解硒菌9906—5B解硒率的響應面分析

劉金龍+溫亮+彭一洪+鄭威+戴光忠+楊軍

摘要：篩選得到一種解硒菌9906-5B，利用含單質硒的煤矸石生產亞硒酸鈉，以便有效防止化學法提取硒造成的環(huán)境污染。在培養(yǎng)基中加入單質硒，利用解硒菌9906-5B，根據(jù)單因素結果設計它的響應面試驗。運用SAS軟件對解硒因素參數(shù)進行統(tǒng)計分析，探討單因素條件下9906-5B的解硒效果。結果表明，解硒菌9906-5B在pH 6.0溫度30 ℃解硒菌發(fā)酵28 h條件下，解硒率達到79.10%。

關鍵詞：9906-5B解硒菌；解硒率；響應面分析

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6395-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.019

硒是人體必需的微量元素之一，也是長壽元素。硒有抗癌、抗氧化作用，能夠增強人體免疫力，拮抗有害重金屬，能夠保肝護肝，具有調節(jié)維生素A、維生素C、維生素E、維生素K的吸收與利用，調節(jié)蛋白質和酶及輔酶合成的功能，能夠增強生殖功能。缺硒會導致克山病、大骨節(jié)病、心血管病、癌癥、糖尿病等40多種疾病[1，2]。

湖北省恩施州富硒土壤資源豐富，表層土壤硒含量大于0.4 mg/kg的富硒地區(qū)面積約10 456 km2，占全州面積的43.63%，恩施市含硒碳質頁巖出露面積850 km2，硒礦儲量達50多億t，新塘鄉(xiāng)雙河魚塘壩的硒礦被稱為“世界罕見和惟一獨立工業(yè)硒礦床”，填補了全球無獨立硒礦床的空白。核心礦區(qū)長6 km，寬1.5 km，面積0.88 km2，含硒量均值為3 637.5 mg/kg，含硒品位為230～6 300 mg/kg，探明具有工業(yè)開采價值的硒金屬（工業(yè)純硒）45.699 t，漁塘壩巖石中硒的含量最高達6 300 mg/kg，是國外已發(fā)現(xiàn)最高含硒巖石的11倍[3]。這些富硒碳質巖石中的硒主要以有機態(tài)、元素態(tài)和硫化物/硒化物態(tài)的形式存在[4]。這些礦物硒有效態(tài)含量低，不易被動植物吸收利用，并且硒往往與重金屬伴生，人為在貧硒土壤中補充硒礦粉，有可能帶來土壤的二次污染，但目前采用的酸堿法提取硒的方法，又會造成水體等環(huán)境污染。因此，本研究借鑒稀有金屬和含量少的貴金屬礦成功采用微生物選礦技術提取的方法，嘗試利用微生物從硒礦石中提取硒，用單質硒配成培養(yǎng)基，使用篩選到的解硒菌9906-5B發(fā)酵，觀察在不同條件下解硒菌對單質硒離子化的效果，探討利用微生物從含硒礦石中提取硒的技術。

1 材料與方法

1.1 材料

解硒菌（湖北民族學院篩選，中國科學院北京微生物研究所鑒定）、單質硒純度99%（湖北恩施市新塘鄉(xiāng)雙河魚塘壩）。

試驗設備：超凈工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2FD）、恒溫搖床（HQL150B中國科學院武漢儀器廠）、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、三角瓶（250、500 mL）。

試驗試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純，廠家均為國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 解硒菌活化培養(yǎng)基配制及試管菌種制作 牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，瓊脂1.5 g，去離子水1 000 mL，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH到7.2～7.6，分裝在試管中，高壓蒸氣滅菌，取出擺斜面，在超凈工作臺上無菌接種活化菌種，制成試管種。

1.2.2 解硒菌搖瓶種子液培養(yǎng)基配制 種子液培養(yǎng)基（牛肉膏液體培養(yǎng)基）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，去離子水1 000 mL。每500 mL三角瓶裝100 mL解硒菌搖瓶種子液培養(yǎng)基，接種試管菌種，置控溫搖床培養(yǎng)。

1.2.3 解硒菌單因素解離單質硒方法設計 使用牛肉膏液體培養(yǎng)基，溫度30 ℃，發(fā)酵28 h，設搖瓶液體培養(yǎng)基pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，分別接菌種于控溫培養(yǎng)基上；使用牛肉膏液體培養(yǎng)基，pH 5.5，發(fā)酵28 h，設搖瓶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度分別為27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0 ℃，分別接菌種于控溫培養(yǎng)基上；使用牛肉膏液體培養(yǎng)基，溫度為30 ℃，pH 5.5，設搖瓶液體培養(yǎng)基發(fā)酵時間分別為17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 h，分別接菌種于控溫培養(yǎng)基上。

1.2.4 解硒菌復因素解離單質硒響應面試驗設計 將單質硒用塊煤煤粉配成單質硒含量為300 mg/kg的含硒材料，將10%解硒菌搖瓶種子液加入到解硒菌搖瓶種子液培養(yǎng)基（煤粉重量的50%）中，并用其拌勻煤粉，煤粉含水率達60%，堆積控發(fā)酵。解硒菌復因素解離單質硒響應面試驗設計[5]見表1。

1.2.5 離子硒的檢測方法 發(fā)酵處理樣品送至湖北省恩施州硒產業(yè)研究院，采用液相色譜和原子熒光聯(lián)用法檢測離子硒含量，再用加入的單質硒減去檢測的離子硒含量，求得解硒菌解硒率（mg/kg）[6]。

2 結果與分析

2.1 單因素對解硒菌解硒率的影響

2.1.1 不同pH對解硒菌解硒率的影響 測定不同pH對解硒菌解硒率的影響，結果如圖1所示，在pH 5.5時解硒率最高，同時也適合解硒菌發(fā)酵的活性酸度范圍。

2.1.2 不同溫度對解硒菌解硒率的影響 由圖2可知，隨溫度提高，解硒率不斷上升，在30 ℃時達最大，溫度繼續(xù)升高解硒率反而下降，說明解硒菌活性被高溫抑制。結果表明，30 ℃是解硒菌的適宜溫度，其活性達最大。

2.1.3 不同發(fā)酵時間對解硒菌解硒率的影響 由圖3可知，隨發(fā)酵時間延長，解硒率不斷增大，但當解硒菌發(fā)酵時間超過28 h后，解硒率不變，說明解硒菌解硒達到飽和。

2.2 響應面法優(yōu)化試驗

2.2.1 根據(jù)Box-Behnken試驗設計方案 選取培養(yǎng)基pH（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、發(fā)酵時間（X3）3個影響因子，解硒率為響應值，試驗設計結果見表2，在pH為6.0，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為28 h時，解硒率最高，為79.10%。

2.2.3 響應面分析 由響應面可知，發(fā)酵溫度響應曲面最陡峭，對解硒菌解硒率作用最顯著，其次是培養(yǎng)基的pH，再次是發(fā)酵時間。

3 小結

本研究將響應曲面法運用于優(yōu)化解硒菌解硒工藝。經試驗優(yōu)化后的解硒菌解硒最佳工藝條件為：解硒菌發(fā)酵時間為28 h、pH 6.0、發(fā)酵溫度30 ℃。此工藝下提取率為79.10%。

通過篩選解硒能力更強的菌種可提高解硒率。解硒菌種是客觀存在的，通過育種手段可以獲得解硒能力更強的菌種，提高解硒率，還可通過篩選混合菌提高解硒能力。

解硒菌將煤矸石中的單質硒分解為離子硒。用解硒菌生產亞硒酸鈉生產工藝：將單質硒礦石磨成硒礦粉，加入解硒菌將硒礦石中單質硒降解成離子硒，加入適量的硒離子吸附劑，壓濾、加熱蒸發(fā)濾液，濃縮、結晶，加熱烘干結晶-加硫酸反應-生成亞硒酸鈉。與傳統(tǒng)亞硒酸鈉生產工藝相比不加大量強堿，可降低成本，加酸生產亞硒酸鈉不向外排酸，生產中環(huán)境污染少。

參考文獻：

[1] 李 軍，張忠誠.微量元素硒與人體健康[J].微量元素與健康研究，2011，28（5）：59-63.

[2] 徐兵河，孫 燕.微量元素硒的防癌抗癌作用[J].中國新藥雜志，1998，7（3）：176-179.

[3] 彭祚全，黃劍鋒.世界硒都恩施硒資源研究概述[M].北京：清華大學出版社，2012.

[4] 韓文亮，朱建明，秦海波，等.恩施漁塘壩富硒碳質巖石中硒的形態(tài)分析[J].礦物學報，2007，27（1）：89-95.

[5] 王 希，鐘耀廣，市川壽.響應面優(yōu)化超聲波快速提取鱈魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J].東北農業(yè)大學學報，2014，45（7）：117-123.

[6] 王 欣，幸苑娜，陳澤勇，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法檢測富硒食品中6種硒形態(tài)[J].分析化學研究報告，2013，41（11）：1669-1674.