1株與手足口病病原混合感染的札如病毒全基因組序列測定與分析

王春花 黃威 周帥鋒 于盼輝 段素霞 張益 高立冬 馬學軍

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(王春花、張益、馬學軍)；410005 長沙，湖南省疾病預防控制中心(黃威、周帥鋒、高立冬)；050017 石家莊，河北醫(yī)科大學(于盼輝、段素霞)

·論著·

1株與手足口病病原混合感染的札如病毒全基因組序列測定與分析

王春花 黃威 周帥鋒 于盼輝 段素霞 張益 高立冬 馬學軍

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(王春花、張益、馬學軍)；410005 長沙，湖南省疾病預防控制中心(黃威、周帥鋒、高立冬)；050017 石家莊，河北醫(yī)科大學(于盼輝、段素霞)

王春花、黃威為共同第一作者

目的 了解手足口病樣本中除腸道病毒外的其他病毒病原，并分析其分子特征與基因類型。方法 采用宏基因組學結合生物信息學的方法對1例手足口病患兒樣本進行深度測序分析。結果 該病例為腸道病毒71型與札如病毒混合感染。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)驗證樣本中札如病毒核酸為陽性，經(jīng)組裝拼接獲得全基因組序列為7 429 bp，含有3個開放閱讀框。序列進化分析表明，該株病毒與浙江株Hu/G1/Zhejiang1/China/2014的同源性最高為99.4%，屬于札如病毒GI基因型，是當前我國主要的感染型。結論 利用深度測序方法鑒定出手足口病樣本混合感染病原為札如病毒，序列分析表明其為我國流行的優(yōu)勢毒株。該研究為今后我國手足口病和腹瀉相關疾病的病原檢測提供了參考依據(jù),為了解我國札如病毒感染的分子特征提供了序列參考。

Fund programs: National Key Research and Development Plan (2016TFC1202700, 2016YFC120090)

札如病毒(Sapovirus, SaV)屬于杯狀病毒科的成員，與諾如病毒(Norovirus, NoV)一樣，是非細菌性急性胃腸炎的主要病原體之一，可引起不同年齡段的人群發(fā)生腹瀉，特別是5歲以下的兒童[1]。與諾如病毒相比，札如病毒引發(fā)的感染沒有諾如病毒嚴重，暴發(fā)也不如諾如病毒常見，陽性率也比諾如病毒低，故以往有關札如病毒的報道和相關研究較少。另外，札如病毒可與其他病毒發(fā)生混合感染，如輪狀病毒、星狀病毒等腸道病毒[2-5]。

札如病毒基因組為單股正鏈RNA，基因組核酸序列全長約7.3-7.5 Kb，含有3個開放閱讀框(Open Reading Frames, ORF)：ORF1、ORF2與ORF3，其中ORF1編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)和衣殼蛋白VP1。根據(jù)這兩個蛋白區(qū)的基因序列多樣性可將札如病毒分為GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GV 5個遺傳組[6]。其中GⅠ和GⅤ組又可進一步分為8個和5個基因型[7]。近年來由札如病毒感染而引起的疫情在不斷增加，研究發(fā)現(xiàn)該病毒感染在全球范圍內(nèi)分布較廣，并且涵蓋多種基因型[8-12]。因此，對札如病毒進行序列分析和基因型別鑒定，可為了解我國人群中札如病毒的流行趨勢與病毒感染情況和監(jiān)測病毒變異具有重要意義。本研究對1株與手足口病病原混合感染的札如病毒進行了全基因組序列的測定與分析，并對其病毒核酸進行了分子驗證。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理 2015年11月份在湖南省某醫(yī)院收集一名臨床診斷為輕癥手足口病的住院患兒糞便約10 g，立即冷凍至-20℃，然后低溫運送至實驗室待檢測。在生物安全柜中取出黃豆粒大小糞便溶于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，經(jīng)超聲和離心后制備成20%的糞便懸液，分裝成200 μl/管，保存于-80℃。

1.2 核酸酶消化與病毒核酸提取 取200 μl便懸液進行超速離心(32 000 r/min，3 h)，富集糞便樣本中的病毒。用100 μl PBS重懸沉淀，加入核酸酶cocktail，37℃孵育90 min。核酸酶cocktail包含10U TURBOTMDNase (Ambion), 25U Benzonase? nuclease (Sigma), 5U DNase I (TaKaRa), 2 μg RNase A (TaKaRa), 5U RNase T1 (Thermo Scientic), 4 U RNase One (Promega), 4 U Micrococcal nuclease (New England Biolabs)和15 U Mung Bean nuclease (Promega)。然后根據(jù)Qiaamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)提供的實驗操作步驟提取樣本總RNA，分裝后保存于-80℃。1.3 cDNA文庫構建 將以上獲得的總RNA利用SuperScript? Ⅲ Reverse Transcriptase kit (Invitrogen)聯(lián)合半隨機引物GGCAGGACCTCTGATACAGGNNNNNN，合成第一鏈cDNA。然后按文獻[12]中的方法依次進行第二鏈cDNA合成和PCR擴增。

1.4 深度測序 純化后的PCR產(chǎn)物以100 ng input按Ion Plus Fragment Library kit (Life Technologies)說明書構建測序文庫，主要步驟為末端修復、接頭連接、E-Gel片段篩選和qPCR定量。最后以26 pM文庫進行油包水擴增、ES富集和Ion Torrent PGM測序儀測序。

1.5 深度測序數(shù)據(jù)分析 采用本實驗室自主研發(fā)的病毒鑒定流程(Virus Identification Pipeline, VIP)[13]分析深度測序數(shù)據(jù)。使用CLC Genomic Workbench 9.0進行病毒序列拼接。

1.6 札如病毒的驗證 按One-Step RT-PCR kit(Qiagen)說明書，用札如病毒特異性引物(SaV-F, 5′-CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT-3′,SaV-R, 5′-CGGRCYTCAAAVSTACCBCCCCA-3′)[14]檢測樣本核酸。

1.7 系統(tǒng)進化分析 從GenBank下載目前已有的札如病毒全基因組序列或參考株的基因序列，進行多序列比對分析。采用MEGA5.0軟件[15]和鄰接法(Neighbor-Joining)進行系統(tǒng)進化分析，并用Bootstrap重復抽樣1 000次對進化樹進行驗證。

2 結果

2.1 深度測序數(shù)據(jù)概述 經(jīng)去除多克隆和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，本研究共獲得66 266條reads,平均測序讀長為151 bp。經(jīng)VIP分析，結果顯示病毒相關reads所占比例為29.5%。部分序列匹配到了腸道病毒71型和札如病毒且平均覆蓋度為99.9%和100%(圖1)，提示樣本中存在腸道病毒71型和札如病毒核酸，該手足口病患兒可能為腸道病毒71型和札如病毒混合感染。

圖1 腸道病毒71型與札如病毒的基因組覆蓋度和測序深度分析Fig.1 Viral genome coverage and sequencing depth analysis for enterovirus A71 and sapovirus

2.2 RT-PCR驗證 用札如病毒特異性引物對樣本核酸進行RT-PCR檢測，瓊脂糖電泳擴增產(chǎn)物，結果顯示樣本核酸泳道有434 bp的目標條帶。將該產(chǎn)物送公司進行Sanger法測序，序列分析表明該樣本為札如病毒陽性。

圖2 札如病毒VP1基因(A)和全基因組(B)核苷酸序列的遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the nucleotide sequence in VP 1 gene (A) and complete genome (B) of sapovirus.

2.3 札如病毒核酸序列分析 將深度測序數(shù)據(jù)進行組裝拼接，獲得札如病毒全基因組序列，命名為SapovirusHu/GI/Hunan/China/2016，并將其全長序列采用Sequin完成序列注釋和生成測序提交文件后上傳GenBank，獲得序列登錄號為KX980412。全基因組序列分析表明：該株病毒基因組全長7 429 bp，包含3個ORF，其中ORF1編碼VP1蛋白。GC含量為50.81%，各堿基比例為：A(25.6%)、C(25.7%)、G(25.1%)、T(23.6%)。經(jīng)與GenBank中現(xiàn)有的札如病毒全基因組序列進行多序列比對分析，結果顯示Sapovirus Hu/GI/Hunan/China/2016與GenBank中唯一的中國人源札如病毒Hu/G1/Zhejiang1/China/2014(KT327081)的同源性最高，核苷酸序列一致性為99.4%，氨基酸序列一致性為99.5%。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析 從GenBank中下載札如病毒VP1基因的代表性序列和札如病毒全基因組的代表性序列，與本研究獲得的病毒株相關序列進行多序列比對分析，構建系統(tǒng)進化樹。如圖2所示，基于VP1基因(1 686 bp)和基于全基因組序列構建的進化樹，Sapovirus Hu/GI/Hunan/China/2016與其他代表株聚集為GI-GV 5個分支，并且均與Hu/G1/Zhejiang1/China/2014(KT327081)處于同一個遺傳進化分支，表明該株病毒與Hu/G1/Zhejiang1/China/2014(KT327081)距離最近，同屬于GI基因型。

3 討論

本研究采用宏基因組學方法對一例手足口病輕癥患者的糞便樣本進行了深度測序分析，結果表明該患者為腸道病毒71型與札如病毒混合感染。自1976年首次在日本扎幌市的一次暴發(fā)性腹瀉中發(fā)現(xiàn)該病毒以來，札如病毒與其他病毒混合感染的情況在世界范圍內(nèi)較為常見。我國在札如病毒陽性樣本中檢測到了輪狀病毒和星狀病毒，混合感染率為20%。王顏歌等[16]在札如病毒陽性樣本中分別檢測到了輪狀病毒、星狀病毒和諾如病毒，構成比為18.75%。Wang等[17]在日本急性腸胃炎嬰兒和兒童的糞便樣本中也檢測到了札如病毒與輪狀病毒的混合感染，混合感染率為11.76%。近期有研究報道，札如病毒與諾如病毒的不同型別存在雙重感染或三重感染，并且此類混合感染主要為海鮮類食源性引發(fā)[18-20]。據(jù)我們所知，目前已報道的混合感染均來自于急性腸胃炎病例，并且均為札如病毒與腹瀉相關病毒共感染的現(xiàn)象。本研究首次在手足口病病例中發(fā)現(xiàn)了手足口病病原與札如病毒共感染的情況，為以后手足口病和腹瀉相關疾病的病原檢測提供了參考依據(jù)。

本研究還對混合感染的札如病毒序列進行了組裝和拼接，獲得了7 429 bp全長基因組序列。并將該基因組序列與GenBank中現(xiàn)存的參考株全序進行了多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。結果顯示，無論核苷酸序列還是氨基酸序列，Hu/GI/Hunan/China/2016與札如病毒浙江株[21]的同源性最高；無論是基于VP1基因序列還是基于基因組全長序列構建的進化樹，Hu/GI/Hunan/China/2016與札如病毒浙江株均位于相同的進化分支。序列分析與進化樹均表明Hu/GI/Hunan/China/2016為札如病毒GI型，與國內(nèi)多個地區(qū)流行的型別相同。我國深圳、海南、廣西、吉林、上海、陜西、浙江等地，札如病毒GI型是流行的優(yōu)勢毒株[4,16,20]。除GI型外，深圳等地區(qū)還報道了札如病毒GII型、GIV型。可見，札如病毒的流行具有多樣性。因此，本研究對札如病毒的序列進行分析和型別鑒定對該病毒的診斷、監(jiān)測和防控具有重要意義。

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Complete genome analysis of a sapovirus in a mixed infected patient of hand foot and mouth disease

WangChunhua,HuangWei,ZhouShuaifeng,YuPanhui,DuanSuxia,ZhangYi,GaoLidong,MaXuejue

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(WangCH,ZhangY,MaXJ);HunanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410005,China(HuangW,ZhouSF,GaoLD);HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China(YuPH,DuanSX)WangChunhuaandHuangWeiarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

MaXuejun,Email:maxj@ivdc.chinacdc.cn;GaoLidong,Email: 810173358@qq.com

Objective To understand the potential viral pathogens other than enteroviruses existing in samples of hand foot and mouth disease (HFMD) patient and study their molecular feature and genotype. Methods The deep sequencing analysis of a fecal specimen collected from HFMD patient was conducted by metagenomics and bioinformatics. Results Enterovirus A71 and sapovirus mixed infection was found in this case. The nucleic acid of sapovirus was confirmed positive by RT-PCR and the 7 429 bp complete genome sequence of sapovirus was obtained by assembling sequencing reads which consisted of 3 open reading frames. Phylogenetic analysis revealed that this strain of virus should belong to the genotype 1 of sapovirus having a homology of 99.4% with sapovirus Hu/G1/Zhejiang1/China/2014 strain, which is a currently predominant genotype circulating in China. Conclusions The sapovirus, which is a predominant strain circulating in China, was a mixed infected causative agent existing in HFMD sample identified by deep sequencing. This study will serve as a reference for pathogen detection of HFMD and diarrheal related diseases, as well as provide a sequence reference for molecular feature study of sapovirus in China in the future.

Sapovirus; Deep sequencing; Complete genome sequence; Phylogenetic analysis

國家重點研發(fā)計劃(2016TFC1202700，2016YFC1200900)

馬學軍，Email: maxj@ivdc.chinacdc.cn；高立冬，Email: 810173358@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.011

札如病毒；深度測序；全基因組序列；進化分析

2016-05-11)