草石蠶外植體消毒方法及不定芽增殖培養(yǎng)基研究

孟祥玉+張素勤+耿廣東+熊婭

摘要：以草石蠶莖尖和葉片為外植體，研究了草石蠶（Stachys sieboldii Miq.）無菌系建立的方法和不定芽增殖適宜的培養(yǎng)基配方，為草石蠶組織培養(yǎng)快速繁殖和脫病苗培育奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，NaClO溶液比HgCl2溶液消毒效果好；莖尖和葉片在NaClO溶液中適宜的消毒時間分別為10～15 min和15 min，其污染率均為0，并且外植體未發(fā)生褐化現(xiàn)象。不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 1.5 mg/L，每個外植體可誘導(dǎo)6.6個不定芽，并且生長健壯。

關(guān)鍵詞：草石蠶（Stachys sieboldii Miq）；外植體；消毒；不定芽增殖

中圖分類號：Q943.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6601-03

草石蠶（Stachys siebordii Miq.）又名甘露子、寶塔菜、地牯牛、地蠶等，為唇形科水蘇屬多年生宿根草本植物[1]，是中國的特色蔬菜之一[2-4]。草石蠶原產(chǎn)于中國北方，現(xiàn)重慶、山東、江蘇、河北、內(nèi)蒙古、陜西、廣東等地均有種植。草石蠶具有十分豐富的營養(yǎng)價值，每1 kg草石蠶中含蛋白質(zhì)55 g、脂肪3 g和碳水化合物203 g[5]。宋建清等[6]報道草石蠶中糖類含量高達12.47%，磷元素含量高達11.07 mg/g，是一種天然的磷源。草石蠶具有重要的藥用價值，《本草綱目》稱其“功能近似冬蟲草”、既可為菜為藥，又可充果，《陸川草本》載有：“滋養(yǎng)強壯，清補肺金，功類冬蟲草，治身體贏瘦，虛勞咳嗽，小兒疳積”，《貴州草藥》記載：“清肺解表，全草治風熱感冒”。草石蠶中含有豐富的水蘇糖，具有潤肺益腎、滋陰補血的功能，可治療氣喘、腎虛腰痛、淋巴結(jié)核、肺結(jié)核咯血等病癥[5]。

草石蠶為無性繁殖，常常攜帶大量病毒，并已成為草石蠶產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要原因，因此草石蠶組織培養(yǎng)脫毒苗勢在必行。無菌系的建立是組織培養(yǎng)的首要環(huán)節(jié)，但草石蠶植株（葉、莖）表面長有許多絨毛，容易攜帶大量污染微生物而不易消毒，常出現(xiàn)消毒時間短而導(dǎo)致污染；消毒時間長而導(dǎo)致外植體受到消毒劑毒害而發(fā)生褐化、死亡現(xiàn)象。目前關(guān)于草石蠶外植體消毒方法和芽增殖培養(yǎng)基方面的研究鮮見報道。因此，本試驗針對草石蠶組織培養(yǎng)中存在的這些關(guān)鍵問題，研究了草石蠶外植體的消毒方法和芽增殖培養(yǎng)基適宜配方，為組織培養(yǎng)快速繁殖和脫毒苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣主栽草石蠶品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 草石蠶外植體消毒方法的探索 用添加洗潔精的自來水浸泡草石蠶葉片和莖尖1～2 h，將其用清水沖洗干凈。接著在75%乙醇中消毒2 s，用無菌水沖洗3次后，轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2或1% NaClO（有效Cl濃度）溶液中分別殺菌處理5、10、15和20 min，用無菌水漂洗5～6次，將已滅菌的葉片（切成 1 cm×1 cm方塊）和莖尖接種到盛有MS培養(yǎng)基（添加瓊脂粉7 g/L和蔗糖30 g/L，pH為6.0）的三角瓶中，每個處理接種6個三角瓶，每瓶接種2個外植體，3次重復(fù)。接種后將材料溫度25 ℃、光照時間14 h（光照強度6 600 lx）培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計外植體污染和褐化情況。

1.2.2 草石蠶叢生芽增殖培養(yǎng)基的篩選 將消毒的莖尖接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基采用1.0、3.0、5.0 mg/L 6-BA（A），0.3、0.5、0.7 mg/L NAA（B），0.5、1.5、2.5 mg/L GA3（C） 3因素3水平L9（34）的正交試驗設(shè)計，研究培養(yǎng)基中6-BA、NAA和GA3對不定芽增殖的影響。培養(yǎng)40 d后觀察統(tǒng)計芽增殖生長情況。增殖系數(shù)的計算公式為：增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)目/接種芽數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用DPS（7.05）軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，LSD方法進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑對草石蠶外植體的消毒效果

由表1和表2可知，以草石蠶莖尖為外植體時，當0.1% HgCl2溶液消毒5 min時，污染率達100.0%，污染程度較重，并且莖尖出現(xiàn)了輕度褐化。當0.1% HgCl2溶液消毒10 min時，莖尖污染率和消毒5 min處理之間差異不顯著，但是褐化率加重，差異極顯著。當0.1% HgCl2溶液消毒15 min時，污染率進一步下降，但莖尖全部褐化。采用1% NaClO溶液消毒莖尖5 min時，污染率為20.0%，沒有褐化現(xiàn)象。當消毒時間為10和15 min時，莖尖無污染發(fā)生，也沒有出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。當消毒時間為20 min時，雖然無污染發(fā)生，但15.0%莖尖出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象。因此，以草石蠶莖尖為外植體時，1% NaClO溶液比0.1% HgCl2溶液消毒效果好，1% NaClO溶液適宜的消毒時間為10～15 min。

以草石蠶葉片為外植體時，不同的0.1% HgCl2溶液消毒時間均沒有完全消除葉片污染現(xiàn)象，并且隨著消毒時間的延長，褐化變得越來越嚴重。采用1% NaClO溶液消毒5和10 min時，無褐化現(xiàn)象，但污染率分別為14.3%和5.7%。1% NaClO溶液消毒15 min時既無污染發(fā)生，又無褐化現(xiàn)象。1% NaClO溶液消毒20 min時無污染發(fā)生，但有褐化現(xiàn)象，褐化率為37.1%。由此可知，以草石蠶葉片為外植體時，采用1% NaClO溶液比0.1% HgCl2溶液的消毒效果好，NaClO溶液最佳的消毒時間為15 min。

綜上所述，無論對于莖尖或葉片哪種外植體，1% NaClO溶液比0.1% HgCl2溶液的消毒效果好。以莖尖為外植體時，NaClO溶液適宜的消毒時間為10～15 min；以葉片為外植體時，NaClO溶液適宜的消毒時間為15 min。

2.2 草石蠶不定芽增殖培養(yǎng)基的篩選

不同濃度的6-BA、NAA和GA3組合對草石蠶不定芽增殖的效果不同（表3）。處理7（6-BA、NAA和GA3的濃度分別為5.0、0.3和1.5 mg/L時）的增殖系數(shù)最高，為6.6，并且芽粗壯，長勢好；處理3的增殖系數(shù)次之，為4.5；處理4的增殖系數(shù)第三，為4.3。NAA、GA3和6-BA增殖系數(shù)的極差值分別為4.3、4.0和2.5，NAA對草石蠶不定芽增殖系數(shù)的影響最大，GA3次之，6-BA的影響最小。

3 小結(jié)與討論

植物組織培養(yǎng)過程中，若不能有效地對外植體進行消毒，必將影響無菌系的建立和組織培養(yǎng)的順利開展。在自然生長條件下，外植體表面攜帶大量污染微生物，因此外植體消毒就成為組織培養(yǎng)過程中首要步驟[7]。不同植物在自然條件下所攜帶的污染微生物有所不同，所采取的消毒方式也不盡相同。所以，消毒方法的選擇對于植物組織培養(yǎng)的成功與否起著至關(guān)重要的作用。王小敏[8]以薄荷、留蘭香和椒樣薄荷的莖尖、莖段和幼嫩葉片為外植體進行消毒，結(jié)果表明，最適的消毒處理為先用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min或0.2% HgCl2處理8 min。張秀珍[9]研究東北百里香莖段得出最適宜的消毒方法是75%乙醇30 s+0.1% HgCl2處理8～10 min。董玉梅等[10]研究了迷迭香葉片消毒方法。周川云[11]分別以紫蘇種子、子葉、下胚軸和葉片為外植體，采用乙醇、HCl2、NaClO不同濃度、不同處理時間進行外植體消毒，分別獲得了不同外植體適宜的滅菌條件。本試驗以草石蠶不同外植體為試材，開展了HgCl2與NaClO兩種消毒劑對草石蠶消毒效果的研究，結(jié)果表明，NaClO溶液比HgCl2溶液消毒效果好，以莖尖為外植體時，75%乙醇2 s+1% NaClO 10～15 min的消毒效果最好；以葉片為外植體時，75%乙醇2 s +1% NaClO 15 min的消毒效果最佳，其污染率均為0，并且未發(fā)生褐化現(xiàn)象。與前人研究相比，本試驗通過縮短乙醇的處理時間來減少對外植體的損害，同時采用NaClO溶液以避免HgCl2消毒液難以清除問題。

在植物組織培養(yǎng)過程中，激素雖然用量很少，但是對植物組織培養(yǎng)起著顯著的調(diào)控作用[12，13]。細胞分裂素類可促進細胞分裂和器官分化，促進芽分化和生長，適宜的細胞分裂素濃度對不定芽增殖起著重要作用。生長素類主要作用有促進細胞分裂和伸長，誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，誘導(dǎo)、促進生根，還會誘導(dǎo)某些植物胚狀體的形成。赤霉素類主要作用是促進細胞生長和打破休眠，在器官形成后，可促進器官或胚狀體的生長。在組織培養(yǎng)過程中，通常將生長素類、細胞分裂素類和赤霉素類等植物生長調(diào)節(jié)劑配合使用，以誘導(dǎo)不定芽增殖，獲得較多的增殖芽數(shù)目，提高組培苗質(zhì)量。張國裕等[14]對銀條芽增殖培養(yǎng)基進行了研究，發(fā)現(xiàn)MS+6-BA 4.5 mg/L+GA3 1.0 mg/L為最佳芽增殖培養(yǎng)基。王丹[15]研究了黃芩組織培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)黃芩叢生芽的增殖培養(yǎng)基以MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L為佳，且芽長的大且粗壯。沙紅等[16]進行了留香蘭的組織培養(yǎng)試驗，得出其最佳增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0～0.1 mg/L+IBA 0～0.04 mg/L。史華平等[17]研究得出紫蘇繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。本試驗研究發(fā)現(xiàn)草石蠶不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 1.5 mg/L，增殖系數(shù)是6.6；本試驗草石蠶不定芽增殖培養(yǎng)基研究結(jié)果與張國裕等[14]結(jié)果比較一致，其原因是兩者試驗材料相似。徐夢等[18]研究了甘露子的不定芽增殖系數(shù)為5.6，本試驗比其提高了17.9%。

參考文獻：

[1] 鄭 華，周月英.浙江蔬菜資源（下）[J].上海蔬菜，2001（1）：9-10.

[2] 黃善香.中國種植養(yǎng)殖技術(shù)百科全書[M].?？冢耗戏匠霭嫔纾?1999.

[3] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第六十六卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1977.18-20.

[4] 中國科學(xué)院北京植物研究所.中國高等植物圖鑒（第三冊）[M].北京：科學(xué)出版社，1972.

[5] 廖玉平.A級綠色食品草石蠶標準化生產(chǎn)栽培技術(shù)[J].中國園藝文摘，2012（1）：112-113.

[6] 宋建清，葉 萌，張議方，等.三種蟲草蝙蝠蛾幼蟲野生食材的營養(yǎng)成分分析[J].北方園藝，2011（9）：157-159.

[7] 陳正華.木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用[M].北京：高等教育出版社，1986.

[8] 王小敏.薄荷屬植物的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9] 張秀珍.東北百里香組織培養(yǎng)再生體系的建立及化感作用研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010.

[10] 董玉梅，李正楠，錢 成，等.迷迭香葉片愈傷組織誘導(dǎo)及再分化培養(yǎng)[J].分子植物育種，2012，10（2）：189-194.

[11] 周川云.紫蘇愈傷組織誘導(dǎo)及其細胞懸浮體系建立的研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2009.

[12] 劉天頤，陳炳銓，陳錫沐.激素對沙漠玫瑰愈傷組織的影響[J].經(jīng)濟林學(xué)研究，2004，22（1）：25-28.

[13] 張紅曉，康向陽，沈 燕，等.白刺組培快繁的研究[J].經(jīng)濟林研究，2003，21（4）：60-63.

[14] 張國裕，程智慧，李 娟，等.銀條不定芽誘導(dǎo)及高效增值體系的建立[J].西北農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，32（2）：49-52.

[15] 王 丹.黃芩組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2009（1）：18-20.

[16] 沙 紅，廖 康.藥用植物留香蘭的組織培養(yǎng)研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，26（1）：10-12.

[17] 史華平，王計平.紫蘇組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，31（6）：498-502.

[18] 徐 夢，孔祥慧，高迎秋，等.甘露子的組織培養(yǎng)與植株再生[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，34（2）：10-13.