抗H7N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶單克隆抗體的制備及初步鑒定

于悅洋 謝怡然 陳迎珠 孫穎 張恒 魯健 劉麗琦 王大燕 舒躍龍 秦堃 周劍芳

100052 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，中國國家流感中心(于悅洋、謝怡然、孫穎、張恒、魯健、劉麗琦、王大燕、舒躍龍、秦堃、周劍芳)；溫州醫(yī)科大學，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(陳迎珠)

·技術方法·

抗H7N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶單克隆抗體的制備及初步鑒定

于悅洋 謝怡然 陳迎珠 孫穎 張恒 魯健 劉麗琦 王大燕 舒躍龍 秦堃 周劍芳

100052 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，中國國家流感中心(于悅洋、謝怡然、孫穎、張恒、魯健、劉麗琦、王大燕、舒躍龍、秦堃、周劍芳)；溫州醫(yī)科大學，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(陳迎珠)

目的 制備抗H7N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)單克隆抗體，并對單抗的活性與功能進行初步鑒定。方法 利用免疫的BALB/c小鼠脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行融合，獲取雜交瘤細胞株，用間接ELISA方法篩選獲得陽性雜交瘤細胞克隆，單克隆化后制備小鼠腹水單抗，純化獲得抗H7N9亞型流感病毒NA的鼠源單克隆抗體，對抗體活性及功能進行鑒定。結果獲得特異性抗H7N9亞型流感病毒N9鼠源單克隆抗體1G8、3C4和4E8，這三株抗體識別抗原表位不同，3C4和4E8能抑制神經(jīng)氨酸酶活性，IC50分別為1.45 μg/ml和8.65 μg/ml。結論 3株單克隆抗體均特異性識別A/Anhui/1/2013(H7N9)的N9蛋白，有較好的N9結合活性或能抑制N9酶活性功能。本研究對新型H7N9禽流感病毒的診斷和防控提供了一個良好的思路。

Fund programs: Major Infectiacs Diseases Project(2014ZX10004002-001-004)

流感病毒每年暴發(fā)流行是全球關注的公共衛(wèi)生問題。2013年3月份，中國長江地區(qū)首次報道了3例人感染新型H7N9亞型禽流感病毒的病例，感染患者多數(shù)出現(xiàn)嚴重的下呼吸道癥狀，甚至導致死亡[1]。由于此病毒已廣泛流行于該區(qū)域的家禽中，人感染并致死的病例不斷出現(xiàn)[2,3]。因此，迫切需要尋求簡便、高效的病原快速診斷和治療策略。

A型流感病毒表面兩個重要的糖蛋白-血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)，對病毒的生長致病具有重要作用[4]。NA是一個四聚體結構，其單體可分為跨膜區(qū)、莖部區(qū)和頭部區(qū)[5]。NA的頭部區(qū)含有全部的抗原表位和酶活性位點，酶活性位點在不同亞型流感病毒之間相對保守[6]。酶活性部位可以催化唾液酸與半乳糖之間糖苷鍵的水解，幫助成熟的病毒顆粒脫離宿主細胞，與病毒復制有關。而NA作為體液免疫的重要病毒抗原，可誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，通過空間干擾作用抑制NA的催化活性[7]，從而抑制病毒顆粒從細胞表面釋放。靶向流感病毒表面NA蛋白的單克隆抗體具有識別特異性且能夠限制病毒侵襲宿主細胞并減少擴散，因此，對相關疾病的診斷及防控具有重大意義。

本研究通過融合SP2/0骨髓瘤細胞和N9質粒免疫后的小鼠脾細胞獲得雜交瘤細胞，利用昆蟲桿狀病毒表達的NA重組蛋白進行篩選，得到針對N9亞型神經(jīng)氨酸酶特異性單克隆抗體，并對此抗體的功能特性進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 重組病毒H6N9(以下稱為rgH6N9)、重組病毒H6N1(以下稱為rgH6N1)和重組病毒H6N2(以下稱為rgH6N2)的6個內部基因片段均由A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)提供，HA基因均來自A/Taiwan/1/2013(H6N1)，NA基因分別來自A/Anhui/1/2013(H7N9)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)以及A/Brisbane/10/2007(H3N2)，均保存于本研究室。重組N1亞型神經(jīng)氨酸酶蛋白(以下簡稱reN1)和重組N9亞型神經(jīng)氨酸酶蛋白(以下簡稱reN9)分別來自A/Brisbane/59/2007(H1N1)和A/Anhui/1/2013(H7N9)，由本實驗室在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達純化；reH9(A/HongKong/33982/2009 H9N2)蛋白購自北京義翹神州公司。質粒pVRC-Anhui/1-N9(pAH1-N9)、pVRC-Brisbane/59-N1(pBR59-N1)、pVRC-Brisbane/10-N2(pBR10-N2)的基因分別來自A/Anhui/1/2013(H7N9)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)，質粒pVRC-Hongkong/33982-N2(p33982-N2)由本實驗室保存。

8周齡雌性BALB/c小鼠用于免疫融合及腹水制備；SP2/0細胞、MDCK細胞及293T細胞由本實驗室保存；用于細胞培養(yǎng)的MEM培養(yǎng)基、DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT補料及胎牛血清均為Gibco產(chǎn)品；PNA-HRP、50% PEG及生物素氨基乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯為Sigma產(chǎn)品；轉染試劑Tubofect為Thermo Scientific產(chǎn)品；辣根過氧化物酶及FITC標記山羊抗小鼠IgG 購自中杉金橋公司。

1.2 單克隆抗體的制備及純化 初次免疫用質粒p33982-N2進行質粒免疫，100 μg/只肌肉注射8周齡雌性BALB/c小鼠；兩周后進行二次免疫，將reN9蛋白以每只小鼠40 μg的劑量與弗氏完全佐劑乳化后皮下多點免疫；二次免疫后2周第三次免疫reN9抗原，眼眥取血測試效價達到1∶10 000以上時可進行融合。融合前3 d進行沖擊免疫，沖擊所用抗原劑量為每只小鼠20 μg reN9蛋白。取免疫小鼠的脾臟制備單個脾淋巴細胞懸液，以常規(guī)方法[8]與Sp2/0骨髓瘤細胞株在50%PEG的作用下進行融合。將融合后的細胞培養(yǎng)于HAT選擇性培養(yǎng)基，融合后一周換液，換液后48 h對細胞上清進行ELISA檢測，分別以融合小鼠血清和未免疫小鼠血清作為陽性和陰性對照，篩選陽性克隆。對陽性克隆通過有限稀釋法亞克隆化，獲取單克隆的雜交瘤細胞，擴大培養(yǎng)以108細胞/只注射到小鼠腹腔，產(chǎn)生腹水后用注射器抽取收集。腹水先經(jīng)過辛酸-硫酸銨鹽析沉淀，再進行Protein G親和層析，SDS-PAGE電泳鑒定抗體純度。

1.3 單克隆抗體的功能鑒定

1.3.1 間接ELISA檢測： 用間接ELISA法測定了抗體的EC50值。以reN9蛋白2 μg/ml，每孔50 μl包被96孔酶標板，4℃過夜；用1% BSA封閉1 h后洗滌，加入不同稀釋度的抗體或雜交瘤上清，37℃孵育1 h；洗滌后加入1∶10 000稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG，置于37℃孵育1 h；TMB 100 μl/孔顯色，450 nm/630 nm處讀取吸光度值，計算每個抗體的EC50值。

1.3.2 流式細胞術檢測： 為了鑒定單抗的結合特性，用流式細胞術分別檢測了純化的單抗與轉染不同NA質粒的293T細胞，以及與感染流感病毒的MDCK細胞的結合情況。用不同亞型NA質粒轉染293T細胞(轉然后60 h后收集細胞)，并用多種亞型流感病毒感染MDCK細胞(MOI=1，感染14 h后收集細胞)；取106個轉染/感染后的細胞分別與終濃度為2 μg/ml的純化單抗37℃共同孵育1 h，PBS清洗后加入1∶200稀釋的FITC標記山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h后用流式細胞儀進行檢測，檢測數(shù)據(jù)用Flow Jo軟件進行分析。

1.3.3 NA酶活抑制實驗: 為了鑒定單抗是否具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性，用酶聯(lián)凝集素法測定抗體的IC50值。96孔酶標板以25 μg/ml、100 μl/well包被Fetuin，4℃過夜；PBST洗滌5遍，將每孔加入50 μl不同稀釋度的抗體及50 μl稀釋的病毒(取使用該方法檢測測得的90%NA酶活對應的病毒稀釋度)，混勻后置于37℃下16 h；洗滌后每孔加入1 μg/ml的HRP標記的花生凝集素(PNA-HRP)100 μl，室溫靜置2 h；洗滌后TMB顯色，450 nm/630 nm處讀取吸光度值，用曲線擬合或兩點法計算抗體的IC50。

1.3.4 競爭ELISA鑒定抗體結合部位: 選擇抗體4E8進行生物素標記，即取約1 mg抗體進行硼酸鹽緩沖液置換，置換后在每毫克抗體中加入100 μg生物素氨基乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Biotinamidohexanoic acid N-hydroxy-succinimide ester, BNHS)，室溫下混合作用4 h，洗去未結合的生物素后定量生物素標記抗體濃度，并檢測EC50，記錄此時抗體濃度。將不同稀釋倍數(shù)的未標記抗體與EC50濃度的生物素標記抗體4E8等體積混合后加入包被N9蛋白的酶標板，37℃孵育1 h；洗滌后加入HRP標記的鏈霉親和素，孵育1 h后洗滌顯色，450 nm/630 nm檢測。

2 結果

2.1 重組蛋白SDS-PAGE鑒定結果 對昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達的重組神經(jīng)氨酸酶蛋白reN1和reN9進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖1所示，單一條帶、66KD大小的 NA蛋白。

圖1 重組N1/N9蛋白SDS-PAGE鑒定結果Fig.1 SDS-PAGE result of reN9 and reN1

2.2 抗H7N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶單克隆抗體篩選及制備 通過間接ELISA方法篩選出了對reN9蛋白結合陽性的雜交瘤細胞克隆，有限稀釋后共獲得3株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1G8、3C4和4E8。判定讀值高于陰性血清對照2.1倍以上的克隆為陽性，其余為陰性，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清與不同抗原結合特異性結果如表1：

2.3 抗體結合N9活性檢測結果 用間接ELISA方法可檢測抗體對抗原的結合能力。將純化的抗體從12.5 μg/ml 開始做倍比稀釋，加入包被reN9蛋白的96孔板中，顯色后得到每孔的OD值，通過兩點法計算得出每個抗體的EC50值。間接ELISA法檢測顯示，抗體1G8、3C4及4E8的EC50值分別為0.99 μg/ml、1.08 μg/ml及0.80 μg/ml。

表1 雜交瘤細胞上清ELISA檢測結果

圖2 抗體1G8、3C4及4E8的N9蛋白結合能力Fig.2 Binding capacity to reN9 of 1G8.3、3C4 and 4E8

將轉染不同NA質粒的293T細胞，以及用重組病毒感染的MDCK細胞分別與終濃度為2 μg/ml的純化單抗共同孵育后，用流式細胞儀檢測抗體與細胞的結合情況。檢測結果如表2所示。

表2 單抗結合特異性

注：“-”表示結合率在5%以下，“+”表示結合率為5%-10%，“++”表示結合率為10%-50%，“+++”表示結合率為50%以上，M7F11為無關抗體對照

Note: “-” indicates that the binding ratio is under 5%, “+” means that the binding rate is 5% -10%, "++" means the binding ratio is 10% to 50%, and"+++" means the binding ratio is 50% or more. M7F11 is the isotype control

圖3 抗體對重組H6N9病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制能力Fig.3 Neuraminidase inhibitory effect against rgH6N9

圖4 抗體4E8與1G8和3C4的競爭ELISA結果Fig.4 Result of competitive ELISA

2.4 抗體NI功能性檢測結果 酶聯(lián)凝集素法可以定量檢測抗體對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制情況?？贵w3C4和4E8均能抑制病毒神經(jīng)氨酸活性，IC50值分別為1.45 μg/ml和8.65 μg/ml?？贵w1G8在200 μg/ml時仍不能抑制50%的神經(jīng)氨酸酶活性，與無關抗體對照M7F11相似，故判定1G8不具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性。

2.5 抗體結合表位檢測結果 用競爭ELISA法檢測3株單抗對抗原的結合部位是否相同。競爭ELISA結果顯示，抗體4E8與抗體1G8及3C4不存在競爭抑制，所以抗體4E8的抗原表位不同于抗體1G8和3C4。

3 討論

NA是A型流感病毒重要的表面功能性糖蛋白之一。當病毒侵入機體時，神經(jīng)氨酸酶一方面發(fā)揮自身酶活性，通過催化糖苷鍵水解，切割唾液酸受體幫助新生病毒從細胞表面釋放；另一方面又作為抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應答。因此，機體在自然感染或免疫刺激情況下可以產(chǎn)生針對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的特異性抗體。由于酶活性位點與抗原表位都位于神經(jīng)氨酸酶的頭部區(qū)，所以靶向抗原表位的特異性抗體可能會通過空間位阻抑制神經(jīng)氨酸酶活性。

本研究通過小鼠雜交瘤技術獲得了3株特異性靶向流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神經(jīng)氨酸酶的單克隆抗體，并對抗體的功能活性做了初步鑒定。3株抗體1B8、3C4及4E8結合N9抗原的EC50分別為0.99 μg/ml、1.08 μg/ml及0.80 μg/ml，流式細胞術檢測數(shù)據(jù)顯示3株抗體不結合Group1[9]的A/Brisbane/59/2007(H1N1)的NA以及Group2[9]中的A/Brisbane/10/2007(H3N2)的NA，表明3株抗體為N9特異性結合抗體?？贵w功能檢測數(shù)據(jù)顯示，3株抗體中3C4與4E8可抑制神經(jīng)氨酸酶活性，IC50分別為1.45 μg/ml和8.65 μg/ml。與已有報道，如Tracey M. Doyle研究[10]相比，具有相似的神經(jīng)氨酸酶抑制活性。對3株抗體結合表位的初步研究發(fā)現(xiàn)，抗體4E8不與抗體1B8及3C4存在競爭抑制，說明4E8與另外兩株抗體的結合表位不同。此外，抗體1B8無神經(jīng)氨酸酶抑制活性而抗體3C4具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性，間接說明1B8與3C4結合神經(jīng)氨酸酶的表位不同。由此得出，這3株抗體的結合表位都不相同。本課題后續(xù)將繼續(xù)探索抗體的具體結合表位及抗體在體內的保護效應，以期能夠得到抗體的具體結合表位及其體內保護作用的評估數(shù)據(jù)。

目前，對新型H7N9亞型禽流感病毒的治療策略包括對癥支持治療和應用廣譜神經(jīng)氨酸酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，H7N9對神經(jīng)氨酸酶抑制劑仍然敏感，及早應用抗病毒藥物進行預防治療，能降低病毒載量、改善臨床癥狀、提高存活率[11]，但隨著NA抑制劑耐藥突變在其他亞型(N1，N2)的廣泛出現(xiàn)，我們不能排除現(xiàn)有NA抑制劑的廣泛使用會催生耐藥突變毒株。因此，N9亞型單克隆抗體的研究能對H7N9禽流感病毒的早期診斷和防控提供支撐。

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Generation and preliminary characterization of monoclonal antibodies against neuraminidase of H7N9 subtype influenza A virus

YuYueyang,XieYiran,ChenYingzhu,SunYing,ZhangHeng,LuJian,LiuLiqi,WangDayan,ShuYuelong,QinKun,ZhouJianfang

ChineseNationalInfluenzaCenter,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China；WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China(ChenYZ).Correspondingauthor:JianfangZhou,Email:jfz@cnic.org.cn;QinKun,Email:qkv0115@163.com.

Objective To develop the monoclonal antibody (mAb) against neuraminidase of H7N9 subtype influenza A virus and identify its biological function. Methods Female 8 week-old BALB/c mice were immunized and the splenocytes of the mice were fused with Sp2/0 myeloma cells. Indirect ELISA was used to screen hybridoma and the positive clones were subject to be subcloned. Positive clones were identified and the monoclonal antibodies(mAbs) were obtained by purifying the ascetic fluid of mice injected with the hybridoma. The NA-binding as well as neuraminidase-inhibition activity of these mAbs were determined. Results Three mAbs against neuraminidase of H7N9 subtype influenza A virus, 1G8，3C4 and 4E8, were obtained. They demonstrated different epitop-recognizing. 3C4 and 4E8 exhibited neuraminidase inhibitory activity, with a IC50of 1.45 μg/ml and 8.65 μg/ml, respectively. Conclusions The results suggested that mAbs specific to neuraminidase of H7N9 subtype influenza A virus were developed, providing an useful tool in control and preventing the novel H7N9 influenza A virus.

Influenza virus; Neuraminidase; Monoclonal antibody

傳染病重大專項(2014ZX10004002-001-004)

周劍芳，Email: jfz@cnic.org.cn；秦堃，Email: qkv0115@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.014

流感病毒；神經(jīng)氨酸酶；單克隆抗體

2016-11-21)