金花三葉降糖顆粒的薄層色譜鑒別與含量測(cè)定*

龐宇舟，羅佳靜，李芳嬋,2Δ，陳 清，龐曉云，付吉利,2，王蘇妃,2，梁資就,2

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，南寧 530299）

金花三葉降糖顆粒是根據(jù)“藥食同源”及傳統(tǒng)“食療”文化理論總結(jié)挖掘的，是具有降糖功效的壯藥保健產(chǎn)品。金花三葉降糖顆粒由金花茶葉、藤茶、荷葉、桑葉等傳統(tǒng)藥食兩用的壯族特色藥組方，從壯醫(yī)角度分析，方中金花茶葉為主藥，有清熱毒、除濕毒、利水道之功；桑葉能祛風(fēng)毒，清熱毒；木姜葉柯能清熱利尿，滋潤肝腎；荷葉能清熱毒，利水道；藤茶能清熱毒，祛濕毒，通龍路，與“三葉”合用，共為幫藥，主幫配伍，可清濕、熱之毒，通龍路，調(diào)水道，針對(duì)糖尿病患者起到“未病先防，既病防變”的作用。前期研究表明，金花三葉降糖方能顯著降低鏈脲佐菌素致高血糖模型小鼠的空腹血糖，并改善耐糖量。目前金花三葉降糖顆粒尚無相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用薄層色譜法（TLC）鑒別金花三葉降糖顆粒的藤茶、荷葉、木姜葉柯，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定金花三葉降糖顆粒中二氫楊梅素、楊梅素、根皮苷的含量，為金花三葉降糖顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Agilent1260Ⅱ高效液相色譜儀；Cary8453 紫外可見分光光度計(jì)；WFH-203B 型暗箱式自動(dòng)紫外分析儀（昆山市順諾儀器有限公司）；KQ500DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204型分析天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

荷葉對(duì)照藥材（批號(hào)：121322201504，中國食品藥品檢定研究院）；二氫楊梅素（批號(hào)：MUST-19031501，成都曼思特有限公司）；荷葉堿（上海融禾科技發(fā)展有限公司）；楊梅素（批號(hào)：MUST-19022504，成都曼思特有限公司）；金花三葉降糖顆粒（批號(hào)：20190801、20190802、20190901、20190902、201901002、20191003，均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)提供）；硅膠GF254板（批號(hào)：080107，青島海洋化工廠）；甲醇（批號(hào)：187159，賽默飛世爾科技有限公司，色譜純）；乙腈（批號(hào)：182886，賽默飛世爾科技有限公司，色譜純）；乙酸乙酯（批號(hào)：20180801，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氨水（批號(hào)：20180312，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（批號(hào)：20161202，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；三氯化鋁（批號(hào)：20180108，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氯仿（批號(hào)：20171123，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（批號(hào)：20180624，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；丙酮（批號(hào)：20180322，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藤茶的TLC鑒別

取金花三葉降糖顆粒（過65目篩）0.2 g，加入甲醇25 mL，超聲30 min，濾過，制備供試品溶液；取二氫楊梅素對(duì)照品8 mg，楊梅素對(duì)照品2 mg，加甲醇10 mL 溶解，制成二氫楊梅素及楊梅素混合對(duì)照品溶液；取缺藤茶陰性樣品適量（過65 目篩），同供試品制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC《中國藥典》2020 版四部（通則0502），吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿—乙酸乙酯—甲酸（5∶4∶1）為展開劑展開，取出晾干。噴以10%AlCl3溶液顯色，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品與對(duì)照品在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且該方法重現(xiàn)性良好，陰性無干擾，可收入金花三葉降糖顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，見圖1a。

2.2 荷葉的TLC鑒別

取金花三葉降糖顆粒1 g（過65 目篩），加二氯甲烷15 mL，再加濃氨水1 mL，超聲30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，即得供試品溶液；取荷葉對(duì)照藥材0.5 g，同法制備荷葉對(duì)照藥材溶液；取缺荷葉的陰性樣品適量（過65 目篩），同法制備缺荷葉陰性對(duì)照品溶液。照TLC《中國藥典》2020 版四部（通則0502），吸取上述3 種溶液各8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿—丙酮—濃氨水（6∶2∶1）為展開劑展開，取出晾干。置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品與對(duì)照品在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且該方法重現(xiàn)性良好，陰性無干擾，可收入金花三葉降糖顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，見圖1b。

2.3 木姜葉柯的TLC鑒別

取金花三葉降糖顆粒0.5 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，制備供試品溶液；取根皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液；取缺木姜葉柯陰性樣品適量（過65目篩），同供試品制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC《中國藥典》2020 版四部（通則0502），吸取上述溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯—甲酸—水（10∶1∶1）作為展開劑展開，取出晾干。噴以10 % AlCl3溶液，在105 ℃加熱至置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品與對(duì)照品在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且該方法重現(xiàn)性良好，陰性無干擾，專屬性強(qiáng)，可收入金花三葉降糖顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，見圖1。

圖1 金花三葉降糖顆粒中藤茶、荷葉、木姜葉柯的TLC 鑒別結(jié)果

2.4 金花三葉降糖顆粒中二氫楊梅素、楊梅素、根皮苷的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Shim-pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）—0.1%磷酸水（B）；梯度洗脫：0～20 min，14 %～26%A ；20～25 min，26 %～40 %A；25～30 min，40% A；流速1 mL/min；檢測(cè)波長285 nm；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

2.4.2 供試品溶液制備 精密稱定金花三葉降糖顆粒0.2 g（過65 目篩），置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲30 min，放冷，補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，注入液相小瓶，即得供試品溶液。

2.4.3 對(duì)照品溶液制備 取二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素適量，加甲醇制成每1 mL 分別含二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素0.406 8 mg、0.085 4 mg、0.098 7 mg的對(duì)照品溶液。

2.4.4 專屬性考察 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺藤茶陰性樣品溶液、缺木姜葉柯陰性樣品溶液，按“2.4.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。陰性樣品在目標(biāo)成分的色譜峰位置的峰面積與供試品目標(biāo)成分的峰面積的比值小于5%，見圖2。

圖2 金花三葉降糖顆粒HPLC譜圖

2.4.5 線性范圍考察 分別取二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇分別制備質(zhì)量濃度為1.245 0 mg/mL、0.275 0 mg/mL 及0.292 1 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。另取上述對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，配制成具有6個(gè)濃度梯度的混合對(duì)照品溶液。按“2.4.1項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。其線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)（r）結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取0.2 g金花三葉降糖顆粒（批號(hào)：20 190801；過65目篩），精密稱定，按“2.4.2項(xiàng)”下方法制備成供試品溶液，按“2.4.1項(xiàng)”下色譜條件操作，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素峰面積RSD分別為0.657%、0.880%、0.611%。

2.4.7 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.4.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素峰面積RSD為0.089%、0.137%、0.693%。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品0.2 g（批號(hào)：20 190801；過65 目篩），共6 份，精密稱定，按“2.4.2 項(xiàng)”下方法制備成供試品溶液，按“2.4.1 項(xiàng)”下色譜條件操作，記錄峰面積，計(jì)算二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素含量的RSD。結(jié)果二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素含量的RSD分別為3.782%、3.238%、1.791%。

2.4.9 加樣回收試驗(yàn) 取金花三葉降糖顆粒（批號(hào)：20 190801；過65目篩）0.1 g，精密稱定，以二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素含量分別為0.133 2 mg/mL、0.038 2 mg/mL、0.053 6 mg/mL 混合對(duì)照品溶液代替甲醇，按“2.4.2 項(xiàng)”下方法制備成供試品溶液，按“2.4.1 項(xiàng)”下色譜條件操作，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，計(jì)算RSD。結(jié)果二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素的平均回收率分別為98.37%、99.70%、99.02%，RSD分別為1.24%、0.73%、1.49%，見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)n=6

2.4.10 含量測(cè)定 取6批金花三葉降糖顆粒各0.2 g，精密稱定，按“2.4.2 項(xiàng)”下方法制備供試品溶液，按“2.4.1項(xiàng)”下色譜條件操作進(jìn)樣，記錄峰面積，見表3。6 批產(chǎn)品中，二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素的平均含量分別為32.90 mg/g、9.56 mg/g、12.27 mg/g。

表3 6批樣品測(cè)定結(jié)果n=3

3 討論

TLC具有專屬性強(qiáng)、快速、經(jīng)濟(jì)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于保健產(chǎn)品中成分分析和質(zhì)量控制。本研究選擇藤茶、荷葉、金花茶葉、木姜葉柯進(jìn)行TLC 研究，其中金花茶葉鑒別陰性干擾較大，專屬性不佳，因此不納入金花三葉降糖顆粒質(zhì)量控制中。藤茶、荷葉、木姜葉柯的鑒別中專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，選擇可用于金花三葉降糖顆粒質(zhì)量控制。

依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物理論，對(duì)金花三葉降糖顆粒質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，處方中金花茶葉為主藥，研究表明，金花茶葉提取物可降低四氧嘧啶致高血糖小鼠的血糖，其正丁醇部位能提高2 型糖尿病小鼠肝糖原含量、GCK 活性及其蛋白表達(dá)，上調(diào)糖尿病小鼠肝組織GLUT-2 和IRS-1 蛋白的表達(dá)[1-2]。金花茶葉主要含有多酚、多糖、黃酮、揮發(fā)性物質(zhì)與皂苷等，但關(guān)于其具體降糖物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少[3]，故本研究暫未對(duì)金花茶葉的成分進(jìn)行含量測(cè)定。藤茶為處方中的幫藥，其楊梅素、二氫楊梅素是藤茶降糖作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4,13]；木姜葉柯為處方中的幫藥，根皮苷是其重要的降糖活性成分[14-17]。因此選擇幫藥藤茶及木姜葉柯中的二氫楊梅素、楊梅素、根皮苷為金花三葉降糖顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)的特征性成分，為控制金花三葉降糖顆粒質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

本研究建立了HPLC同時(shí)測(cè)定金花三葉降糖顆粒中二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素的含量測(cè)定方法，通過專屬性、線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)考察，結(jié)果表明方法專屬性、線性關(guān)系、重復(fù)性、準(zhǔn)確度良好，供試品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，儀器精密度良好，可用金花三葉降糖顆粒質(zhì)量控制。通過6批產(chǎn)品含量測(cè)定，考慮到藥材的復(fù)雜性，限度按平均值下調(diào)20%，暫定金花三葉降糖顆粒中二氫楊梅素、根皮苷、楊梅素含量不得少于26.32 mg/g、7.65 mg/g、9.82 mg/g。