧聿荒苓M(jìn)行甘油和1,3-PDO代謝生產(chǎn)的其他菌種進(jìn)行改造，使之具有生產(chǎn)目的產(chǎn)物的能力；或基于合成生物學(xué)的技術(shù)與方法，將合成1,3-丙二醇關(guān)鍵酶整合到新的宿主細(xì)胞中。

2 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的工藝

在甘油發(fā)酵產(chǎn)1,3-PDO過程中，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，可以達(dá)到提高1,3-PDO產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，減少底物甘油、產(chǎn)物1,3-PDO和其它副產(chǎn)物對細(xì)胞生長的抑制作用的目的。吳斌等人優(yōu)化了丁酸梭菌利用甘油厭氧發(fā)酵制備1,3-丙二醇的碳源、氮源等營養(yǎng)條件[6]。在最佳條件下，發(fā)酵50 h可產(chǎn)1,3-丙二醇40.7 g/L，甘油摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)68%。冷桂華等人利用克雷伯氏菌以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，通過對甘油初始濃度、pH、溫度、通氣策略等發(fā)酵條件的優(yōu)化，1,3-PDO的產(chǎn)量可達(dá)57.63 g /L[7]。王曉楠等人在微氧條件下，考察了肺炎克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO過程中丙酮酸、檸檬酸對發(fā)酵的影響[8]。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加一定量的丙酮酸對菌體生長和1,3-丙二醇合成具有一定的促進(jìn)作用，而加入一定量的檸檬酸對菌體生長和1,3-丙二醇的合成有抑制作用。

微生物生產(chǎn)過程中，不同的發(fā)酵方式，對菌株代謝流及其產(chǎn)量會有較大的影響。目前，1,3-PDO生產(chǎn)的發(fā)酵方式主要有批次發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、固定化和混合菌發(fā)酵等。分批發(fā)酵可以得到較高的1,3-PDO濃度，但是底物利用率和生產(chǎn)強(qiáng)度相對較低、產(chǎn)物抑制強(qiáng)烈。連續(xù)發(fā)酵可以大大提高生產(chǎn)強(qiáng)度，同時降低產(chǎn)物抑制作用，然而由于稀釋效應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)物濃度較低。Wilkens等利用丁酸梭菌為菌種，以精甘油為原料進(jìn)行補(bǔ)料批式發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD，其產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到93.9 g/L 和3.3 g/L/h[9]。賀璐等采用單級連續(xù)發(fā)酵、二級連續(xù)發(fā)酵和三級連續(xù)發(fā)酵制備1,3-PDO，其中二級連續(xù)發(fā)酵是較優(yōu)的方式，1,3-PDO生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.89 g/L/h[10]。Gungormusler以粗甘油為原料，以不銹鋼絲作為固定化載體，固定化發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到4.8 g/L/h[11]。

3 1，3-丙二醇代謝中關(guān)鍵酶及代謝途徑

甘油轉(zhuǎn)化1,3-PD 過程的關(guān)鍵酶有：甘油脫水酶、1,3-丙二醇脫氫酶、甘油脫氫酶(GDH)、2-羥基丙酮激酶(DHAK)和丙酮酸脫氫酶系(PDH)等。

甘油代謝為1,3-PDO主要是在二羥丙酮操縱子(dha)調(diào)控下進(jìn)行，代謝分為還原和氧化兩條支路[24,25]。(1)還原途徑：在維生素B12存在下(丁酸梭桿菌除外),甘油脫水酶將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛；在還原力NADH2存在下，1,3-丙二醇氧化還原酶催化3-HPA生成1,3-PDO。還原途徑消耗氧化途徑產(chǎn)生的NADH2，使微生物細(xì)胞內(nèi)達(dá)到平衡。(2)氧化途徑：以NAD+為輔酶，甘油在甘油脫氫酶(GDH)催化下生成2-羥基丙酮(DHA)；DHA在ATP及2-羥基丙酮激酶(DHAK)作用下磷酸化為二羥基丙酮磷酸( DHAP)；DHAP進(jìn)一步生成丙酮酸，然后通過乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)或生成其它小分子醇、酸等代謝產(chǎn)物。氧化途徑產(chǎn)生ATP和還原力NADH2。

4 制備1，3-丙二醇基因工程菌的構(gòu)建

野生菌或傳統(tǒng)菌發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PDO的產(chǎn)量低、轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)成本高，要得到高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高轉(zhuǎn)化率的菌株，利用基因工程方法構(gòu)建基因工程菌株是一種有效途徑。基因工程菌的構(gòu)建主要有5種方案[26]。(1)強(qiáng)化還原途徑中限速酶(如甘油脫水酶)的表達(dá)或阻斷副產(chǎn)物代謝途徑，并克隆表達(dá)編碼甘油脫水酶再激活因子的基因；(2)將1,3-PDO產(chǎn)生菌的相關(guān)基因克隆到E.coli等基因工程菌中；(3)將生產(chǎn)1,3-PDO的dhaB、dhaT基因克隆到甘油生產(chǎn)菌中；(4)將甘油生產(chǎn)菌的相關(guān)基因DAR1，GPP2克隆到1,3-PDO生產(chǎn)菌中；(5)將1,3-PDO的dhaB、dhaT 基因和甘油生產(chǎn)菌的DAR1，GPP2基因都克隆到E.coli等基因工程菌中。

4.1 代謝途徑中無益副產(chǎn)物產(chǎn)生基因的去除

要實(shí)現(xiàn)甘油的高效轉(zhuǎn)化，有效策略或舉措就是在維持菌體正常代謝的前提下，打破正常次級代謝途徑，達(dá)到抑制或阻斷氧化途徑中某些代謝支路、增加還原途徑代謝流量的目的。乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇是1,3-PDO發(fā)酵中主要副產(chǎn)物，減少發(fā)酵過程中副產(chǎn)物的積累就能降低這些副產(chǎn)物對細(xì)胞生長產(chǎn)生的抑制作用。陳利飛等通過敲除克雷伯氏菌產(chǎn)乳酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶基因(ldhA)，使得乳酸產(chǎn)量由原來的10.16 g/L 降為0.49 g/L，而1,3-PDO的產(chǎn)量和甘油轉(zhuǎn)化率分別提高了8.79%和5.33%[27]。2，3-丁二醇與產(chǎn)物的沸點(diǎn)接近，增加了獲得高純1,3-PDO產(chǎn)品分離的難度。乙酰乳酸合酶缺陷的克雷伯氏菌突變株由于在甘油代謝中存在缺陷無法生產(chǎn)1，3-丙二醇或2，3-丁二醇[28]，Lee等將Zymomonasmobilis的丙酮酸脫羧酶(pdc)和醛脫氫酶(aldB)基因引入乙酰乳酸合酶缺陷的克雷伯氏菌突變株中[29]，實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，有效恢復(fù)了突變株的甘油代謝，實(shí)現(xiàn)了2，3-丁二醇產(chǎn)量的最小化，同時強(qiáng)化了1,3-PDO的生產(chǎn)。

4.2 以甘油為底物發(fā)酵制備1,3-PDO的基因工程菌構(gòu)建

以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO的合成途徑中，還原力NADH的不足是引起中間代謝產(chǎn)物3-羥基丙醛累積的關(guān)鍵因素，從而會抑制甘油代謝途徑關(guān)鍵酶甘油脫水酶的活性，對菌體也有一定的毒害作用，結(jié)果將嚴(yán)重影響1,3-丙二醇產(chǎn)量[30]。江南大學(xué)方慧英等人以大腸桿菌和克雷伯氏菌DNA為模板克隆得到y(tǒng)qhD(1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶)和dhaB、dhaT基因[31]，構(gòu)建雙啟動子表達(dá)載體pEtac-dhaB-tac-yqhD及表達(dá)載體pUC-tac-dhaT，并在E.coliBL21中實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)。她們創(chuàng)制的具有雙質(zhì)粒系統(tǒng)的新型重組大腸桿菌可利用兩種輔酶(NADH、NADPH)將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PDO，有效解決了合成途徑中還原力不足這一技術(shù)瓶頸。

4.3 以葡萄糖為底物直接發(fā)酵制備1,3-PDO的基因工程菌構(gòu)建

利用葡萄糖生產(chǎn)1,3-PDO最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為甘油與甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PDO兩個反應(yīng)整合到同一菌株中。實(shí)現(xiàn)這一過程可以采用的技術(shù)手段包括：(1)在1,3-PDO產(chǎn)生菌中表達(dá)甘油產(chǎn)生途徑的基因。在甘油產(chǎn)生菌中，3-磷酸甘油酯酶催化3-磷酸甘油為甘油。由于其底物3-磷酸甘油是微生物脂類合成代謝的中間產(chǎn)物，因此，在1,3-PDO產(chǎn)生菌中表達(dá)此酶，能將葡萄糖代謝和1,3-PDO合成途徑聯(lián)系起來。(2)在甘油產(chǎn)生菌中表達(dá)1,3-PDO產(chǎn)生途徑的基因，如在釀酒酵母中表達(dá)dhaB和dhaT基因。但由于真核和原核表達(dá)系統(tǒng)的差異，要求在釀酒酵母中構(gòu)建全新的dhaB和dhaT。(3)在既不產(chǎn)生甘油又不產(chǎn)生1,3-PDO的微生物中表達(dá)上述兩種基因。雖然天然大腸桿菌既不能產(chǎn)生甘油也不能產(chǎn)生1,3-PDO，但該方法的優(yōu)勢是不需克服甘油代謝途徑和1,3-PDO代謝途徑中的調(diào)控機(jī)制[32]。

5 結(jié)論與展望

1,3-PDO的微生物發(fā)酵法具有廣闊的研發(fā)前景。近年來，國內(nèi)外通過對微生物法生產(chǎn)1,3-PDO的發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝、1,3-PDO代謝中關(guān)鍵酶和制備1,3-PDO的基因工程菌構(gòu)建等方面開展了大量研究，并取得了重大的進(jìn)展和可喜的成果，但一些關(guān)鍵技術(shù)還需進(jìn)一步突破，而且，目前的研究多集中在實(shí)驗(yàn)室階段，工業(yè)化放大仍然存在著一些技術(shù)瓶頸。因此，今后的研究可以從以下幾個方面重點(diǎn)入手：(1)將傳統(tǒng)育種與基因改造相結(jié)合，篩選出對底物和產(chǎn)物耐受性好、產(chǎn)量高的優(yōu)異菌種。(2)通過代謝工程、分子生物學(xué)等手段強(qiáng)化還原途徑中限速酶的表達(dá)以及阻斷副產(chǎn)物代謝途徑，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率。(3)引入新技術(shù)、新手段對發(fā)酵過程進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，使菌種的優(yōu)良特性達(dá)到最大限度的發(fā)揮。(4)利用合成生物學(xué)的技術(shù)與方法，基于生物合成1,3-PDO的基本規(guī)律，人工設(shè)計(jì)并構(gòu)建新型、高效生物制造1,3-PDO的超級細(xì)胞。(5)基于合理、經(jīng)濟(jì)、高效的原則，對發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PDO整個過程的技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化和集成創(chuàng)新。相信隨著基礎(chǔ)研究和現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，微生物法生產(chǎn)1,3-PDO將會取得更大的突破性成果，實(shí)現(xiàn)具有顯著競爭優(yōu)勢的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及其規(guī)模化應(yīng)用。

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