建立基于miniSOG標(biāo)簽的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法觀(guān)察腺病毒IX蛋白的亞細(xì)胞定位

鄒小輝 邵博 王敏 屈建國(guó) 魯茁壯 洪濤

100052 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(鄒小輝、邵博、王敏、屈建國(guó)、魯茁壯、洪濤)；475000 開(kāi)封，河南化工技師學(xué)院(邵博)

·論著·

建立基于miniSOG標(biāo)簽的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法觀(guān)察腺病毒IX蛋白的亞細(xì)胞定位

鄒小輝 邵博 王敏 屈建國(guó) 魯茁壯 洪濤

100052 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(鄒小輝、邵博、王敏、屈建國(guó)、魯茁壯、洪濤)；475000 開(kāi)封，河南化工技師學(xué)院(邵博)

目的 建立光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法觀(guān)察腺病毒蛋白IX的細(xì)胞內(nèi)定位。方法 miniSOG是新發(fā)現(xiàn)的能夠被熒光顯微鏡和電子顯微鏡解析的蛋白標(biāo)簽。通過(guò)PCR方法克隆腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白IX與miniSOG的融合基因IXSOG，將其構(gòu)建至真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞；通過(guò)熒光顯微鏡確定IXSOG蛋白表達(dá)的細(xì)胞，之后對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行原位固定、光氧化、制備超薄切片，用電鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)IXSOG融合蛋白的表達(dá)及分布情況。結(jié)果 在藍(lán)光激發(fā)下，miniSOG能夠發(fā)射綠色熒光。定位選擇光氧化形成嗜鋨顆粒的IXSOG表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀(guān)察，結(jié)果顯示IX蛋白在細(xì)胞核內(nèi)多個(gè)區(qū)域形成點(diǎn)狀聚集或包涵體。結(jié)論 建立了依賴(lài)miniSOG標(biāo)簽的的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法，該方法可用于病毒蛋白細(xì)胞內(nèi)定位研究。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (31400156);National Science and Technology Major Project of China(2014ZX10004002-004)

電子顯微鏡超薄切片技術(shù)是將細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行固定、脫水、包埋、聚合、切片并染色，然后在電鏡下觀(guān)察的一種技術(shù)，染色主要依賴(lài)于重金屬鹽對(duì)各種細(xì)胞或病毒結(jié)構(gòu)結(jié)合程度不同，使得各種細(xì)胞器或病毒在電鏡下形成反差而得以區(qū)分，借助超薄切片技術(shù)可以研究病毒與細(xì)胞之間的相互作用，如病毒的形態(tài)發(fā)生學(xué)、病毒感染細(xì)胞后導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)改變等研究[1]。然而，由于重金屬鹽染色主要是提高細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分或病毒顆粒的反差，因此超薄切片技術(shù)無(wú)法觀(guān)察某個(gè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體定位情況。一直以來(lái)，細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白的電鏡定位主要依賴(lài)于免疫電鏡技術(shù)(免疫膠體金)，然而免疫電鏡對(duì)抗體質(zhì)量要求高，操作較繁瑣；膠體金顆粒并不是目標(biāo)蛋白自身，僅能近似定位目標(biāo)蛋白，并不能顯示目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的精確位置[2-4]。因此，發(fā)展新的蛋白定位電鏡技術(shù)非常必要。

2011年，美國(guó)加州大學(xué)Shu等[5]發(fā)明了能夠用于電鏡定位的蛋白標(biāo)簽miniSOG(Mini Singlet Oxygen Generator)，該蛋白是由擬南芥向光蛋白2(AtPhot2)的LOV2結(jié)構(gòu)域突變而來(lái)，是一種含106個(gè)氨基酸殘基的熒光黃素蛋白，在熒光顯微鏡下，miniSOG像GFP一樣發(fā)射綠色熒光；在藍(lán)光激發(fā)并有氧氣存在時(shí)，其能催化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)聚合形成嗜鋨顆粒(DAB的光氧化)，當(dāng)使用四氧化鋨對(duì)電鏡標(biāo)本進(jìn)行后固定時(shí)，DAB聚合物能夠吸附鋨顆粒，在透射電鏡下呈深色，即miniSOG示蹤部位能夠被電鏡解析[6-8]，實(shí)現(xiàn)了蛋白觀(guān)察的光鏡與電鏡關(guān)聯(lián)(Correlative light and electron microscopy，CLEM)。

人腺病毒(Human Adenovirus, HAdV)是直徑約90 nm的正二十面體無(wú)包膜病毒，其主要衣殼蛋白包括五鄰體和六鄰體；次要衣殼蛋白包括Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅲa等蛋白，其中IX蛋白是一個(gè)含有140個(gè)氨基酸殘基的多肽，主要是以三聚體形式將9個(gè)六鄰體連接在一起形成腺病毒二十面體表面的結(jié)構(gòu)[9]，IX蛋白還具有轉(zhuǎn)錄因子活性，在病毒復(fù)制過(guò)程中參與調(diào)控病毒和細(xì)胞基因表達(dá)[10]。此外，在腺病毒感染細(xì)胞或胞內(nèi)單獨(dú)表達(dá)IX蛋白時(shí)，都能在細(xì)胞核內(nèi)形成特殊的核內(nèi)包涵體結(jié)構(gòu)，由于這些結(jié)構(gòu)的密度較低，在電鏡下只能觀(guān)察到無(wú)定形的包涵體[11]。本研究中，我們?cè)噲D建立利用miniSOG蛋白標(biāo)簽的的CLEM技術(shù)，并利用該技術(shù)觀(guān)察腺病毒IX蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位情況。

1 材料與方法

1.1 材料 293細(xì)胞為本室保存，pcDNA3-TPL質(zhì)粒為CMV啟動(dòng)子下游含人41型腺病毒三連體前導(dǎo)序列TPL的pcDNA3質(zhì)粒(TPL有利于提高目的基因表達(dá))，pcDNA3-miniSOG為克隆有miniSOG基因的pcDNA3質(zhì)粒，pShuttle-IXSOG為IX與miniSOG融合表達(dá)載體(將IX與miniSOG的融合蛋白命名為IXSOG)，它們?yōu)楸臼仪捌跇?gòu)建[12]。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Life technologies公司。Q5高保真DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ、NcoⅠ為美國(guó)NEB公司產(chǎn)品。戊二醛、二甲胂酸鈉、醋酸雙氧鈾、四氧化鋨、環(huán)氧樹(shù)脂Epon-812為美國(guó)SPI公司產(chǎn)品。二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine, DAB)為Amresco公司產(chǎn)品。氧氣購(gòu)自北京如源如泉科技有限公司。氨基三唑(Aminotriazole)為美國(guó)Chem Service公司產(chǎn)品。DAPI購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。引物由北京六合華大基因有限公司合成。

1.2 pTPL-IXSOG載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 使用Q5高保真DNA聚合酶，以pShuttle-IXSOG為模板，使用上下游引物擴(kuò)增IX與miniSOG的融合基因(IXSOG)，其中上游引物序列：5′ -ccgcggtaccatgagcaccaactcgtttgatgg-3′ ，下游引物序列：5′ ggccctcgagctagccatcc agctgcacaccaatg-3′ 。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收，經(jīng)KpnI與XhoI雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3-TPL載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，得到pTPL-IXSOG質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)NcoI酶切鑒定后，選取鑒定正確的質(zhì)粒用于測(cè)序驗(yàn)證。該融合蛋白在IX與miniSOG之間通過(guò)Flag接頭連接，并在Flag的5′端與3′ 端分別添加Ser-Ala和Leu-Ala，且miniSOG位于IX的C端[12]。將成功構(gòu)建的質(zhì)粒pTPL-IXSOG與pcDNA3-miniSOG分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，48 h后使用多聚甲醛于室溫固定15 min，PBS漂洗5 min×3次，DAPI復(fù)染5 min，PBS漂洗5 min×3次后使用熒光顯微鏡觀(guān)察。

1.3 光氧化實(shí)驗(yàn) 使用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將1 μg pTPL-IXSOG轉(zhuǎn)染至12孔板293細(xì)胞(轉(zhuǎn)染前一天按1∶4傳代至細(xì)胞培養(yǎng)板中)，轉(zhuǎn)染后48 h，于熒光顯微鏡下觀(guān)察IXSOG蛋白表達(dá)情況，利用熒光指示定位IXSOG表達(dá)細(xì)胞，選取IXSOG陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行電鏡制樣。細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛(5%戊二醛儲(chǔ)存液經(jīng)0.2 M pH7.4二甲胂酸鈉1∶1稀釋)于冰上固定1 h后，使用0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.4)漂洗5次，之后用封閉液(20 mmol/L氨基三唑，50 mmol/L甘氨酸，10 mmol/L氰化鉀)于4 ℃封閉30 min，封閉內(nèi)源性(特別是線(xiàn)粒體內(nèi))黃素蛋白的光氧化活性。加入新鮮配制且經(jīng)氧氣飽和的冰DAB(1 mg/ml，pH7.4)溶液，迅速轉(zhuǎn)移至倒置熒光顯微鏡(Nikon, Eclipse Ti-U)，用40倍物鏡對(duì)目的細(xì)胞使用藍(lán)光照射15-20 min，熒光顯微鏡光源為短弧汞燈(功率100W，購(gòu)自德國(guó)OSRAM GmbH)。為了維持DAB溶液的低溫及足夠的氧氣濃度，照射期間更換2-3次DAB溶液，待IXSOG陽(yáng)性細(xì)胞顏色變成淡黃時(shí)停止光照。0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液漂洗5次后，加入1% OsO4于冰上固定染色30 min，超純水漂洗5次，然后使用2%醋酸鈾染色1 h，再經(jīng)乙醇于4 ℃ 進(jìn)行梯度脫水(20%、50%、70%、90%、100%、100%依次各2 min)，然后使用無(wú)水乙醇于室溫脫水2 min。經(jīng)不同比例的Epon-812樹(shù)脂與乙醇的混合物于室溫(1∶3、1∶1、3∶1的混合比例各1 h)進(jìn)行浸透處理，之后再使用純樹(shù)脂處理2次，每次各1 h。最后更換為Epon-812樹(shù)脂，于37 ℃ 過(guò)夜，隨后轉(zhuǎn)移至60 ℃ 烤箱聚合48 h，修塊、制備超薄切片并使用透射電鏡(Tecnai 12)觀(guān)察。

質(zhì)粒pcDNA3-miniSOG(對(duì)照)及pTPL-IXSOG分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，48 h后多聚甲醛固定，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡觀(guān)察miniSOG(A-C)或IXSOG(D-F)蛋白表達(dá)情況

pTPL-IXSOG轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后48 h光學(xué)顯微鏡下(LM)可見(jiàn)光(A)、熒光(B)直接觀(guān)察；DAB光氧化(C)、四氧化鋨固定(D)后光學(xué)顯微鏡觀(guān)察；制備超薄切片后在電鏡(EM)下觀(guān)察(E)

圖A為IXSOG陽(yáng)性細(xì)胞的超薄切片電鏡圖像，圖B，圖C分別為圖A中1和2放大后圖像，箭頭所示為IXSOG蛋白的點(diǎn)狀聚集及包涵體

2 結(jié)果

2.1 pTPL-IXSOG載體的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為797 bp的IXSOG基因，該基因中miniSOG基因融合在IX基因3′ 端，二者融合表達(dá)。通過(guò)酶切連接操作，IXSOG克隆到pcDNA3-TPL載體，得到pTPL-IXSOG質(zhì)粒。使用NcoI酶切，結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建正確，之后由北京六合華大基因有限公司測(cè)序驗(yàn)證序列無(wú)誤后(結(jié)果沒(méi)有顯示)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 熒光顯微鏡觀(guān)察IXSOG蛋白表達(dá) 293細(xì)胞經(jīng)pTPL-IXSOG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，熒光顯微鏡下可見(jiàn)到IXSOG融合蛋白的表達(dá)，經(jīng)DAPI染色后，可見(jiàn)呈現(xiàn)綠色熒光的IXSOG蛋白富集于細(xì)胞核，而在對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3-miniSOG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)miniSOG蛋白呈均勻分布(圖1)。

2.3 光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法觀(guān)察IXSOG蛋白的表達(dá)情況 pTPL-IXSOG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h，熒光顯微鏡下定位表達(dá)IXSOG蛋白的熒光細(xì)胞(圖2B)，細(xì)胞固定后進(jìn)行DAB光氧化反應(yīng)，可見(jiàn)IXSOG表達(dá)細(xì)胞顏色變黃，而相鄰的無(wú)熒光細(xì)胞(不表達(dá)IXSOG蛋白)并未見(jiàn)到明顯的顏色變化(圖2C)。光氧化后再經(jīng)OsO4后固定，可見(jiàn)表達(dá)IXSOG蛋白的熒光細(xì)胞顏色變成深褐色(圖2D)。制備成超薄切片后，使用電鏡觀(guān)察，可見(jiàn)表達(dá)IXSOG蛋白的細(xì)胞呈深色，而其他光鏡下無(wú)熒光的細(xì)胞顏色較淺，二者以細(xì)胞膜為界，顏色深淺區(qū)別明顯，容易辨別(圖2E)。提高放大倍數(shù)后(圖3)，可見(jiàn)深色細(xì)胞內(nèi)有多處黑色成簇聚集現(xiàn)象，說(shuō)明IXSOG蛋白能夠形成點(diǎn)狀或片狀聚集，而淺色細(xì)胞中由于沒(méi)有IXSOG蛋白的表達(dá)，因此沒(méi)有見(jiàn)到該現(xiàn)象。結(jié)果表明胞漿中合成的IXSOG轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核中形成局部聚集。我們的染色結(jié)果也提示，當(dāng)過(guò)表達(dá)的IX蛋白未能及時(shí)轉(zhuǎn)移到胞核時(shí)，也可能在胞漿中形成聚集。

3 討論

近些年，通過(guò)結(jié)合熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)，人們可以直接觀(guān)察目標(biāo)分子在細(xì)胞內(nèi)的定位及運(yùn)動(dòng)，并解析出目標(biāo)分子所在位置的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。隨著分子生物學(xué)的深入發(fā)展，利用熒光顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)同一細(xì)胞內(nèi)同一位置的分子機(jī)器進(jìn)行高精度定位和高分辨率超微結(jié)構(gòu)的研究成為了非常有力的手段，這項(xiàng)技術(shù)稱(chēng)為光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)技術(shù)[13,14]。通過(guò)熒光顯微技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行標(biāo)記定位，利用電鏡技術(shù)獲取細(xì)胞指定部位的超微結(jié)構(gòu)信息，將定位信息與結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行整合處理，從而獲得更加精確的蛋白定位信息。本研究中，我們參照文獻(xiàn)[5]，選取miniSOG蛋白作為標(biāo)簽，與腺病毒IX蛋白融合表達(dá)，miniSOG蛋白在熒光顯微鏡下能發(fā)射綠色熒光，并且該蛋白還具有光氧化的特性，因此首先通過(guò)熒光顯微鏡選取表達(dá)IXSOG蛋白的細(xì)胞，之后再對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行光氧化操作，IXSOG因催化DAB產(chǎn)生了嗜鋨顆粒，經(jīng)鋨酸固定染色后即可被電鏡解析，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白IX表達(dá)的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)。

腺病毒IX蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子活性，在病毒復(fù)制過(guò)程中參與調(diào)控病毒和細(xì)胞基因表達(dá)。作為結(jié)構(gòu)蛋白，IX蛋白錨定六鄰體結(jié)構(gòu)，起到穩(wěn)定病毒粒子的作用。免疫電鏡結(jié)果顯示，當(dāng)野生型腺病毒Ad5感染細(xì)胞或IX蛋白在細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)表達(dá)時(shí)，可在細(xì)胞核內(nèi)形成包涵體，該包涵體在病毒感染后期能夠“扣留”宿主細(xì)胞早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(promyelocytic leukaemia protein，PML)及Sp100蛋白[11]，從而有利于腺病毒的復(fù)制，除此之外，在IX形成的包涵體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞雙鏈RNA激活蛋白激酶PKR及細(xì)胞蛋白激酶CK2α的存在[15]。本研究中將IX與miniSOG融合表達(dá)，利用光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法，也在細(xì)胞核內(nèi)觀(guān)察到了IX蛋白表達(dá)形成的包涵體，表明我們建立的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法的可行性。綜上所述，我們成功建立了一種光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法，該方法可用于病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位研究。

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Study of intracellular location of adenovirus protein IX with correlative light and electron microscopy based on miniSOG

ZouXiaohui,ShaoBo,WangMin,QuJianguo,LuZhuozhuang,HongTao

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(ZouXH,ShaoB,WangM,QuJG,LuZZ,HongT);HenanChemicalTechnicianCollege,Kaifeng475000,China(ShaoB)

LuZhuozhuang,Email:luzz@ivdc.chinacdc.cn

Objective To establish a method of correlative light and electron microscopy (CLEM) to study the intracellular location of adenovirus protein IX. Methods MiniSOG (mini singlet oxygen generator) is a recently-invented genetically-encoded tag for CLEM. MiniSOG-fused adenovirus IX gene (IXSOG) was cloned by PCR, and inserted into pcDNA3 plasmid to form pTPL-IXSOG, which was used to transfect 293 cells. IXSOG expressing cells could be distinguished under fluorescence microscope due to the emission of green fluorescence of miniSOG. The transfected cells were fixed in 2.5% glutaraldehyde in situ, stained with diaminobenzidine(DAB) through the photooxidation activity of miniSOG, and used to prepare ultrathin sections. Intracellular location of IXSOG was studied by observing the sections under transmission electron microscope. Results Eukaryotic expression plasmid carrying IXSOG fusion gene was constructed. IXSOG expressing cells were selected for DAB photooxidation and preparation of ultrathin sections. IXSOG fusion mainly formed punctate aggregations or inclusions in the nucleus. Conclusions The correlative light and electron microscopy method based on miniSOG was successfully established, and it could be used to study the intracellular localization of viral proteins.

MiniSOG; Protein IX; Photooxidation; Correlative light and electron microscopy

魯茁壯，Email: luzz@ivdc.chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.002

MiniSOG；IX蛋白；光氧化；光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)技術(shù)

國(guó)家自然科學(xué)基金(31400156)；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX10004002-004)

2016-11-24)