外周血可溶性sH2a在早期診斷肝纖維化程度中的價值

王磊 金沛樺 瞿歡佳 蔣艷明 王潔 龔玲 陳公英 朱夢飛 施軍平

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)(王磊、金沛樺)；311121 杭州師范大學(xué)(瞿歡佳)；310011 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院(蔣艷明、王潔、龔玲、陳公英、朱夢飛、施軍平)

·病毒病診斷與治療·

外周血可溶性sH2a在早期診斷肝纖維化程度中的價值

王磊 金沛樺 瞿歡佳 蔣艷明 王潔 龔玲 陳公英 朱夢飛 施軍平

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)(王磊、金沛樺)；311121 杭州師范大學(xué)(瞿歡佳)；310011 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院(蔣艷明、王潔、龔玲、陳公英、朱夢飛、施軍平)

目的 研究血清肝纖維化標(biāo)志物sH2a用于診斷慢性肝病患者早期肝纖維化的臨床診斷價值及意義。方法 收集67例行肝穿刺活檢的慢性乙型肝炎、脂肪性肝病或兩者合并患者作為研究對象，通過sH2a試劑盒檢測外周血中可溶性sH2a的含量，與實驗室指標(biāo)及肝組織病理纖維化程度進(jìn)行比較，并繪制特征曲線(ROC)，計算曲線下面積(AUC)，分析其敏感性和特異性以評估該血清標(biāo)志物對早期肝纖維化的診斷價值。結(jié)果 患者血清sH2a水平與肝臟纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，且無纖維化(S0期)、早期纖維化(S1-S2期)和中晚期纖維化(S3-S4期)3組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。預(yù)測有無纖維化發(fā)生時，最佳診斷閾值為0.79，敏感性和特異性分別為63%、80%，AUC為0.772；評估有無明顯纖維化發(fā)生時，當(dāng)sH2a為0.77時，AUC為0.806，診斷靈敏度為85.7%，特異性為72.7%。結(jié)論 運用sH2a評估患者肝臟纖維化程度，可有效診斷患者肝臟早期纖維化，在區(qū)分有無明顯纖維化上診斷價值更高，為臨床診斷及治療提供可靠依據(jù)。

Fund programs: Science and Technology Planning Project of Zhejiang Province of China(2013C33187,2014C37081);Medical and Health Science Foundation of Zhejiang Province(2011KYA132); Medical and Health Science Foundation of Hangzhou(2011KYA132)

多數(shù)研究認(rèn)為肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡，導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織過度增生的結(jié)果[1]，作為各種慢性肝臟疾病的病理生理基礎(chǔ)，亦是肝硬化和肝癌的早期階段和必經(jīng)階段[2]。導(dǎo)致肝纖維化的病因種類繁多，如病毒、酒精、自身免疫、脂肪肝等，早期肝纖維化可逆，因此臨床上早期診斷肝纖維化并進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測顯得尤為重要，影響疾病的長期預(yù)后。迄今為止，肝纖維化的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是肝臟穿刺活檢，但由于其有創(chuàng)性而難以常規(guī)開展[3]，臨床上目前廣泛應(yīng)用的無創(chuàng)肝纖維化檢測方法如肝區(qū)B超、肝組織彈性檢測(FibroScan)、肝纖四聯(lián)項等用于診斷肝纖維化時特異性和靈敏度方面均還存在一定的局限[4,5]，而采用無創(chuàng)模型精準(zhǔn)診斷肝纖維化逐漸成為人們研究的熱點。去唾液酸受體蛋白可溶性H2a亞基片段(Soluble from of H2a,sH2a)是人唾液酸蛋白受體(Human asialoglycoprotein receptor, ASGPR)的一個可溶性片段，它在肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被剪切，具有肝臟特異性。本研究旨在通過檢測和比較肝纖維化不同病理分期患者外周血中sH2a水平，探討sH2a對慢性肝病患者早期肝纖維化的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2013年01月至2013年12月期間杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院行肝穿刺活檢并符合以下標(biāo)準(zhǔn)的患者共67例，其中男性49例、女性18例，平均年齡40.16±10.71歲，所有患者均簽署知情同意書，研究獲得杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過。入選的患者病種包括慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、非酒精性脂肪性肝病以及慢乙肝合并脂肪肝的患者，其中慢性乙型肝炎患者診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》[6]，非酒精性脂肪性肝病患者診斷符合《非酒精性脂肪性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]。同時排除①其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、藥(毒)物性肝損傷、代謝性及遺傳性肝病、晚期肝硬化有失代償表現(xiàn)及肝臟腫瘤者；②合并人類免疫缺陷病毒、EB病毒等其他病毒感染者；③合并風(fēng)濕免疫性疾病、代謝性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、甲亢等；④合并有嚴(yán)重的心肺腎疾病，不能耐受肝穿刺術(shù)或有禁忌癥者；⑤妊娠或哺乳期婦女。

1.2 資料收集 通過病史詢問及人體學(xué)測量記錄患者性別、年齡、病程、飲酒史、身高、體重，并計算體質(zhì)指數(shù)(BMI)=體質(zhì)量(kg)/身高(m2)。

1.3 實驗室指標(biāo) 所有納入患者于肝穿刺術(shù)前1 d或當(dāng)天清晨空腹采血送檢，分離血清，-80℃冰箱保存，采用全自動生化分析儀(杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科)檢測以下相關(guān)指標(biāo)：血清白蛋白(ALB)、血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、血小板(PLT)。

1.4 肝組織穿刺活檢 所有入選患者均在簽署知情同意書后采用B超定位下局部麻醉經(jīng)皮肝穿刺活檢術(shù)，采用16G巴德一次性活檢針(美國Bard公司)1 s快速穿刺活檢術(shù)獲取約0.8-1.0 cm長肝組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成連續(xù)切片，由同一位有經(jīng)驗的病理醫(yī)生進(jìn)行閱片，肝臟纖維化分期(S0-S4)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2000 年《病毒性肝炎防治指南》[8]。

1.5 血清肝纖維化標(biāo)志物SH2a檢測 本課題組和蘇州和銳公司合作，采用納米抗體制備技術(shù)，獲得與B9抗體配對的單抗，構(gòu)建較為穩(wěn)定的雙抗夾心ELISA方法，用于檢測本項目外周血可溶性SH2a含量。

2 結(jié)果

2.1 3組患者基線特征及肝纖維化分期概況 根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入67例患者，其中男性49例、女性18例，年齡22-62歲，平均40.16±10.71歲。在肝纖維化分期上，根據(jù)病理學(xué)診斷分為3組：纖維化0期歸為正常組，有6例(9.0%)；纖維化Ⅰ期和2期劃分為早期肝纖維化組，以S1-S2期為主，共53例，約占79.1%；3期和4期患者劃分為肝纖維化中晚期組，共8例(11.9%)；3組患者年齡、性別和體質(zhì)指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組患者基線特征比較

2．2 肝纖維化不同分期患者相關(guān)實驗室指標(biāo)比較S0期和S1-S2期患者實驗室檢測指標(biāo)與 S3-S4期患者相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表2。

表2 肝纖維化不同分期患者相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)比較

2.3 血清sH2a水平與肝纖維化程度的相關(guān)性 S0期、S1-S2期患者血清sH2a含量均低于S3-S4期患者，且3組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025<0.05)，Spearman等級相關(guān)性分析顯示，sH2a值與肝臟病理纖維化分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.347，P=0.006<0.05)，見表3。

表3 肝纖維化不同分期sH2a水平比較

2.4 血清sH2a用于評估早期肝纖維化的準(zhǔn)確性和價值 以S0期為陰性，S1-S4期為陽性標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)判有無肝纖維化發(fā)生的準(zhǔn)確性，繪制 ROC 曲線；以S0-S2為陰性，高于S2為陽性標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)判有無明顯肝纖維化的準(zhǔn)確性，繪制S0-S2期與S3-S4期sH2a的ROC曲線，計算曲線下面積(AUC)并進(jìn)行分析見圖1，具體數(shù)據(jù)見表4。

圖1 預(yù)測有無纖維化指數(shù)的ROC曲線Fig.1 ROC curve on forecast of fibrosis having or not

組別Group最佳診斷閾值Cut-off敏感度(%)Sensitivity(%)特異性(%)Specificity(%)曲線下面積AUCPROC-10.7963.080.00.7720.048ROC-20.7785.772.70.8060.009

注：AUC=0.5時,無診斷價值；0.5

Note: AUC=0.5, no diagnostic value; 0.50.9 high accuracy

3 討論

肝纖維化是疾病發(fā)展成為肝硬化的中間階段。多種類型的慢性肝病均可以發(fā)展為肝纖維化[2]，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，1.85億人感染丙肝[9-11]，相當(dāng)數(shù)量的上述肝病患者最終發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康。肝纖維化病因十分復(fù)雜，目前研究認(rèn)為肝細(xì)胞持續(xù)受到外界因素的損傷，隨即釋放炎癥因子激活肝星狀細(xì)胞，并使其分化為分泌細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞和降解外界損傷的金屬蛋白酶，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和降解的成分沉積，加重肝纖維化，并逐漸導(dǎo)致肝硬化[12]。

肝纖維化病理上分為S1-S4期，S1-S2期肝纖維化可逆，多數(shù)患者確診為肝纖維化時已經(jīng)處于中晚期，早期診斷肝纖維化顯得尤為重要。迄今為止，最可靠、最準(zhǔn)確的診斷方法是肝穿刺活檢，但由于其有創(chuàng)性、重復(fù)性低、價格昂貴等因素而受到諸多限制。目前臨床上無創(chuàng)診斷肝纖維化的方法主要包括血清學(xué)指標(biāo)和影像學(xué)檢查兩大類[13]。肝區(qū)B超為定性診斷，精度差，對診斷早期肝纖維化缺乏靈敏度；FibroScan是對肝組織彈性的量化分析，但對S1-S2期缺乏特異性，肥胖、腹水以及肝組織脂肪沉積時影響結(jié)果判斷[14]。常用的肝纖四聯(lián)項是一組血清蛋白指標(biāo)，均屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或它們的降解產(chǎn)物，但主要問題是非肝臟特異性，肝外部位炎癥活動可降低其清除率[15]，特異性和靈敏度均不理想。開發(fā)無創(chuàng)、高特異性和高靈敏度的早期肝纖維化診斷產(chǎn)品仍是臨床上待解決的問題，對指導(dǎo)臨床對肝纖維化的篩查、治療療效的監(jiān)測及預(yù)后的評估有重要意義。

人唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor，ASGPR) 在體內(nèi)僅在肝細(xì)胞中表達(dá)且負(fù)責(zé)唾液酸糖蛋白從血漿中清除，ASGPR由兩個相關(guān)的氨基酸序列亞基H1(46KD)和H2(50KD)組成，H2a和H2b為ASGPR的H2亞基兩個可變剪接體。研究顯示，H2a在緊鄰五肽處裂解為35 KD的片段，包括完整的胞外域，為分泌性的，組成受體的可溶形式(sH2a)。sH2a是一種僅在肝細(xì)胞表達(dá)的分泌型蛋白，分子量35 KD，在肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中從45 KD的前體蛋白中剪切成35 KD的sH2a分泌到外周血中，是肝臟代謝的特異性標(biāo)志物[16]。2004年以色列科學(xué)家發(fā)現(xiàn)該可溶性片段在正常人血清中含量穩(wěn)定，但在丙肝引起的肝纖維化患者血清中sH2a的水平顯著下降,并影響肝細(xì)胞功能[17]。

本研究分析杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院67例肝穿患者的血清sH2a水平與肝臟病理纖維化分期的相關(guān)性及診斷價值。本研究檢測了血清總膽紅素、堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血小板等反應(yīng)肝損害的相關(guān)實驗室指標(biāo)，3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在纖維化發(fā)生的早期，肝臟細(xì)胞處于修復(fù)代償階段，多數(shù)肝損傷標(biāo)志物如肝酶指標(biāo)尚維持在正常范圍，無法發(fā)現(xiàn)早期的肝纖維化。研究結(jié)果顯示，尚未發(fā)生纖維化的患者sH2a水平高于纖維化早期的患者，而纖維化早期患者的sH2a又明顯高于中晚期纖維化組的患者，表明sH2a隨著肝臟纖維化程度的不同也發(fā)生著動態(tài)變化，通過相關(guān)性分析得出與肝纖維化程度成負(fù)相關(guān)，隨著慢性肝炎病程的進(jìn)展而逐漸降低，尤其在晚期肝纖維化和肝硬化時降低最為顯著，與其他各組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)；ROC曲線分析結(jié)果顯示，預(yù)測有無肝纖維化發(fā)生時，最佳診斷閾值為0.79，此時的敏感性為63.0%、特異性達(dá)80%、AUC0.772(大于0.7)，診斷價值準(zhǔn)確度中等；預(yù)測明顯肝纖維化的發(fā)生時，最佳診斷閾值0.77、敏感性和特異性分別為85.7%和27.3%、AUC0.806(大于0.8)，診斷準(zhǔn)確度佳。也就是說，當(dāng)sH2a水平高于0.79時，可使72.7%的無或輕度肝纖維化患者避免“肝組織活檢”，當(dāng)界定值小于0.77時，可以診斷85.7%的患者顯著性肝纖維化。因此，我們認(rèn)為sH2a作為判斷肝纖維化程度的指標(biāo)，在肝纖維化早期sH2a即下降具有較好的靈敏度和特異性。

這是一個仍需要進(jìn)一步研究的課題，本研究樣本量有限，且纖維化分期為0期的及大于Ⅱ期的患者比例較低，在區(qū)別各個纖維化分期方面缺乏準(zhǔn)確性，在今后的研究中應(yīng)繼續(xù)盡可能的擴(kuò)大樣本量。另外，無論是哪種類型的慢性肝病，都存在一定的個體差異，如年齡、肥胖、飲酒、HBV感染等因素，sH2a受不同因素影響是否會發(fā)生改變，如何改變等問題目前尚不清楚，sH2a具有肝臟特異性，但我們并不確定其在外周血的含量是否受其他疾病的影響，如腎臟疾病等，還應(yīng)考慮指標(biāo)對炎癥活動度的反映，因為炎癥始終是纖維化形成的重要因素，需要在今后的工作中累積更多的資料。

綜上所述，sH2a與肝纖維化程度有良好的相關(guān)性，具有重復(fù)性強、簡便等優(yōu)點，可以診斷部分顯著肝纖維化和進(jìn)展性肝纖維化、肝硬化的排除，為各種肝病患者判斷肝纖維化臨床治療效果提供可靠的指標(biāo)，也為監(jiān)測病情變化和評估藥物療效提供良好的動態(tài)觀察指標(biāo)，以達(dá)到代替或減少有創(chuàng)性肝活檢的目的，值得廣泛應(yīng)用。

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The clinical diagnosis value and significance of serum sH2a level on early hepatic fibrosis degree

WangLei,JinPeihua,QuHuanjia,JiangYanming,WangJie,GongLing,ChenGongying,ZhuMengfei,ShiJunping

ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China(WangL，JinPH);HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310053,China(QuHJ);TheAffiliatedHospitalofHangzhouNormalUniversity,Hangzhou310053,China(JiangYM,WangJ,GongL,ChenGY,ZhuMF,ShiJP)Correspondingauthor:ShiJunping,Email:1395712119@vip.126.com

Objective We aimed, in our prospective study, to assess the predictive value of serum non-invasive and biochemical markers for clinical diagnosis of significant fibrosis (including early stages). Methods We measured sH2a levels in serum, comparing with routine liver function markers. We compared blindly pretreatment serum samples from a cohort of hepatitis B patients without non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD), which had histological grades of liver fibrosis, with NAFLD individuals and CHB with NAFLD patients. Statistical analysis was by Student′s t test, and receiver-operating characteristic (ROC) curves were drawn. Results ROC curves showed that serum sH2a had greater diagnostic performance than routine liver function markers compared with histological grades of liver fibrosis(S0,S1-2,S3-4). ROC curves showed that using a sH2a cut-off point of 0.79 was with highest sensitivity as 63% and highest specificity as 80%. And sensitivity as 96.7% and specificity as 75.5% when using a sH2a cut-off point of 0.77. Conclusions sH2a has the potential to be a uniquely sensitive and specific novel marker for liver fibrosis and function.

hepatitis cirrhosis;sH2a;serum level;liver tissue pathology

浙江省科技計劃項目(2013C33187, 2014C37081)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2011KYA132)；杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃重大項目(2015ZD02)

施軍平，Email:13957121199@vip.126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.012

肝纖維化；sH2a；肝病；血清學(xué)；肝組織病理

2016-05-03)