林蛙油小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究

王彥武+趙鵬+覃光球+何勵(lì)+傅偉忠+張陸娟

[摘要]目的 探討林蛙油對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。方法 將240只小白鼠隨機(jī)分為6個(gè)免疫群組，每個(gè)免疫群組40只。每個(gè)免疫群組根據(jù)人口服推薦劑量（5、10、20倍）設(shè)林蛙油低、中、高劑量組[分別為334、667、1334 mg/（kg·BW）]和陰性對(duì)照組，每組10只動(dòng)物。按0.2 ml/（10 g·BW）的體積經(jīng)口給予小鼠灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d后，進(jìn)行各項(xiàng)免疫指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果 林蛙油劑量組與陰性對(duì)照組比較能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化作用（P<0.05），促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（P<0.05），促進(jìn)小鼠的抗體生成細(xì)胞增加及提高小鼠的血清溶血素水平（P<0.05），增強(qiáng)小鼠的單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力（P<0.05），提高小鼠的NK細(xì)胞活性（P<0.05）。結(jié)論 林蛙油具有增強(qiáng)免疫力的功能。

[關(guān)鍵詞]林蛙油；小鼠；免疫調(diào)節(jié)

[中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）01（c）-0004-03

[Abstract]Objective To explore the effect of Oviductus ranae on the function of immunoregulation.Methods 240 mice were randomly divided into 6 groups of immune group，each group had 40 mice，each immune group was divided into low，medium and high dose group [334，667，1344 mg/（kg·BW）] and negative control group according to recommended oral dose （5，10，20 times） of Oviductus ranae 10 rats in each group.The mice were given intragastric administration according to volume of 0.2 ml/（10 g·BW），intragastric administration was given 1 time a day，and the immune indexes were measured after continuous intragastric administration of 30 d.Results The results of Oviductus ranae dose groups in comparison with the negative control group showed that proliferation and transformation of splenic lymphocyte were enhanced （P<0.05）；promoting mice late hairstyle allergy （P<0.05）；quantity of mice antibody-producing cell and sheep erythrocyte antibody levels in serum were raised（P<0.05）；mononuclear celiac macrophage phagocytic activity were increased （P<0.05）；the activity of NK cells in mice was inhanced（P<0.05）.Conclusion It is suggested that Oviductus ranae can enhance immune function.

[Key words]Oviductus ranae；Mice；Immunoregulation

林蛙油（oviductus ranae）又叫雪蛤油、蛤蟆油，特指中國林蛙長白山亞種雌哈蟆的輸卵管。林蛙油具有生津潤肺、益胃健脾、益精補(bǔ)腎等功效，其營養(yǎng)保健價(jià)值極高。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，林蛙油具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、抗焦慮等多種作用[1-5]。目前國內(nèi)報(bào)道中關(guān)于林蛙油免疫調(diào)節(jié)作用的文獻(xiàn)不少[6-8]，但均局限于細(xì)胞免疫功能檢測(cè)，對(duì)體液免疫功能檢測(cè)報(bào)道不足。本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞免疫和體液免疫等方面檢測(cè)的全面研究，為評(píng)價(jià)林蛙油對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1受試物

林蛙油由黑龍江省五常市某營養(yǎng)品有限公司送檢，受試物的成人每日口服推薦折合劑量為66.7 mg/（kg·BW）。

1.2動(dòng)物

采用健康KM種小白鼠240只，雄性，體重18～22 g，SPF級(jí)，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2011-0005。本動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)過廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心倫理審查委員會(huì)認(rèn)可。

1.3主要儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備包括酶標(biāo)儀（美國貝斯特960）、二氧化碳培養(yǎng)箱（精密科儀L5410-220）、電子分析天平（賽多利斯BS224S）、半自動(dòng)生化分析儀（日立KY-2000）、顯微鏡（徠卡DM6000B）等。

實(shí)驗(yàn)主要試劑包括ConA（Sigma）；MTT（Sigma）；RPMI1640培養(yǎng)液（賽默飛世爾）；YAC-1細(xì)胞（上海素爾生物科技有限公司）；DNFB（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)080908）；印度墨汁（北京天佑達(dá)生物工程科技有限公司，批號(hào)12/2011）；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）及補(bǔ)體（豚鼠血清）：由本實(shí)驗(yàn)室制備等。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

先將動(dòng)物隨機(jī)分組，每40只小鼠為1個(gè)免疫群組，共6個(gè)免疫群。每個(gè)免疫群組根據(jù)人口服推薦劑量（5、10、20倍）設(shè)林蛙油低、中、高劑量組[分別為334、667、1334 mg/（kg·BW）]和陰性對(duì)照組，每組10只動(dòng)物。動(dòng)物灌胃按0.2 ml/（10 g·BW）玉米油的體積給予，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d。

參照文獻(xiàn)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[9]相關(guān)試驗(yàn)方法進(jìn)行下列七項(xiàng)檢測(cè)：采用MTT法檢測(cè)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和耳腫脹法檢測(cè)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)2項(xiàng)細(xì)胞免疫功能檢測(cè)；采用Jerne改良玻片法檢測(cè)抗體生成細(xì)胞數(shù)和血凝法檢測(cè)血清溶血素水平2項(xiàng)體液免疫功能檢測(cè)；采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）和小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)2項(xiàng)單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)；NK細(xì)胞活性檢測(cè)采用乳酸脫氫酶測(cè)定法。

1.5觀察指標(biāo)

①小鼠體重及增重，進(jìn)行臟器/體重比值測(cè)定；②小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，用加ConA孔的吸光度（D570）值減去不加ConA孔的D570值表示；③DTH的程度，以左右耳重量之差值表示；④空斑數(shù)表示抗體生成細(xì)胞數(shù)；⑤觀察血球凝集程度計(jì)算抗體積數(shù)；⑥每只小鼠腹腔液制片后，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)；⑦稱取肝、脾臟重量，測(cè)定注入墨汁后的靜脈血D600值，計(jì)算碳廓清吞噬指數(shù)（a）；⑧測(cè)定反應(yīng)孔、自然釋放孔、最大釋放孔值（D490），計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1受試物對(duì)小鼠體重和臟器/體重比值的影響

受試物各劑量組的小鼠每期體重、體重增重、胸腺/體重及脾臟/體重比值與陰性對(duì)照組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1），提示受試物對(duì)小鼠的體重增長和免疫器官重量無明顯影響。

2.2受試物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的影響

小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力實(shí)驗(yàn)中受試物各劑量組的增殖能力[D（λ）差值]高于陰性對(duì)照組，其中中劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中受試物各劑量組的左右耳片重量差值高于陰性對(duì)照組，其中高、中劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3受試物對(duì)小鼠體液免疫的影響

抗體生成細(xì)胞數(shù)檢測(cè)中受試物各劑量組的溶血空斑數(shù)均高于陰性對(duì)照組，其中高、中劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。血清溶血素水平檢測(cè)中受試物各劑量組的溶血素抗體積數(shù)高于陰性對(duì)照組，其中高、中劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3），提示體液免疫試驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.4受試物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中受試物各劑量組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均高于陰性對(duì)照組，其中高劑量組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)中受試物各劑量組的碳廓清吞噬指數(shù)高于陰性對(duì)照組，其中中、低劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4）。

2.5受試物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

受試物各劑量組的NK細(xì)胞活性高于陰性對(duì)照組，在經(jīng)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)后的統(tǒng)計(jì)比較中，高、中劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表5）。

3討論

研究結(jié)果表明，林蛙油營養(yǎng)成分中包含粗蛋白（>50%）、脂肪酸、核酸、且富含多種維生素、微量元素及氨基酸。生物活性成分包括三碘甲狀腺原氮酸、甲狀腺素、促絨毛膜性腺激素、雌二醇、孕酮、睪酮等等[10-12]。睪酮和雌二醇分別是雄性激素和雌性激素中生理作用最強(qiáng)的激素，具有顯著的調(diào)節(jié)機(jī)體作用和滋陰強(qiáng)腎激發(fā)免疫功能。林蛙油含豐富的氨基酸和蛋白質(zhì)，且含有礦物質(zhì)和大量的維生素，是一種廣譜免疫調(diào)節(jié)劑和增效劑，可以提高T細(xì)胞和吞噬細(xì)胞活性[8]。

謝程等[13]研究了免疫功能低下和增強(qiáng)小鼠免疫器官均萎縮，在免疫過度增強(qiáng)時(shí)，免疫器官也受到一定損傷。本實(shí)驗(yàn)研究中，受試物劑量組的小鼠臟器/體重比值未出現(xiàn)差異，提示林蛙油對(duì)正常小鼠免疫器官重量無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)研究中，667 mg/（kg·BW）劑量組能明顯促進(jìn)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖（P<0.05）及1334、667 mg/（kg·BW）劑量組明顯促進(jìn)了小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（P<0.05），顯示提高了T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，與顧紅纓等[7]報(bào)道的結(jié)果一致。林蛙油能明顯增加外周血T淋巴細(xì)胞的酯酶染色率，能提高特異性細(xì)胞免疫功能[14]；提高小鼠的血清溶血素水平和分泌抗體的抗體生成細(xì)胞數(shù)，從而提高B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫[15]。本實(shí)驗(yàn)研究還對(duì)單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞活性等方面進(jìn)行了探討，結(jié)果提示林蛙油具有增強(qiáng)免疫力的功能。林蛙油中含有一定量的激素以及生物效應(yīng)的多樣性，對(duì)于林蛙油的安全性、功效和分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

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（收稿日期：2016-11-16 本文編輯：方菊花）