湖北青磚茶葉片發(fā)酵前后形態(tài)變化比較

何建剛++肖長義++王春燕+李世剛++王慧+柳蔚

摘要：為了解湖北青磚茶發(fā)酵過程的變化實質(zhì)，試驗分析了湖北青磚茶在發(fā)酵前后葉片組織結(jié)構(gòu)的變化情況，分別取發(fā)酵前后10片茶葉葉片，切片染色處理后于光鏡下觀察，統(tǒng)計葉片纖維組分與細(xì)胞膠團(tuán)質(zhì)組分的面積大小，分析面積變化情況。同時做葉片的透射電鏡觀察。結(jié)果表明，與發(fā)酵前的茶葉相比，發(fā)酵后的葉片組織較為疏松，細(xì)胞室變大，由纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)明顯變薄，甚至出現(xiàn)斷裂；葉片內(nèi)可見菌體明顯的斷面。圖像分析顯示，葉片組織的纖維成分減少顯著，而黃色的細(xì)胞膠團(tuán)質(zhì)成分的含量相對增加。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，胞壁室內(nèi)位于膠團(tuán)質(zhì)和細(xì)胞壁之間的空隙內(nèi)有多量菌體存在。所以湖北青磚茶的發(fā)酵過程是以微生物為主導(dǎo)、對茶葉進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過程，這種轉(zhuǎn)化主要消耗葉片組織中的纖維素成分。

關(guān)鍵詞：青磚茶；葉片；結(jié)構(gòu)；發(fā)酵；湖北省

中圖分類號：TS456.56（263） 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6480-04

長盛川湖北青磚茶是以曬毛青葉為原料，經(jīng)過發(fā)酵、成化、蒸壓、烘干等工藝流程制成，其中發(fā)酵過程對青磚茶的風(fēng)味形成起著決定性的作用。從前人對湖南安化黑茶、云南普洱茶等黑茶系列的研究[1-3]可知，發(fā)酵過程對改變茶品質(zhì)具有非常關(guān)鍵的作用。目前，關(guān)于青磚茶發(fā)酵本質(zhì)的研究不多，對于啟動發(fā)酵過程的主導(dǎo)因素也存在較大爭議。試驗從茶葉葉片的形態(tài)學(xué)變化入手，通過比較發(fā)酵前后葉片組織結(jié)構(gòu)的改變，對發(fā)酵過程進(jìn)行描述推測，以期為青磚茶的發(fā)酵工藝實質(zhì)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 青磚茶茶葉樣品 從鑫鼎生物科技有限公司2014年6月收購的同一批青磚茶原料干茶葉片中，于發(fā)酵前后各取10片葉片。所取葉片要求形態(tài)完整、大小近似。未發(fā)酵的干茶葉片顏色淡綠，葉片伸展，全葉色澤基本一致；發(fā)酵后的干茶葉片要求發(fā)酵完整，葉片皺縮明顯，顏色呈深褐色，無光澤，全葉色澤基本一致，無綠色或黃色斑塊。

1.1.2 試劑 試驗所用試劑有乙醇、甲醛、高碘酸、PAS（過碘酸-雪夫染色液）、Schiff試劑（品紅亞硫酸試劑）、亞硫酸氫鹽溶液、二甲苯、2.5%戊二醛、1%四氧化鋨、硝酸鉛、醋酸鈾等，還有中性樹膠、石蠟、環(huán)氧樹脂。

1.1.3 儀器 主要有Leica DM RHC萬能生物成像顯微鏡（德國徠卡微系統(tǒng)有限公司）、Olympus DP73圖像采集系統(tǒng)（日本奧林巴斯株式會社）、DZF-6050數(shù)顯真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、Microm HM340E超薄切片機(jī)（德國美康公司）、日立 7500透射電子顯微鏡（日本日立公司）等。

1.2 光鏡切片制備

參試葉片用4%甲醛固定24 h，截取葉片中段約1 cm寬的葉片樣，入乙醇脫水，石蠟包埋、切片。切片脫蠟后，進(jìn)行PAS染色[4]，該染色可使含糖的組織成分顯示為紅色，染色方法簡述如下：切片脫蠟，高碘酸溶液處理2～5 min，去離子水充分漂洗；加入Schiff試劑，室溫作用15 min；入亞硫酸氫鹽溶液 3次，每次2 min，流水沖洗5 min，去離子水漂洗1 min；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 光鏡觀察、照相及圖像分析

將制備好的玻片標(biāo)本置于Leica DM RHC顯微鏡下進(jìn)行觀察，Olympus DP73圖像采集系統(tǒng)于400倍下采集圖像。每個葉片的圖像采集都是從葉片中軸主脈處開始向葉片一側(cè)方向移動，逐個視野采集圖像，每個葉片采集10張。采集的圖像用 Image-Pro Plus V 7.0顯微鏡圖像分析軟件進(jìn)行分析，分別對圖片中總著色面積、代表茶葉細(xì)胞膠團(tuán)質(zhì)成分的黃色部分和代表纖維素成分的紅色部分進(jìn)行面積測算，并計算后2個面積占總面積的百分比例。

1.4 水浸提后茶樣重量的比較

將青磚茶原料干茶葉片先置于真空干燥箱內(nèi)50 ℃、4 h烘干，達(dá)到干透的狀態(tài)，稱200 g重的茶樣，將其置于裝有2 L自來水的不銹鋼鍋中水煮，加熱至沸騰，持續(xù)水煮5 min，然后換水，按上述條件再煮1次，徹底溶出茶樣內(nèi)的水溶性物質(zhì)。煮畢后瀝凈殘水，將處理后的茶樣置真空干燥箱中50 ℃、6 h烘干，達(dá)到干透的狀態(tài)，稱茶樣殘重。發(fā)酵前的茶樣和發(fā)酵后的茶樣都按上述程序處理，分別做6個批次。比較2組茶樣殘余重量的差異。

1.5 電鏡觀察

用2.5%戊二醛固定干茶葉片，再用1%四氧化鋨固定，常規(guī)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，片厚約300～400 nm，置于銅網(wǎng)中，再分別用硝酸鉛和醋酸鈾復(fù)染。最后，樣本用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，并照相。

1.6 統(tǒng)計分析

采用t檢驗的方法，分別對水浸提后2組青磚茶原料干茶葉片殘余重量的差異、發(fā)酵前后青磚茶原料干茶葉片組織內(nèi)膠團(tuán)質(zhì)面積與纖維面積之比的變化和發(fā)酵前后除去水溶性物質(zhì)后茶樣殘重的變化是否具有統(tǒng)計學(xué)意義進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察

PAS染色后的青磚茶原料干茶葉片結(jié)構(gòu)在鏡下主要顯示為紅、黃2種顏色。由于構(gòu)成細(xì)胞壁的主要物質(zhì)是纖維素，纖維素又是以糖為基礎(chǔ)的碳水化合物，所以PAS染色呈陽性，被染成紅色。茶樣的細(xì)胞胞體存在于胞壁腔內(nèi)，為大塊無定形的黃色膠質(zhì)樣物質(zhì)所充填，這種黃色膠質(zhì)樣物系葉片細(xì)胞在茶葉殺青處理過程中，細(xì)胞本身的物質(zhì)混合并膠質(zhì)化而形成的，所以將這種物質(zhì)稱之為“細(xì)胞膠團(tuán)質(zhì)”。

試驗在光鏡下對未發(fā)酵的PAS染色葉片結(jié)構(gòu)觀察情況見圖1。從圖1可見，光鏡下未發(fā)酵的葉片結(jié)構(gòu)完整、豐滿、厚實；被染成紅色的胞壁框架占據(jù)著葉片組織的絕大部分區(qū)域，這些細(xì)胞壁框架結(jié)構(gòu)齊全、規(guī)則，構(gòu)建成厚實、緊密的組織構(gòu)架。在上、下表皮之間的組織內(nèi)可見大量黃色的膠團(tuán)質(zhì)塊，它們均存在于胞壁腔內(nèi)，并充滿胞壁腔，周圍的腔隙較小。黃色膠團(tuán)顏色均勻，色澤鮮明。

試驗在光鏡下對發(fā)酵的PAS染色葉片結(jié)構(gòu)觀察情況見圖2。從圖2可見，光鏡下已發(fā)酵的葉片結(jié)構(gòu)可見紅色的細(xì)胞壁明顯變薄、染色變淺，甚至斷裂，胞壁腔明顯擴(kuò)大。葉片整體細(xì)胞壁框架疏松，多處破碎、缺失，結(jié)構(gòu)凌亂、松散，常有空隙存在。胞壁腔之內(nèi)的黃色膠團(tuán)質(zhì)未見明顯形態(tài)及染色變化，只是與擴(kuò)大的胞壁腔在胞壁之間形成較大的間隙。在葉片的表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，可以看到有數(shù)量不等、分布廣泛、被染成淺粉紅色的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這些都是真菌菌絲的斷面，而菌絲體的壁較薄，因為真菌菌絲體的壁主要是以單糖為原料構(gòu)成的多糖成分，因此也呈PAS染色陽性，被染成紅色。

2.2 圖像分析

采用Image-Pro Plus V 7.0顯微鏡圖像分析軟件對青磚茶原料干茶葉片總著色面積和紅、黃2種不同著色面積區(qū)域分別進(jìn)行測算，結(jié)果見表1。從表1可見，發(fā)酵后，葉片以纖維素為主要構(gòu)成成分的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)面積明顯減少，而由胞質(zhì)混合物組成的黃色膠團(tuán)質(zhì)的面積出現(xiàn)明顯變化，膠質(zhì)樣物在組織中的占比相對增高明顯，具有顯著性差異（P<0.05）。

2.3 水浸提后茶葉重量的比較

采用t檢驗的方法，對經(jīng)過2次沸水浸提之后2組青磚茶原料干茶葉片的重量進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。從表2可見，2次沸水浸提后2組茶樣的重量均明顯減輕，但發(fā)酵后的茶樣重量減少程度與未發(fā)酵的茶樣相比顯著減少，具有顯著性差異（P<0.05）。

2.4 電鏡觀察

對發(fā)酵茶的葉片進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果見圖3。從圖3可見，葉片組織內(nèi)有大量菌體的斷面，這些菌體斷面在未發(fā)酵的葉片組織內(nèi)很少看到。葉片組織內(nèi)的菌體斷面多見于細(xì)胞壁之間的間隙中，也可見于胞壁室內(nèi)，但以氣室內(nèi)和細(xì)胞壁間隙的居多，胞壁室內(nèi)相對較少（圖3-A）。存在于胞壁室內(nèi)的菌體只出現(xiàn)于膠團(tuán)質(zhì)與細(xì)胞壁之間，未見有菌體進(jìn)入膠團(tuán)質(zhì)內(nèi)；在菌體貼近胞壁的地方，胞壁可形成圍繞菌體的“暈缺”，可能是菌體消化了胞壁而形成的（圖3-B）。

3 討論

湖北青磚茶工藝傳世盡管已有近六百年的歷史，但是，關(guān)于它的工藝研究并不如同屬黑茶系列的云南普洱茶和湖南黑茶多見，關(guān)于湖北青磚茶渥堆發(fā)酵的本質(zhì)還不清楚。尤其是在形成黑茶特有品質(zhì)方面，究竟是以茶內(nèi)在酶的生物氧化為主的“內(nèi)發(fā)酵”為主導(dǎo)，還是以外部菌群的生物轉(zhuǎn)化為主的“外發(fā)酵”為主導(dǎo)，一直存在較大爭議。弄清這個問題對提高湖北青磚茶品質(zhì)、促進(jìn)生產(chǎn)工藝的標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化都有著非常重要的意義。

試驗通過對發(fā)酵前后青磚茶原料干茶葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)成分變化最大的是以纖維素作為主要構(gòu)成要素的細(xì)胞壁的破壞和減少，而因細(xì)胞自溶、殺青、揉捻作用由細(xì)胞自身成分發(fā)生混合、交集、凝結(jié)形成的黃色膠質(zhì)樣物質(zhì)卻沒有明顯的形態(tài)與數(shù)量的改變。在葉片表面及葉片結(jié)構(gòu)內(nèi)部均可見到一定數(shù)量的真菌菌絲結(jié)構(gòu)，圖像分析顯示，發(fā)酵后的葉片內(nèi)，由含糖的細(xì)胞壁成分占據(jù)的面積明顯減少；而細(xì)胞自身所含能直接分解細(xì)胞壁的酶十分有限。因此，通過渥堆的過程，由葉片細(xì)胞內(nèi)部的酶消化細(xì)胞壁的可能性非常之小[5，6]。而由發(fā)酵菌類分泌的酶類消化細(xì)胞壁，可能是造成葉片纖維素成分明顯減少的主要因素[5-9]。發(fā)酵后的茶葉水溶性物質(zhì)減少的原因可能是發(fā)酵菌利用了葉片內(nèi)（包括膠團(tuán)質(zhì)）的可溶性物質(zhì)，使茶葉內(nèi)（包括膠團(tuán)質(zhì)）可溶性物質(zhì)減少；也有可能是菌類的代謝產(chǎn)物與葉片內(nèi)可溶性物質(zhì)結(jié)合形成了不溶性沉淀物所致；這一結(jié)果與他人的研究結(jié)果一致[10]。

對發(fā)酵茶的葉片進(jìn)行電鏡觀察，證明有真菌類侵襲入葉片的組織之內(nèi)，并進(jìn)行了大量繁殖，同時在其存在的部位對細(xì)胞壁形成溶蝕性“暈缺”。這一現(xiàn)象與試驗里PAS染色觀察和圖像分析的結(jié)果一致，確認(rèn)是真菌類參與了茶的渥堆發(fā)酵過程，并在發(fā)酵過程中消耗了以糖為主要構(gòu)成物質(zhì)的細(xì)胞壁。因此從發(fā)酵的本質(zhì)來講，湖北青磚茶與普洱茶、茯磚茶及黑茶一樣，都屬于以真菌為主導(dǎo)的發(fā)酵類茶[1-3，11-14]。

至于是何種真菌類參與了青磚茶的渥堆發(fā)酵過程，目前尚不能給出明確的答案，雖然從形態(tài)上看均是真菌的形態(tài)特征，但究竟是何種真菌還有待后續(xù)研究給予確認(rèn)。弄清湖北青磚茶渥堆本質(zhì)及參與發(fā)酵菌群的情況，對后續(xù)茶品質(zhì)、保健功能、工藝研究等都有重要的意義。

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