肥胖伴牙周感染小鼠體內(nèi)B- 1a細(xì)胞的表達(dá)初探

王軼雄 余挺 謝寶儀 軒東英 章錦才

B- 1a細(xì)胞能夠分泌抵御病原體入侵的多反應(yīng)性低親和力抗體[1-2]，還可以在不受外界刺激的情況下分泌IL- 10、IL- 3等免疫調(diào)節(jié)分子[3-5]，這些抗體和分子可以在動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫病等炎癥疾病的免疫機(jī)制中發(fā)揮作用。但是尚未有學(xué)者對肥胖機(jī)體內(nèi)是否存在B- 1a細(xì)胞和其發(fā)揮的機(jī)制做過相關(guān)研究。

牙周炎能夠造成牙齒周圍組織破壞[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，牙周炎病損部位有大量B- 1a細(xì)胞浸潤[7-8]，并在受損的牙齦組織中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了B- 1a細(xì)胞分泌的抗Col- Ⅰ抗體[9-11]。本研究建立肥胖伴牙周感染小鼠模型，應(yīng)用免疫組化染色、實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)印跡3 種方法對頜骨與脾臟[12]內(nèi)的B- 1a細(xì)胞膜表面特異性蛋白CD5[13]，及其分泌的抗Col- Ⅰ抗體和IL- 10炎癥因子的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，從牙周局部到機(jī)體臟器，初步探究肥胖與牙周炎、B- 1a細(xì)胞三者之間的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

6 周齡雄性C57BL/6J小鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；60%高脂飼料和10%低脂飼料；Real time PCR儀(Mx3000P,Agilent公司,美國)；SDS- PAGE垂直電泳槽(北京凱元伯樂生物科技有限公司)；Image Pro Plus 數(shù)字化拍攝系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驼T導(dǎo)

24 只小鼠隨機(jī)分成2 組，每組12 只。一組喂高脂飼料，為肥胖組(high fat diet，HF)，另一組喂低脂飼料，為標(biāo)準(zhǔn)組(low fat diet，LF)，飼料誘導(dǎo)30 周后[16]，從HF組和LF組中隨機(jī)抽取6 只做牙周真性結(jié)扎處理(牙周炎組，periodontitis，P)，每組剩余的6 只做假性結(jié)扎處理(對照組，control，C)，結(jié)扎處理5 d[17]，隨即產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)伴牙周假性結(jié)扎組(LFC組)、標(biāo)準(zhǔn)伴牙周真性結(jié)扎組(LFP組)、肥胖伴牙周假性結(jié)扎組(HFC組)、肥胖伴牙周真性結(jié)扎組(HFP組)。無菌條件下將上述4組小鼠的脾臟取出，并將其上頜骨分離。

1.3 頜骨免疫組化染色定量分析

對頜骨進(jìn)行組織處理，抗原熱修復(fù)后用30 ml/L過氧化氫避光孵育25 min，PBS 5 min×3 次，山羊血清工作液封閉30 min后分別加入IL- 10(小鼠一抗1∶200)(Abcam公司)、CD5(大鼠抗1∶100)(NOVAS公司)、抗Col- Ⅰ抗體(兔抗1∶100)(Abcam公司)4 ℃冰箱過夜；孵二抗(DAKO公司)；顯微鏡下DAB顯色，復(fù)染胞核，10%鹽酸乙醇分化后透明、脫水、樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。用圖像處理系統(tǒng)(Image- Pro Plus 6.0)分析圖片凈光密度值。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR基因水平檢測

將組織在液氮中研磨后加入Trizol試劑提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物序列見表 1。取1.0 μl的cDNA在20 μl的反應(yīng)體系中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。用甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，通過2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct-Ctβ-肌動(dòng)蛋白，△△Ct=△Ct缺氧-△Ct對照，Ct為循環(huán)次數(shù))方法檢測各基因相對表達(dá)量。每個(gè)樣品均設(shè)定5 個(gè)平行復(fù)孔，取平均值。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法蛋白定量分析

將脾臟組織剪碎，加入裂解液提取總蛋白。經(jīng)SDS- PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜。胎牛血清封閉1 h，分別加入IL- 10(小鼠一抗1∶500)、CD5(大鼠抗1∶500)、抗Col- Ⅰ抗體(兔抗1∶20 000)，4 ℃孵育過夜，分別加入相同的二抗(山羊抗兔IgG 1∶20 000)，搖床室溫下1 h，PVDF膜后膠片顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Image- Pro Plus 6.0)分析條帶凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表 1 實(shí)時(shí)定量PCR目的基因引物序列及長度

2 結(jié) 果

2.1 肥胖和牙周炎對頜骨中B- 1a細(xì)胞的標(biāo)記

CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10少量表達(dá)于LFC和HFC組的牙齦結(jié)締組織與上皮，但在LFP與HFP組中大量表達(dá)。P組中的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體表達(dá)量顯著高于C組(P<0.001)。

P組中LF組的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體表達(dá)量未顯著高于HF組(P>0.05)(圖 1～2)。

2.2 頜骨中CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10的mRNA表達(dá)

P組中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的mRNA表達(dá)量顯著高于C組(P<0.001)。

P組中LF組的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的mRNA表達(dá)量未顯著高于HF組(P>0.05)(圖 3)。

2.3 肥胖和牙周炎對脾臟中B- 1a細(xì)胞的標(biāo)記

HF組中CD5表達(dá)量顯著高于LF組(P<0.001)；IL- 10表達(dá)量顯著高于LF組(P=0.002)。

抗Col- Ⅰ抗體表達(dá)分析顯示：在HF組中P組與C組之間的蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但在LF組中P組蛋白表達(dá)量顯著高于C組(P<0.05)；在P組中HF組與LF組之間的蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但在C組中HF組蛋白表達(dá)量顯著高于LF組(P<0.05)(圖 4～5)。

2.4 脾臟中3 種蛋白表達(dá)量與體重間的相關(guān)性分析

CD5蛋白與體重之間呈顯著正相關(guān)性(r=0.68,P<0.001)；抗Col- Ⅰ抗體與體重之間呈顯著正相關(guān)性(r=0.43,P=0.037)；IL- 10與體重之間的相關(guān)性不顯著(r=0.38,P=0.071)。

圖 1 4 組頜骨中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的免疫組化染色結(jié)果

圖 2 4 組頜骨中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的蛋白表達(dá)水平

圖 3 4 組頜骨中CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10的mRNA表達(dá)水平

圖 4 4 組脾臟中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的蛋白印跡 圖 5 4 組脾臟中CD5、抗Col- Ⅰ抗體、IL- 10的蛋白表達(dá)水平

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P組中CD5與抗Col- Ⅰ抗體的蛋白表達(dá)量和相關(guān)mRNA水平均顯著高于C組(P<0.001)。這與前期報(bào)道類似[8-9]。雖然之前對2 種蛋白進(jìn)行過研究，但是研究均為獨(dú)立的，未曾闡明二者關(guān)系。Koutouzis結(jié)合B- 1a細(xì)胞大量出現(xiàn)在自身免疫患者體內(nèi)和在牙周病損局部表達(dá)顯著升高這一事實(shí)，認(rèn)為牙周炎與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病之間有著類似的病理機(jī)制，推測B- 1a細(xì)胞是牙周炎局部天然抗體(抗Col- Ⅰ抗體)的分泌細(xì)胞[13]。Sugawara[11]發(fā)現(xiàn)牙周袋底部和中部的牙齦結(jié)締組織中浸潤大量的B- 1a細(xì)胞，同時(shí)在相應(yīng)位點(diǎn)的齦溝液中還發(fā)現(xiàn)高濃度的抗Col- Ⅰ抗體。本研究雖未對小鼠的齦溝液進(jìn)行分析(鑒于提取困難)，但通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)牙齦結(jié)締組織的中下部，浸潤著表達(dá)量近似的B- 1a細(xì)胞和抗Col- Ⅰ抗體。在動(dòng)物模型上的這一發(fā)現(xiàn)，使得B- 1a細(xì)胞與抗Col- Ⅰ抗體之間的關(guān)系更清晰明了。

Aramaki[14]表示B- 1a細(xì)胞分泌的膠原抗體在牙周炎癥局部依舊發(fā)揮著對抗細(xì)菌和其分泌的內(nèi)毒素的作用。本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色中還發(fā)現(xiàn)B- 1a細(xì)胞除了在牙齦結(jié)締組織中浸潤，上皮內(nèi)也有表達(dá)，說明B- 1a細(xì)胞阻擋了致病菌初期對牙周組織的破壞，從表達(dá)位置的特殊性印證了Aramaki的觀點(diǎn)。從HFC組中的相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)量均高于LFC組中得出，單純肥胖機(jī)體的炎癥狀態(tài)在牙周局部有所體現(xiàn)，并促使B- 1a細(xì)胞的增殖。但LFP組中的相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)量均高于HFP組，說明肥胖對牙周局部炎癥產(chǎn)生免疫抑制。Amar[15]曾對此提出免疫耐受理論，認(rèn)為肥胖環(huán)境下的牙周炎癥刺激可致使免疫細(xì)胞處于抑制狀態(tài)。此理論雖然針對單核/巨噬細(xì)胞提出，但B- 1a細(xì)胞與其同為固有免疫，所以免疫耐受理論對這一現(xiàn)象解釋更為合理。

本研究對肥胖小鼠脾臟中的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體進(jìn)行定量檢測后發(fā)現(xiàn)3 種蛋白在肥胖機(jī)體內(nèi)均有不同程度的表達(dá)，HF組中CD5和IL- 10表達(dá)量顯著高于LF組(P<0.05)，并且CD5與抗Col- Ⅰ抗體的表達(dá)量隨著小鼠體重的增加而不斷上調(diào)。這不僅說明B- 1a細(xì)胞參與了脂肪組織引發(fā)的免疫炎癥過程，而且在炎癥狀態(tài)中發(fā)揮了一定的免疫機(jī)制。肥胖環(huán)境下牙周感染對脾臟中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗體的表達(dá)變化沒有起到顯著性影響。應(yīng)該是小鼠5天的牙周急性感染相對于人體牙周炎的慢性發(fā)病在病理機(jī)制上表現(xiàn)的不同所致。

綜上所述，肥胖機(jī)體內(nèi)與牙周炎局部均存在B- 1a細(xì)胞并顯著表達(dá)，但并未發(fā)現(xiàn)這兩種炎癥狀態(tài)之間存在顯著性影響，還需對B- 1a細(xì)胞在牙周炎與肥胖病理機(jī)制中的作用進(jìn)行深入探索。